非布索坦灌胃對百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺損傷改善作用及其機(jī)制

何鋼，張力，王天軼

解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)980醫(yī)院/白求恩國際和平醫(yī)院，河北石家莊050000

百草枯是一種快速有效的除草劑，廣泛用于雜草的控制。然而，由于自殺或者意外接觸百草枯后，百草枯導(dǎo)致的人類中毒和死亡的發(fā)生率越來越高。百草枯進(jìn)入人體后主要積聚在肺組織中，通過氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引發(fā)肺泡炎、水腫、炎性細(xì)胞浸潤和膠原沉積等肺損傷，并最終導(dǎo)致呼吸衰竭和肺纖維化［1-3］。百草枯在生物轉(zhuǎn)化過程中不僅產(chǎn)生超氧化物自由基，而且還誘導(dǎo)黃嘌呤氧化酶活性（XO）發(fā)生變化，催化黃嘌呤和次黃嘌呤在肺組織中轉(zhuǎn)化為尿酸和超氧自由基［4］，尿酸能增強(qiáng)晚期糖基化終產(chǎn)物（RAGE）受體的表達(dá)，而超氧自由基則會產(chǎn)生過度的細(xì)胞氧化應(yīng)激，導(dǎo)致抗氧化劑的消耗、脂質(zhì)過氧化和組織損傷壞死［5］。盡管已有研究報道一些抗氧化劑和抗炎藥對百草枯所致肺損傷的保護(hù)作用，但至今還沒有一種有效的抗百草枯毒性的解毒劑。非布索坦是一種有效的選擇性XO 抑制劑，用于治療痛風(fēng)，同時也具有抗氧化和抗炎作用［7］。相關(guān)研究［6］報道，雷帕霉素通過抑制NF-κB p65活性和刺激Nrf2 信號通路來改善百草枯所致肺毒性。但尚未有非布索坦對于百草枯致大鼠肺毒性改善作用的報道。2019 年 11 月 5 日—2020 年 10 月 29 日，本研究觀察了非布索坦灌胃對百草枯誘導(dǎo)大鼠肺損傷的改善作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 非布索坦、大鼠、試劑及儀器 非布索坦購自武漢博士德生物工程有限公司。清潔級的Wistar成年雄性大鼠21 只，體質(zhì)量（183 ± 16）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號為SCXK（京）2020-1008。百草枯購自英國捷利康有限公司，PI3K、Akt 和β-catenin 兔抗鼠多克隆抗體購自美國CST 公司，RNA 提取試劑購自美國Promega 公司，LDH、XO、SOD、TAC、MDA、羥脯氨酸比色試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司，大鼠sRAGE、MMP-9、IL-8 和VEGF 特異性單克隆抗體購自南京建成生物工程研究所，動物實(shí)驗(yàn)器械購自上海醫(yī)用精密儀器廠，AP310電子天平購自北京市醫(yī)療設(shè)備廠，高速低溫離心機(jī)購自德國賀利氏公司。

1.2 動物分組、百草枯灌胃及非布索坦給予方法21 只大鼠隨機(jī)分為3 組，每組7 只，分別為對照組、百草枯組、百草枯+非布索坦組。百草枯組和百草枯+非布索坦組給予50 mg/kg 百草枯1 mL 一次性灌胃染毒。百草枯+非布索坦組在染毒24 h 后，每天5 mg/kg 非布索坦灌胃治療，連續(xù)灌胃14 d；對照組、百草枯組每天灌胃等體積生理鹽水。各組大鼠灌胃14 d 后處死，立即分離肺組織和心臟。心臟取血，3 000 r/min 離心30 min，分離血清后?70 ℃冰箱中保存。

1.3 各組大鼠肺組織病理觀察 采用蘇木素-伊紅（HE）染色法。將肺組織脫水、透明、浸蠟、包埋，然后切成5 μm 切片，放入水箱中展片，待組織充分舒展后，用載玻片取出肺組織，進(jìn)行HE 染色處理，常規(guī)脫蠟，鹽酸乙醇分化，蘇木精染色5 min，1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍(lán)，0.5%伊紅染色5 min，用水沖洗，隨后70%、80%、90%、95%、100%梯度乙醇脫色，二甲苯透明，然后樹膠封片，光鏡下觀察肺組織病理變化。

