紫蘇葉多糖的雙酶法提取工藝及其抗氧化活性研究

郎伍營(yíng)，張佳怡，趙永平

（1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000；2.商洛學(xué)院 電子信息與電氣工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

紫蘇（Perilla frutescns L.）分布廣泛，尤其在中國(guó)、日本、韓國(guó)等東亞國(guó)家[1]，作為一種常用于魚(yú)和螃蟹烹飪的香料，在中國(guó)已有2 000多年的解毒歷史[2]。紫蘇被列入我國(guó)首批“藥食同源”植物，在日常生活和社會(huì)生產(chǎn)等方面應(yīng)用潛力巨大。紫蘇葉在中醫(yī)治療感冒、咳嗽、惡心、嘔吐、腹痛、便秘、哮喘和食物中毒等方面也有重要作用[3]。近年來(lái)，人們對(duì)紫蘇提取物的抗炎[4]、抗氧化[5]、抗菌[6]等生物功能活性的研究備受關(guān)注。多糖是紫蘇葉主要的生物活性成分之一，且具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒及抗癌、降血糖、抗氧化等許多方面的生物活性，但是國(guó)內(nèi)外對(duì)紫蘇葉多糖提取工藝及其理化特性的研究還有待深入[7]。目前紫蘇葉多糖提取的方法有微波提取法、超聲波提取法等[8-9]，但超聲波輔助提取法的缺點(diǎn)是：對(duì)容器的要求較高，要能承受住超聲波的震動(dòng)；產(chǎn)生的噪音很大，且無(wú)法避免；一般不需要加熱，但由于其本身存在較強(qiáng)的熱效應(yīng)，所以必須對(duì)溫度進(jìn)行控制。微波輔助提取法的缺點(diǎn)是：所選用的原料必須具備熱穩(wěn)定性，如果不具備熱穩(wěn)定性，在微波加熱過(guò)程中生物活性物質(zhì)容易失活或者變性；原料還要具備良好的吸水性，反之在微波加熱過(guò)程中不能獲得足夠的微波來(lái)?yè)羝谱陨斫M織，無(wú)法提取到組織內(nèi)生物活性物質(zhì)。此外，由于在提取過(guò)程中需要用到高溫，會(huì)使細(xì)胞破裂，將一些雜質(zhì)溶于所提溶劑中，降低提取效率。目前以雙酶法提取紫蘇葉多糖的工藝未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，本研究對(duì)紫蘇葉采用雙酶法提取多糖，通過(guò)正交試驗(yàn)法對(duì)紫蘇葉多糖的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化，并研究紫蘇葉多糖的抗氧化活性，為紫蘇葉產(chǎn)品的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮紫蘇葉來(lái)源于陜西金亨祥食品科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇葉多糖的提取

將紫蘇葉放于烘箱中80℃烘至恒重，用中藥粉碎機(jī)打碎，過(guò)80目篩得到紫蘇葉粉末。準(zhǔn)確稱取紫蘇葉粉末5.000 g，放入燒杯中，以粉末和液體比1：15加水，然后加入一定量的纖維素酶和果膠酶，在pH 5.0條件下進(jìn)行酶水解，在50℃的水浴鍋中提取120 min，再將水浴鍋升溫至90℃保持30 min滅酶，冷卻后以4 000 r/min離心15 min，取上清液并記錄體積，將上清液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃進(jìn)行濃縮，濃縮至原溶液體積的1/4時(shí)，即可得到濃縮液，再加入4倍體積的無(wú)水乙醇，放置于4℃下過(guò)夜，然后以4 000 r/min離心30 min，取沉淀，用丙酮和無(wú)水乙醇反復(fù)將其洗滌多次，真空干燥即可得到紫蘇葉粗多糖。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

分別設(shè)置1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的纖維素酶添加量；0.1%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的果膠酶添加量；60，80，100，120，140 min 的酶解時(shí)間；40，45，50，55，60 ℃的酶解溫度，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.3 紫蘇葉多糖含量的測(cè)定

