大黃提取物灌胃對(duì)腦梗死大鼠血腦屏障通透性的改善作用及其機(jī)制

王飛，劉建雄 ，王明明，喬櫟

1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅蘭州730030；2 甘肅省人民醫(yī)院

腦卒中是目前致殘率和致死率最高的疾病之一，其臨床上可分為缺血性和出血性。腦梗死是腦缺血卒中疾病，占全部腦血管病的70%，其致殘率可達(dá)50%～70%［1］，存活者40%可復(fù)發(fā)，卒中復(fù)發(fā)頻率與病死率和致殘率呈正相關(guān)。研究［2］顯示，血腦屏障（BBB）由排列在腦毛細(xì)血管上的內(nèi)皮細(xì)胞組成，腦梗死后BBB 的破壞及其滲透升高是由炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激物的生成、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 的激活等一個(gè)復(fù)雜過(guò)程形成的。研究［3-6］顯示，大黃能清除氧自由基、降低血管通透性、減少腦組織損害，有鈣離子拮抗等作用，而且大黃能降低腦梗死大鼠腦組織中NF-κB 和細(xì)胞間黏附分子-1 等炎癥因子，可改善BBB損傷和減輕腦水腫。BBB結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接，由閉鎖蛋白（Occludin）、claudin 蛋白和連接黏附分子（JAMs）構(gòu)成，其中Occludin 是BBB 緊密連接中最重要的蛋白［7-10］。研究［11］顯示，Occludin 在腦內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，而在非神經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞中低表達(dá)，對(duì)BBB 的通透性起著重要的調(diào)節(jié)作用。近年對(duì)于Occludin的研究主要集中在腦腫瘤、腦出血、多發(fā)性硬化等方面［12］，關(guān)于腦梗死的研究很少。2019 年12 月2 日—2020年9 月14 日，本研究觀(guān)察了大黃提取物灌胃對(duì)腦梗死大鼠BBB的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大鼠分組、腦梗死模型的建立及大黃提取物給予方法 選取甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供的SPF 級(jí) SD 雄性大鼠 180 只，體質(zhì)量 250～280 g。SD大鼠按需進(jìn)食及飲水，飼養(yǎng)環(huán)境相同，喂養(yǎng)1周適應(yīng)后用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。將180 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、大黃組，每組60 只。模型組和大黃組大鼠采用經(jīng)典longa＇s 線(xiàn)拴法制備腦梗死模型［13］。大鼠腦梗死模型建立成功的特點(diǎn)是上肢屈曲，行走時(shí)向左旋轉(zhuǎn)，清醒時(shí)左側(cè)肢體癱瘓。假手術(shù)組大鼠頸總動(dòng)脈與頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈分離后，不結(jié)扎大腦中動(dòng)脈。成功建立動(dòng)物模型后，每天上午9：00 和下午 17：00 分別給大鼠灌胃，大黃組給予2.5 mL 大黃提取物灌胃，假手術(shù)組、模型組給予2.5 mL 生理鹽水灌胃。各組在建模后第1、3、5、7、10 天隨機(jī)設(shè)置5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取10 只大鼠用于實(shí)驗(yàn)研究。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分 采用Longa 評(píng)分法［13］，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。無(wú)神經(jīng)功能缺損記0 分，左前爪不能完全伸展記1 分，行走時(shí)轉(zhuǎn)向左側(cè)障礙記2 分，行走時(shí)向左側(cè)傾倒記3 分，無(wú)法行走或失去意識(shí)記4分，死亡記5分。

1.3 各組大鼠腦組織中伊文思藍(lán)（EB）滲出量測(cè)算 建模后第 1、3、5、7、10 天隨機(jī)選擇5 只大鼠，在處死前30 min 通過(guò)尾靜脈靜脈注射2% EB（2 mL/kg），處死后用甲酰胺浸泡法［14］測(cè)算大鼠腦組織中EB滲出量。