1.4 各組大鼠肺毒性標(biāo)志物血清乳酸脫氫酶（LDH）、可溶性糖基化終產(chǎn)物受體（sRAGE）檢測①采用比色法檢測血清LDH。取血清樣品，使用LDH 活性檢測試劑盒檢測LDH。②采用ELISA 法檢測血清sRAGE。取血清樣品，嚴(yán)格按ELISA 試劑盒說明進(jìn)行操作，將大鼠sRAGE 特異性單克隆抗體預(yù)涂于微板上，將標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本移入孔中，并固定抗體結(jié)合sRAGE，向孔中加入底物溶液，然后用酶標(biāo)儀測量sRAGE。

1.5 各組大鼠肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物黃嘌呤氧化酶（XO）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAC）、丙二醛（MDA）、羥脯氨酸檢測 采用比色法。取血清樣品，常溫靜置30 min，3 000 r/min 離心20 min，分離血清放于EP 管中，采用比色法檢測XO、SOD、TAC、MDA、羥脯氨酸。

1.6 各組大鼠肺組織中PI3K、Akt、β-catenin、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、白介素-8（IL-8）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）檢測 ①采用Western blotting 法檢測大鼠肺組織中PI3K、Akt、β-catenin 蛋白。取肺組織樣品，離心分離勻漿，收集上清液，并根據(jù)BCA蛋白檢測試劑盒測定總蛋白濃度，蛋白質(zhì)樣品在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在封閉液中孵育1 h，然后用TBST 沖洗10 min，分別加入相應(yīng)一抗，在4 ℃下孵育過夜，TBST 洗膜后，與辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG 抗體在室溫下1∶25 000稀釋孵育1 h，ECL發(fā)光，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J 軟件分析目的蛋白相對表達(dá)量。②采用雙抗體夾心ELISA 法檢測大鼠肺組織中MMP-9、IL-8、VEGF。取血清樣品，所有操作嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明進(jìn)行，將大鼠MMP-9、IL-8 和VEGF 特異性單克隆抗體預(yù)涂于微板上，將標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本移入孔中，并固定抗體結(jié)合MMP-9、IL-8 和VEGF，向孔中加入底物溶液，然后用酶標(biāo)儀測量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graph Pad Prism V7.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織變化 各組大鼠肺組織變化見圖1。由圖1 可見，對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，無上皮損傷；百草枯組大鼠肺組織呈現(xiàn)出嚴(yán)重的多元化惡化情況，出現(xiàn)重度纖維組織增生、混合炎性細(xì)胞浸潤和肺水腫情況；百草枯+非布索坦組大鼠肺組織中呈現(xiàn)中度纖維組織增生和炎性細(xì)胞浸潤情況。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（×100）

2.2 各組大鼠肺毒性標(biāo)志物血清LDH、sRAGE水平比較 各組大鼠肺毒性標(biāo)志物血清LDH、sRAGE 水平比較見表1。由表1可知，與對照組相比，百草枯組血清LDH水平顯著升高、sRAGE水平顯著降低（P均＜0.05）；與百草枯組相比，百草枯+非布索坦組LDH水平顯著降低、sRAGE水平顯著升高（P均＜0.05）。

表1 各組大鼠肺毒性標(biāo)志物血清LDH、sRAGE水平比較（>）

表1 各組大鼠肺毒性標(biāo)志物血清LDH、sRAGE水平比較（>）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與百草枯組相比，#P＜0.05。

組別對照組百草枯組百草枯+非布索坦組sRAGE（ng/mL）28.36±4.93 13.37±2.19*22.76±4.05#n 7 7 7 LDH（U/mL）179.57±11.29 591.74±86.57*227.81±26.73#

2.3 各組大鼠肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物XO、SOD、TAC、MDA、羥脯氨酸水平比較 各組大鼠肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物XO、SOD、TAC、MDA、羥脯氨酸水平比較見表2。由表2 可知，與對照組相比，百草枯組XO、MDA、羥脯氨酸水平均顯著升高（P均＜0.05），SOD、TAC 水平均顯著降低（P均＜0.05）；與百草枯組相比，百草枯+ 非布索坦組XO、MDA、羥脯氨酸水平均顯著降低（P均＜0.05），SOD、TAC 水平均顯著升高（P均＜0.05）。

