銀杏葉提取物對TGF-β1誘導(dǎo)增殖的SD乳鼠心肌成纖維細(xì)胞生長抑制作用及其機(jī)制

胡方芳，易鮫隆，王順，成榮，李偉，羅振華

1 貴州省人民醫(yī)院，貴州貴陽550001；2 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

心肌纖維化（MF）是各種因素如高血壓、冠心病、心肌病等所致心肌細(xì)胞缺血、缺氧及壞死，心肌成纖維細(xì)胞（CFb）異常增殖，胞外基質(zhì)沉積的重塑過程，MF可導(dǎo)致心肌的硬度增加、順應(yīng)性降低、舒縮功能下降，是慢性心力衰竭、心源性猝死的影響因素之一［1］。同時，MF 還會使心電信號傳導(dǎo)受阻，誘發(fā)心律失常。因此，研究具有改善MF 病變功能的藥物對于改善心臟功能及預(yù)防慢性心力衰竭的發(fā)生具有重要意義。TGF-β1-samd/TAK1 信號通路是MF的關(guān)鍵信號通路［2-4］，其可通過MMP/TIMP 調(diào)節(jié)膠原蛋白的降解。另一方面，TGF-β1-samd/TAK1 信號通路還可以通過結(jié)締組織生長因子（CTGF）和相關(guān)microRNA 調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成。銀杏葉提取物（GBE）是以銀杏葉為原料，通過加工提取得到的有效成分。研究［5］發(fā)現(xiàn)，GBE 有清除自由基、抗氧化、改善血液流變學(xué)、抗血小板聚集和防治動脈粥樣硬化等作用。同時研究［6］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)GBE 治療后Ⅰ型糖尿病模型大鼠的心室心肌內(nèi)血糖、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原、TGF-β1 的表達(dá)水平均明顯降低，推測GBE 可通過下調(diào)TGF-β1基因表達(dá)，減少Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原的合成，進(jìn)而抑制Ⅰ型糖尿病心肌病大鼠MF，改善心臟功能。2018 年 1 月—2019 年 6 月，我們觀察了GBE對TGF-β1誘導(dǎo)增殖的SD乳鼠CFb的生長抑制作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物、GBE、試劑及儀器 清潔級雄性SD 大鼠，210～260 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)清潔級實驗動物房。培養(yǎng)環(huán)境溫度、濕度均恒定。SD 雌鼠與雄鼠按照3∶1 的比例共圈飼養(yǎng)，取出生1～3 d的SD乳鼠作為實驗用鼠。GBE 由中國藥品生物制品鑒定所提供，其成分及含量符合國家藥品純度標(biāo)準(zhǔn)。Anti-Vimentin anti?body 購自美國 Proteintech 公司，Anti-Actin antibody、ALK5抑制劑SB-431542購自美國ImmunoWay公司，TGF-β1 購自美國 Pepro tech 公司，通用型二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司。CX23 光學(xué)顯微鏡、IX71 倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS 公司，CFX Connect QPCR 儀、凝膠成像儀購自美國BioRAD 公司，核酸分析儀購自Thermo公司。

1.2 CFb 細(xì)胞提取、分組及GBE 給予 取出生1～3 d 的SD 乳鼠心臟［7］進(jìn)行原代細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)，取2～3 代生長密度達(dá)到80%融合的CFb 分為 4 組，其中 TGF-β1 組加入 20 ng/mL 的 TGF-β1 溶液，低濃度 GBE 組加入 20 ng/mL 的 TGF-β1 溶液和2 μg/mL的GBE溶液，高濃度GBE組加入20 ng/mL的TGF-β1 溶液和 20 μg/mL 的 GBE 溶液，對照組加入等量含10%胎牛血清的DMEM。