根據(jù)張學(xué)新等[10]的方法稍作修改，得到葡萄糖濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.014 6x+0.006 9，R2=0.999 8。紫蘇葉多糖提取率的計(jì)算公式：

式(1)中，c1為紫蘇多糖濃度（μg/mL），V 為 100 mL，m1為測(cè)定吸光度時(shí)所用粗多糖質(zhì)量（g），m2為粗多糖總質(zhì)量（g）。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，影響因素選擇纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時(shí)間和酶解溫度，考察指標(biāo)是紫蘇葉多糖提取率，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，探究各因素對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.5 紫蘇葉多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

1）DPPH清除率的測(cè)定

將1.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液和3.0 mL待測(cè)紫蘇葉多糖樣品溶液，混合均勻，室溫避光靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度，每組設(shè)置3次重復(fù)?？箟难釣閷?duì)照組，計(jì)算待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除率：

式(2)中，A0為蒸餾水3.0 mL和DPPH 1.0 mL混合液的吸光度值，A1為DPPH 1.0 mL和樣品溶液3.0 mL的吸光度值，A2為無(wú)水乙醇1.0 mL和樣品溶液3.0 mL的吸光度值。

2）羥基自由基清除率的測(cè)定

取濃度相同的FeSO4溶液和水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L）各 0.5 mL，添加到含有 1.0 mL待測(cè)紫蘇葉多糖溶液的試管中混勻，然后再加入8.8 mmol/L H2O20.5 mL，37 ℃放置 30 min，期間每隔10 min晃動(dòng)數(shù)次，使其反應(yīng)完全，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，每組設(shè)置3次重復(fù)，抗壞血酸為對(duì)照組，計(jì)算羥基自由基清除率：

式(3)中，A1為二價(jià)鐵離子、水楊酸-乙醇、過(guò)氧化氫和待測(cè)紫蘇葉多糖混合液的吸光度值，A2為蒸餾水、水楊酸-乙醇、過(guò)氧化氫和待測(cè)紫蘇葉多糖混合液的吸光度值，A3為二價(jià)鐵離子、水楊酸-乙醇、過(guò)氧化氫和蒸餾水混合液的吸光度值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8軟件繪圖，IBM SPSS Statistics 26軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶添加量對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響

當(dāng)果膠酶添加量為0.5%，酶解時(shí)間為120 min，酶解溫度為50℃時(shí)，研究紫蘇葉多糖提取率與纖維素酶添加量之間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，紫蘇葉多糖的提取率隨著纖維素酶添加量的增加呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)纖維素酶添加量為紫蘇葉質(zhì)量的2.5%時(shí)，紫蘇葉多糖提取率最高。當(dāng)纖維素酶添加量超過(guò)2.5%時(shí)，紫蘇葉多糖提取率降低，可能是因?yàn)檫^(guò)多的酶量使底物被完全反應(yīng)，多余未參加反應(yīng)的酶不能再催化底物進(jìn)行反應(yīng)。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響

2.2 果膠酶添加量對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響

當(dāng)纖維素酶添加量為2.5%，酶解時(shí)間為120 min，酶解溫度為50℃時(shí)，研究紫蘇葉多糖提取率和果膠酶添加量之間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，紫蘇葉多糖提取率隨著果膠酶添加量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)果膠酶添加量為紫蘇葉質(zhì)量的0.5%時(shí)，紫蘇葉多糖提取率最高。當(dāng)果膠酶添加量超過(guò)0.5%后紫蘇葉多糖提取率降低，其原因可能與纖維素酶添加量結(jié)果一致。

圖2 果膠酶添加量對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響

2.3 酶解時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響

當(dāng)纖維素酶添加量為2.5%，果膠酶添加量為0.5%，酶解溫度為50℃時(shí)，研究紫蘇葉多糖提取率與酶解時(shí)間之間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，當(dāng)酶解時(shí)間為120 min時(shí)紫蘇葉多糖提取率最高。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)120 min后，可能是由于反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致酶失活，不能再催化底物進(jìn)行反應(yīng)，降低了紫蘇葉多糖提取率。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響