2.4 各組大鼠肺組織中 PI3K、Akt、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量和MMP-9、IL-8、VEGF 水平比較 各組大鼠肺組織中PI3K、Akt、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量和 MMP-9、IL-8、VEGF 水平比較見表 3。由表3 可知，與對照組相比，百草枯組大鼠肺組織中PI3K、Akt、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量和 MMP-9、IL-8、VEGF 水平均顯著升高（P均＜0.05）；與百草枯組相比，百草枯+ 非布索坦組大鼠肺組織中PI3K、Akt、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量和 MMP-9、IL-8、VEGF 水平均顯著降低（P均＜0.05）。

表2 各組大鼠肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物XO、SOD、TAC、MDA、羥脯氨酸水平比較（）

表2 各組大鼠肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物XO、SOD、TAC、MDA、羥脯氨酸水平比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與百草枯組相比，#P＜0.05。

組別對照組百草枯組百草枯+非布索坦組羥脯氨酸（ng/mg）22.59±2.73 39.52±4.69*26.32±2.76#n 7 7 7 XO（U/mg）42.36± 4.12 102.18±10.92*65.78± 6.82#SOD（U/mg）2.35±0.27 1.36±0.21*2.62±0.29#TAC（nmol/mg）35.68±3.69 16.47±1.89*29.73±3.32#MDA（nmol/mg）3.89±0.37 12.82±1.41*7.42±0.91#

表3 各組大鼠肺組織中PI3K、Akt、β-catenin蛋白相對表達(dá)量和MMP-9、IL-8、VEGF水平比較（）

表3 各組大鼠肺組織中PI3K、Akt、β-catenin蛋白相對表達(dá)量和MMP-9、IL-8、VEGF水平比較（）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與百草枯組相比，#P＜0.05。

組別對照組百草枯組百草枯+非布索坦組VEGF（ng/mg）63.21± 7.63 125.48±13.93*86.91± 7.85#n 7 7 7 PI3K 0.87±0.13 8.23±4.67*3.19±1.87#Akt 1.03±0.02 8.94±3.96*2.79±0.48#β-catenin 0.92±0.04 10.79±4.17*4.16±1.52#MMP-9（ng/mg）22.36±2.44 52.69±5.73*41.22±3.75#IL-8（ng/mg）57.29± 6.18 122.44±11.26*76.16± 6.29#

3 討論

肺部為百草枯中毒的主要靶器官，也是導(dǎo)致死亡的主要原因［8］。百草枯的肺毒性早期表現(xiàn)為急性肺泡炎性改變，后期表現(xiàn)為不可逆的肺間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡。肺纖維化是百草枯致肺毒性的最終結(jié)局，百草枯能夠增加肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)記物的含量，還能使LDH活性增強(qiáng)和sRAGE水平受到抑制。百草枯對肺毒性類似的作用，此前已有相關(guān)報道［9］。細(xì)胞內(nèi)酶如LDH的滲漏增強(qiáng)及其血清活性的增加被認(rèn)為是暴露于自由基后組織壞死的標(biāo)志［10］。血清中sRAGE 被認(rèn)為是急性肺損傷和肺部炎癥的生物標(biāo)志物［11］。sRAGE 可與循環(huán)促炎分子結(jié)合，從而阻止其與跨膜RAGE結(jié)合和激活，最終抑制RAGE 途徑及其下游炎癥反應(yīng)［12］。本研究中，非布索坦對血清LDH 和sRAGE 的抑制作用可能與非布索坦對百草枯所致肺損傷的改善作用有關(guān)。