1.4 各組大鼠腦梗死區(qū)Occludin mRNA 檢測(cè) 采用 Real-time PCR 法。建模后第 1、3、5、7、10 天隨機(jī)選擇5 只大鼠，通過(guò)快速斷頭和開(kāi)顱手術(shù)獲得腦組織，將腦組織置于用DEPC 處理的培養(yǎng)皿上，分離右腦組織，取腦梗死區(qū)100 mg 腦髓質(zhì)放入冷凍保存管中，浸入液氮后?80 ℃儲(chǔ)存。取大鼠腦梗死區(qū)組織，TRIzol 法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 β-actin 為內(nèi)參，進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。引物序列如下：Occludin 正向引物為5′-ACG?GTGCCATAGAATGAGATGTTG-3′，反向引物為5′-CAGCTAGTTGTTCATTTCTGCACCA-3′；β -actin 正向引物為 5′-CGTTGACATCCGTAAAGAC-3′，反向引 物 為 5′-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。 Realtime PCR 反應(yīng)體系：熒光染料 10 μL，cDNA 產(chǎn)物2 μL，10 μmol／L 目的基因引物各1 μL，DEPC 處理雙蒸水 6 μL，共 20 μL。以 2?ΔΔCt表示大鼠腦梗死區(qū)Occludin mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較見(jiàn)表1，由表1 可知，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均為0分，神經(jīng)功能未受損傷；模型組大鼠第1 天神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高，第3 天達(dá)峰值，第5 天開(kāi)始下降；大黃組大鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分均低于模型組（P均＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（分，）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組大黃組神經(jīng)功能評(píng)分第10天0 2.01±0.79*1.01±0.12*#第1天0 1.98±0.31*1.53±0.18*#第3天0 2.41±0.28*1.74±0.20*#第5天0 2.35±0.11*1.49±0.14*#第7天0 2.13±0.21*1.37±0.09*#

2.2 各組大鼠腦組織中EB滲出量比較 各組大鼠腦組織中EB滲出量比較見(jiàn)表2。由表2可知，假手術(shù)組大鼠腦組織中EB滲出量較少，且各時(shí)間點(diǎn)無(wú)變化；模型組大鼠第1天腦組織中EB滲出量明顯升高，第3天達(dá)峰值，第5天開(kāi)始下降；大黃組大鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦組織中EB滲出量均低于模型組（P均＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織中EB滲出量比較（%，）

表2 各組大鼠腦組織中EB滲出量比較（%，）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別腦組織中EB滲出量第1天0.95±0.12 2.75±0.10*2.57±0.22*#第5天0.93±0.09 2.44±0.30*2.12±0.09*#第10天0.94±0.12 1.99±0.15*1.74±0.15*#第3天0.94±0.13 3.31±0.14*2.30±0.15*#第7天0.95±0.10 2.23±0.21*1.93±0.10*#假手術(shù)組模型組大黃組

2.3 各組大鼠腦梗死區(qū)Occludin mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 各組大鼠腦梗死區(qū)Occludin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)表3。由表3 可知，假手術(shù)組大鼠腦梗死區(qū)Occludin mRNA 相對(duì)表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯變化趨勢(shì)；模型組大鼠第1 天腦梗死區(qū)Occludin mRNA 相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始下降，第3 天最低，第5 天后開(kāi)始升高，第10 天時(shí)接近假手術(shù)組；大黃組大鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦梗死區(qū)Oc?cludin mRNA 相對(duì)表達(dá)量均高于模型組（P均＜0.05）。

表3 各組大鼠腦梗死區(qū)Occludin mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）

表3 各組大鼠腦梗死區(qū)Occludin mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組大黃組腦梗死區(qū)Occludin mRNA相對(duì)表達(dá)量第10天0.89±0.17 0.75±0.19*0.83±0.12*#第1天0.89±0.10 0.32±0.03*0.43±0.11*#第3天0.90±0.23 0.28±0.10*0.59±0.14*#第5天0.86±0.06 0.43±0.13*0.68±0.13*#第7天0.88±0.04 0.53±0.04*0.71±0.11*#