2.4 酶解溫度對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響

當(dāng)纖維素酶添加量為2.5%，果膠酶添加量為0.5%，酶解時(shí)間為120 min時(shí)，研究紫蘇葉多糖提取率和酶解溫度之間的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，紫蘇葉多糖提取率在酶解溫度為50℃時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，紫蘇葉多糖提取率逐漸降低，原因可能是溫度超過(guò)50℃之后，使得部分纖維素酶和果膠酶失去生物活性，不能再與底物進(jìn)行充分反應(yīng)。

圖4 酶解溫度對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響

2.5 紫蘇葉多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

按照表1的正交因素水平設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，紫蘇葉多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，紫蘇葉多糖提取的正交結(jié)果的極差分析見(jiàn)表3，紫蘇葉多糖提取的正交結(jié)果的方差分析見(jiàn)表4。

表2 紫蘇葉多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 紫蘇葉多糖提取的正交結(jié)果的極差分析

表4 紫蘇葉多糖提取的正交結(jié)果的方差分析

由表3可知，影響紫蘇葉多糖提取率的因素從大到小依次為酶解時(shí)間（C）、果膠酶添加量（B）、纖維素酶添加量（A）、酶解溫度（D）。由表4可知，酶解時(shí)間、果膠酶添加量、纖維素酶添加量3個(gè)因素對(duì)紫蘇葉多糖提取率的影響均顯著，結(jié)合極差分析結(jié)果，確定紫蘇葉多糖最優(yōu)提取工藝為A3B3C1D2，即纖維素酶添加量為2.5%、果膠酶添加量為2.5%、酶解時(shí)間為60 min、酶解溫度為50℃，在此條件下，紫蘇葉多糖提取率最大，為3.01%。

2.6 驗(yàn)證性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果是否準(zhǔn)確和可行，按紫蘇葉多糖最佳提取工藝條件進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。3次重復(fù)試驗(yàn)所得結(jié)果基本一致，結(jié)果如表5所示，紫蘇葉多糖的平均提取率為3.01%。表明本研究篩選的提取工藝合理可行，穩(wěn)定性好。

表5 紫蘇葉多糖提取的正交結(jié)果的驗(yàn)證

2.7 紫蘇葉多糖的抗氧化活性

2.7.1 紫蘇葉多糖清除DPPH自由基的能力

紫蘇葉多糖溶液對(duì)DPPH自由基的清除能力，如圖5所示。由圖5可知，紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度為0～0.1 mg/mL時(shí)，紫蘇葉多糖對(duì)DPPH的清除率隨著紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。當(dāng)紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，其自由基清除率為91.7%。當(dāng)紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度高于0.1 mg/mL時(shí)，紫蘇葉多糖對(duì)DPPH自由基清除率趨于穩(wěn)定。

圖5 紫蘇葉多糖清除DPPH自由基的能力

2.7.2 紫蘇葉多糖清除羥基自由基的能力

紫蘇葉多糖溶液對(duì)羥基自由基的清除能力如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)濃度為0.1～0.2 mg/mL時(shí)，紫蘇葉多糖對(duì)羥基自由基的清除能力隨著濃度的增加逐漸增強(qiáng)。當(dāng)超過(guò)0.2 mg/mL時(shí)，紫蘇葉多糖清除羥基自由基的能力逐漸趨于恒定，整體結(jié)果表明，紫蘇葉多糖溶液對(duì)羥基自由基的清除能力高于同質(zhì)量濃度下抗壞血酸的清除能力。