百草枯能增加肺組織中氧化應(yīng)激標(biāo)志物的含量，促使 XO 活性增強(qiáng)、SOD 活性降低、TAC 能力降低。百草枯誘導(dǎo)XO 活性的增強(qiáng)可能導(dǎo)致黃嘌呤和氧過度轉(zhuǎn)化為超氧自由基。我們的研究結(jié)果表明，百草枯對SOD 活性有抑制作用，最終導(dǎo)致超氧化物自由基的積累。累積的超氧化物自由基可與肺組織相互作用，增強(qiáng)脂質(zhì)過度氧化，降低TAC 能力，并刺激炎癥細(xì)胞因子的形成。羥基脯氨酸是膠原的主要成分，本研究中羥脯氨酸含量的升高可能是肺纖維化的早期標(biāo)志。非布索坦是一種XO 抑制劑，對百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺組織氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用［13］，主要表現(xiàn)在大鼠血清中LDH 活性降低和氧化還原狀態(tài)的重新平衡。在本研究中，非布索坦抑制XO活性，干擾百草枯誘導(dǎo)的超氧化物自由基累積，從而使SOD 活性正?；?，抑制脂質(zhì)過氧化，提高TAC 能力，這反過來又抑制了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的炎癥和纖維化。

百草枯激活RAGE 可啟動一系列細(xì)胞內(nèi)的信號通路，包括PI3K/Akt 信號通路。Akt 可以通過直接磷酸化或與Wnt 通路交叉激活β-catenin，Akt 激活后，Wnt/β-catenin 信號通路下調(diào)。相關(guān)研究［14］證明，Wnt/β-catenin 信號通路參與了組織損傷后的纖維化組織修復(fù)。因此，我們推測非布索坦在對百草枯誘導(dǎo)的肺部炎癥中的保護(hù)作用可能是通過抑制PI3K/Akt 途徑及其下游分子實(shí)現(xiàn)的。此外，百草枯誘導(dǎo)肺組織MMP-9 含量升高可能與β-catenin 表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。β-catenin是一種靶向金屬蛋白酶表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，MMP-9 是由活化的中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞釋放出來的，能夠消化彈性蛋白、膠原蛋白和其他結(jié)構(gòu)蛋白，從而破壞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺泡毛細(xì)血管通透性增加、滲出、肺泡損傷［15］。MMP-9主要在肺纖維化的早期增加，在肺部炎癥遷移到肺組織中起重要作用，MMP-9 還可促進(jìn)TGF-β 和TNF-α 的釋放，加速肺纖維化［16］。非布索坦對百草枯所致肺損傷的抗炎作用可能部分通過抑制百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而減輕自由基介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷和血管通透性。此外，非布索坦還可抑制PI3K/Akt通路及β-catenin 來消除百草枯對肺組織中MMP-9 含量的刺激作用，從而保護(hù)肺泡的完整性。百草枯大鼠肺組織炎癥介質(zhì)、IL-8 和VEGF 含量的增加可能與PI3K/Akt通路的增強(qiáng)有關(guān)。IL-8是一種有效的中性粒細(xì)胞激活劑和趨化因子，在肺部炎癥、肺泡炎、成纖維細(xì)胞遷移和肺纖維化中起重要作用［17］。非布索坦降低肺組織IL-8 水平可能與抑制β-catenin 表達(dá)有關(guān)。VEGF 是一種具有多種作用的細(xì)胞因子，它通常在肺泡和支氣管上皮中表達(dá)，被認(rèn)為是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志物［18］。VEGF 控制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和存活、血管通透性、血管生成和單核細(xì)胞募集，通過誘導(dǎo)NF-κB促進(jìn)炎癥反應(yīng)［19］。百草枯在急性肺損傷中可誘導(dǎo)VEGF 大量釋放，增加血管通透性，允許炎性細(xì)胞浸潤到肺組織，導(dǎo)致過度損壞。研究［20］顯示，阻止內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物可以降低VEGF 的濃度，降低血管通透性。百草枯上調(diào)β-catenin 可能參與了下游分子VEGF的誘導(dǎo)，說明β-catenin激活與VEGF表達(dá)上調(diào)之間存在關(guān)系。

綜上所述，百草枯可通過提高XO 活性、增強(qiáng)氧化應(yīng)激、激活 PI3K/Akt 通路、β-catenin 和一系列炎癥介質(zhì)，從而誘發(fā)肺毒性；非布索坦通過下調(diào)RAGE、PI3K/Akt 通路、β-catenin 表達(dá)和抑制下游炎性反應(yīng)，達(dá)到改善百草枯所致肺損傷的作用。