1.3 各組細(xì)胞增殖率測算 采用MTT 比色法。取各組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入濃度為5 mg/mL 的MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈上清液，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測定各孔波長為490 nm 處的光密度值（OD 值），計算各組細(xì)胞增殖率。各組細(xì)胞增殖率=各組OD 值/對照組OD值×100%。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4 各組細(xì)胞結(jié)締組織生長因子（CTGF）、氨基末端激酶（JNK）、P38 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法。取各組細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，TRIzol 法提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以 cDNA 為模板、以 β-Actin 為內(nèi)參進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 30 s，95 ℃變性 30 s，60 ℃退火 5 s，40 個循環(huán)。引物序列如下：JNK 上游引物為5′-AA?CAGCTCGGAACACCTTGT-3′，下游引物為5′-GAT?GTACGGGTGCTGGAGAG-3′；CTGF 上游引物為 5′-AATGCTGT TGAGGAGTGGGTG-3′，下游引物為5′-ACAGGTCTTAGAACAGCCGC-3′；P38 上游引物為5′-ACCTAAAGCCCAGCAACCTC-3′，下游引物為5′-AGCCCACGGACCAAATATCC-3′。以2-ΔCt表示細(xì)胞中目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，各實驗組間結(jié)果均數(shù)比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖率比較 TGF-β1 組、低濃度GBE 組、高濃度GBE 組、對照組細(xì)胞增殖率分別為124.1% ± 13.4%、106.1% ± 7.5%、83.5% ± 5.2%、100.0%，其中TGF-β1組與對照組、高濃度GBE組相比，P均＜0.05。

2.2 各組細(xì)胞CTGF、JNK、P38 mRNA 相對表達(dá)量比較 各組細(xì)胞CTGF、JNK、P38 mRNA相對表達(dá)量比較見表1。

3 討論

急性心肌梗死（AMI）嚴(yán)重威脅人類健康，介入治療和藥物溶栓的應(yīng)用極大降低了急性心肌梗死患者的死亡率，但其后期形成的心肌重塑可導(dǎo)致充血性心力衰竭、致死性心律失常等惡性轉(zhuǎn)歸，是造成惡性心律失常和猝死的主要病理原因，因此延緩或逆轉(zhuǎn)心肌纖維化是防治心肌梗死后心肌重塑的關(guān)鍵。

表1 各組細(xì)胞CTGF、JNK、P38 mRNA相對表達(dá)量比較（）

表1 各組細(xì)胞CTGF、JNK、P38 mRNA相對表達(dá)量比較（）

注：與對照組相比，▲P＜0.05；與TGF-β1組相比，△P＜0.01。

組別TGF-β1組低濃度GBE組高濃度GBE組對照組P38 mRNA 1.40±0.04▲0.61± 0.23▲△0.63± 0.24▲△1.00±0.00 CTGF mRNA 1.42±0.08▲0.76±0.03 0.64± 0.06▲△1.00±0.02 JNK mRNA 1.28±0.07▲0.51±0.09 0.37±0.14▲△1.00±0.10

GBE 為傳統(tǒng)中藥銀杏葉的主要效應(yīng)活性物質(zhì)，含有200 多種藥用成分，主要活性成分是銀杏黃酮和銀杏內(nèi)酯類化合物［8-9］。GBE 在降血脂、張擴(kuò)血管、抗炎、抗過敏、清除自由基、保護(hù)心腦血管、降低血清膽固醇等方面發(fā)揮藥效［10］，在改善心力衰竭、減輕腦梗死面積、營養(yǎng)糖尿病周圍神經(jīng)病變、降低肺動脈高壓及肺纖維化等多種疾病治療中起到廣泛作用。研究［11-13］發(fā)現(xiàn)，GBE 能夠?qū)?AMI 繼發(fā)心肌重塑具有顯著的保護(hù)作用，并能夠改善CFb 病變對繼發(fā)心肌重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)病變相關(guān)蛋白以及膠原蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生影響，同時GBE 的活性與其對TGF-β1-samd/TAK1 信號通路的調(diào)控有關(guān)。TGF-β1 導(dǎo)致心臟纖維化的相關(guān)實驗研究主要局限在TGF-β1-samd/TAK1 細(xì)胞上游信號通路，但對下游信號通路具體調(diào)控MF 的分子作用機(jī)制仍然研究得較少，與劑量是否有關(guān)目前也尚未報道。