圖6 紫蘇葉多糖清除羥基自由基的能力

3 討論與結(jié)論

本研究采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了雙酶法提取紫蘇葉多糖的工藝條件。在纖維素酶添加量為2.5%、果膠酶添加量為2.5%、酶解時(shí)間為60 min、酶解溫度為50℃時(shí)，紫蘇葉多糖提取的工藝條件最優(yōu)，所得紫蘇葉多糖提取率最大，可達(dá)到3.01%。紫蘇葉多糖提取工藝的研究較多，但提取工藝條件各不相同。李沖偉等[11]采用微波輔助法提取紫蘇葉多糖，當(dāng)料液比為 1：25（g：mL），微波提取功率為480 W、微波輔助提取時(shí)間為3 min時(shí)，紫蘇葉多糖的提取率為9.06%。丁素蕓等[7]采用熱提法提取紫蘇葉多糖，最佳提取工藝條件是料液比為 1：30（g：mL）、提取時(shí)間為4 h、醇沉濃度為60%時(shí)，紫蘇葉多糖得率達(dá)到（5.22±0.17）%。梁樂(lè)欣等[9]運(yùn)用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取紫蘇葉多糖，當(dāng)酶解時(shí)間為40 min、酶解溫度為20.4℃、加酶量為2 000 U/g、超聲時(shí)間為60 min時(shí)，紫蘇葉多糖的提取率最高為4.54%。張麗紅等[8]采用微波技術(shù)輔助提取紫蘇葉多糖，當(dāng)裝載量為10 mL、微波時(shí)間為30 s、微波功率為800 W時(shí)，紫蘇葉多糖提取率為3.99%。文獻(xiàn)[7-9，11]的研究結(jié)果均高于本研究結(jié)果，其原因可能與紫蘇葉多糖提取方法及紫蘇的產(chǎn)地有關(guān)，還需深入探討。

本研究還發(fā)現(xiàn)，紫蘇葉多糖對(duì)DPPH有一定的清除能力，當(dāng)紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，其自由基清除率為91.7%，紫蘇葉多糖對(duì)羥基自由基的清除能力高于同質(zhì)量濃度下抗壞血酸清除羥基自由基的能力，表明所提取的紫蘇葉多糖具有一定的抗氧化活性。牛新茹等[12]采用水提醇沉法提取紫蘇葉多糖，并對(duì)所提取的紫蘇葉多糖進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè)，結(jié)果顯示，當(dāng)紫蘇葉多糖濃度小于1.00 mg/mL時(shí)，紫蘇葉多糖對(duì)DPPH清除能力隨著紫蘇葉多糖濃度的增加而增加，直到當(dāng)紫蘇葉多糖濃度為0.25 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到84.69%，與抗壞血酸清除能力相當(dāng)。梁樂(lè)欣等[9]采用超聲波協(xié)同纖維素酶提取紫蘇葉多糖，并研究所提紫蘇葉多糖的抗氧化活性，當(dāng)紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度為0～0.1 mg/mL時(shí)，紫蘇葉多糖對(duì)DPPH清除能力呈線性增長(zhǎng)。當(dāng)紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時(shí)，其清除率達(dá)到94.17%。紫蘇葉多糖對(duì)羥基自由基的清除能力隨著紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，并且當(dāng)紫蘇葉多糖質(zhì)量濃度大于0.2 mg/mL時(shí)，紫蘇葉多糖對(duì)DPPH和羥基自由基的清除能力都略高于同質(zhì)量濃度下抗壞血酸的清除能力。文獻(xiàn)[12]采用水提醇沉法提取紫蘇葉多糖，同質(zhì)量濃度下紫蘇葉多糖的抗氧化活性低于本研究結(jié)果，而文獻(xiàn)[9]通過(guò)超聲波協(xié)同纖維素酶提取紫蘇葉多糖，同質(zhì)量濃度下紫蘇葉多糖的抗氧化活性與本研究結(jié)果基本一致。其可能原因是提取工藝中有酶的參與，利用酶的高效選擇性，促進(jìn)紫蘇葉中多糖溶液的浸出，獲得的多糖產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，活性高。