3 討論

腦梗死是由于多種原因?qū)е戮植縿?dòng)脈血流減少或停止，致使供血區(qū)的腦組織缺血、缺氧的狀態(tài)，導(dǎo)致后期出現(xiàn)肢體偏癱、失語(yǔ)等神經(jīng)功能缺損的癥狀［1］。BBB 結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接［15］，由Occludin、claudin 蛋白和連接黏附分子構(gòu)成，各種內(nèi)源、外源的信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白達(dá)到對(duì)BBB 通透性的調(diào)節(jié)。生大黃的主要成分是蒽醌衍生物［5～6］，其主要功能是解熱、洗胃、活血化瘀。研究［16］顯示，大黃可以抑制線(xiàn)粒體凋亡，從而抵抗缺氧所致的大鼠海馬組織的損傷；同時(shí)可以通過(guò)下調(diào)HIF-1α 減輕腦缺血缺氧的損傷范圍，使得加速梗死區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)。在本研究過(guò)程中，模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分趨勢(shì)是：第1 天大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高，第3 天時(shí)達(dá)峰值，第5 天評(píng)分下降，第10天時(shí)最低。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)大黃治療腦梗死后的神經(jīng)功能評(píng)分均顯著低于模型組，說(shuō)明大黃可以使小鼠的神經(jīng)功能損傷程度得到有效地改善。我們分析認(rèn)為，這可能與大黃可以抑制腦組織線(xiàn)粒體的凋亡，從而減少缺氧所致的腦梗死損傷以及加速神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)有關(guān)，這說(shuō)明大黃對(duì)于腦梗死后神經(jīng)損傷減輕和神經(jīng)功能的恢復(fù)有顯著作用。

研究［17］發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中再灌注發(fā)生后致APT能量不足并使作為BBB基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的血管內(nèi)皮的肌動(dòng)蛋白聚合、肌球蛋白磷酸化，產(chǎn)生肌動(dòng)蛋白收縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損，則BBB 的通透性增加。在缺血性腦卒中患者腦組織中，氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧簇增加致使內(nèi)皮細(xì)胞受損，細(xì)胞因子可直接致使緊密連接蛋白 Claudin-5 及 Occludin 降解，IL-6 激活 NF-κB增加細(xì)胞黏附因子，可增強(qiáng)外周白細(xì)胞通過(guò)BBB 損傷部位從而增加入侵的能力。腦卒中患者嚴(yán)重者處于絕對(duì)臥床休息時(shí)，其胃腸道處于抑制狀態(tài)，致使腸道內(nèi)毒素吸收增加，腦內(nèi)的內(nèi)毒素亦增加。研究［18］顯示，大黃有腸道瀉下的作用，可排空胃腸道、改善腦組織缺血缺氧的狀態(tài)，同時(shí)也可以修復(fù)胃黏膜，減輕應(yīng)激性消化道潰瘍。腦組織的大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷可以通過(guò)血腦積液屏障進(jìn)入，可以抑制大鼠皮質(zhì)細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶，降低線(xiàn)粒體的活性，直接發(fā)揮對(duì)腦組織的保護(hù)作用。大黃及大黃制劑的有效成分可抑制大鼠細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，抑制血小板聚集，能提高腦缺血再灌注大鼠血清一氧化氮含量和腦組織一氧化氮合酶活性，降低腦組織含量，改善腦組織損傷；大黃注射液能顯著改善花生四烯酸誘導(dǎo)的腦缺血大鼠血液流變學(xué)，降低血小板聚集，抑制血栓素A 合成，降低血栓素A/前列腺素比值，減輕腦水腫，降低死亡率。本研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死后第1天Occludin mRNA 相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)，第3天表達(dá)最低，第5 天開(kāi)始明顯升高，但大黃組的Occludin mRNA 較模型組的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均增加；同時(shí)比較腦組織中EB 滲出量，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠第1 天腦組織中EB 滲出量明顯升高，第3 天達(dá)峰值，第5 天開(kāi)始下降；大黃組大鼠每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦組織中EB滲出量均低于模型組，說(shuō)明腦梗死后由于炎性因子和凝血酶破壞BBB，使Occludin mRNA 發(fā)生酪氨酸磷酸化導(dǎo)致表達(dá)降低，同時(shí)BBB 受損導(dǎo)致EB 滲出增加，但大黃可阻止內(nèi)皮細(xì)胞受損，降低Occludin mRNA 的分解，減輕BBB 受損。同時(shí)，由于缺血缺氧，緊密連接蛋白表達(dá)降低，BBB 通透性與Occludin mRNA 表達(dá)趨勢(shì)相反，這可能與大黃素通過(guò)BBB 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)降低線(xiàn)粒體的活性，直接對(duì)腦組織缺氧產(chǎn)生保護(hù)作用，并通過(guò)改變血流動(dòng)力學(xué)減輕腦水腫有關(guān)。

綜上所述，大黃提取物灌胃可改善腦梗死大鼠的BBB 通透性，其機(jī)制可能與大黃提取物阻止腦梗死區(qū)Occludinm mRNA 的降解有關(guān)。本研究揭示了大黃灌胃對(duì)腦梗死大鼠BBB 的保護(hù)作用，可以為腦梗死的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。