在組織纖維化過程中，TGF-β1-samd/TAK1 細(xì)胞信號通路是已知最重要的通路之一。samd 作為信號通路的上游信號蛋白因子，在被TGF-β1 激活后，活化CTGF、P38-MAPK、JNK-MAPK 下游信號通路，從而引起乳鼠炎癥因子增加、心臟肥厚、間質(zhì)纖維化、嚴(yán)重的心功能不全、心肌凋亡甚至死亡。CT?GF 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的致纖維化的因子，為TGF-β1 的下游效應(yīng)因子，CTGF 可接受多種細(xì)胞因子刺激［14-16］，如RAS 系統(tǒng)、氧化應(yīng)激、炎性因子等，其中TGF-β1是MF的重要刺激因子，TGF-β1能夠刺激CTGF 表達(dá)上調(diào)，同時 CTGF 與 TGF-β1 結(jié)合后，能刺激samd 磷酸化，啟動MF 過程，因此二者相互促進(jìn)，共同參與促纖維化效應(yīng)，CTGF 與TGF-β1 一同作用導(dǎo)致哺乳動物多數(shù)臟器如腎、肺、心臟等發(fā)生纖維化［17］。JNK 是 TGF-β1-samd/TAK1 通路下游信號因子，當(dāng)JNK 被激活后，磷酸化Samd 2/3 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，形成Samd 2/3、Samd 4、CBP、TF 復(fù)合物，介導(dǎo)Ⅰ型和Ⅲ膠原蛋白表達(dá)。同時，JNK 還可通過Rac1/MLK3/JNK/AP-1 通路介導(dǎo)Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。在AMI 體外模型中，加入JNK 抑制劑可顯著減少心肌細(xì)胞的凋亡［18］。研究［19］表明，JNK 被激活可引起小鼠炎癥因子增加、心肌細(xì)胞肥大、基質(zhì)增生、心肌細(xì)胞死亡。CTGF 和JNK 間存在復(fù)雜的通路聯(lián)系，UTSUGI 等［20］在肺纖維化病理機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1-samd/TAK1 信號通路在激活 CTGF 時，JNK在介導(dǎo)CTGF 表達(dá)升高起到重要作用。P38-MAPK作為samd 下游的信號分子，是MAPK 信號通路的主要成員，參與了心肌組織纖維化的發(fā)生發(fā)展，在誘發(fā)纖維化過程發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，在TGF-β1 的信號傳遞過程中，對P38 基因的表達(dá)干預(yù)將會下調(diào)TGF-β1的活性，對組織纖維化的過程起到延緩作用。以上研究表明，抑制TGF-β1-samd/TAK1及下游信號因子通路可能成為降低AMI后大鼠MF 的新靶點。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1 組CTGF、JNK 及P38 mRNA 表達(dá)顯著增加，經(jīng) GBE 治療后三者均降低，且高劑量組減低明顯，認(rèn)為可能與GBE 的劑量有關(guān)，提示GBE 可能通過抑制TGF-β1-samd/TAK1下游信號通路活化，進(jìn)而抑制CFb增殖，達(dá)到延緩心肌纖維化的作用。

綜上所述，對于 TGF-β1 誘導(dǎo)增殖的 CFb，GBE對其增殖具有明顯的生長抑制作用，且可能的機(jī)制是通過下調(diào)TGF-β1-samd/TAK1 信號通路中CTGF、JNK、P38 基因的表達(dá)。因此，提示GBE 對心肌纖維化的發(fā)展起到延緩作用。