Gpx4、PCNA在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義

蒙玉娜 馬淑萍 黨春艷 薛麗 李紅玲

【摘要】 目的：探討磷脂酰谷胱甘肽過氧化物酶（Gpx4）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）中的表達(dá)及臨床意義。方法：收集2016年1月-2019年12月甘肅省人民醫(yī)院經(jīng)病理活檢確診的67例DLBCL患者的臨床資料，設(shè)為淋巴瘤組，同期收集20例反應(yīng)性增生性淋巴組織作為對(duì)照組。采用免疫組化法檢測(cè)淋巴瘤組及對(duì)照組中Gpx4、PCNA的表達(dá)水平。結(jié)果：Gpx4、PCNA在淋巴瘤組中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為31.34%和64.18%，均高于對(duì)照組中的5.00%、15.00%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同LDH水平、臨床分期、B癥狀情況、骨髓侵犯情況DLBCL患者的PCNA表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;不同臨床分期、B癥狀情況DLBCL患者的Gpx4表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在67例DLBCL組織中，Gpx4和PCNA陽(yáng)性表達(dá)分別為21、43例，其中兩者同時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)的有18例，同時(shí)呈現(xiàn)陰性表達(dá)的21例。結(jié)論：Gpx4和PCNA在DLBCL病理組織中呈高水平表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 DLBCL Gpx4 PCNA 免疫組織化學(xué)

Expression and Clinical Significance of Gpx4 and PCNA in Diffuse Large B-cell Lymphoma/MENG Yu’na， MA Shuping， DANG Chunyan， XUE Li， LI Hongling. //Medical Innovation of China， 2021， 18（33）： 0-057

[Abstract] Objective： To investigate the expression and clinical significance of phosphatidyl glutathione peroxidase （Gpx4） and proliferating cell nuclear antigen （PCNA） in diffuse large B cell lymphoma （DLBCL）. Method： Clinical data of 67 DLBCL patients diagnosed by pathological biopsy in Gansu Provincial People’s Hospital from January 2016 to December 2019 were collected， they were assigned to lymphoma group， and 20 reactive hyperproliferative lymphoid tissues were collected as control group. The expression levels of Gpx4 and PCNA in lymphoma group and control group were detected by immunohistochemistry. Result： The positive expression rates of Gpx4 and PCNA in the lymphoma group were 31.34% and 64.18%， respectively， higher than 5.00% and 15.00% in the control group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Comparison of PCNA expression in DLBCL patients with different LDH levels， clinical stages， symptoms B and bone marrow invasion， the differences were statistically significant （P<0.05）. Comparison of Gpx4 expression in DLBCL patients with different clinical stages， symptoms of B， the differences were statistically significant （P<0.05）. In 67 DLBCL tissues， Gpx4 and PCNA were positive in 21 and 43 cases， respectively， including 18 cases of both positive and 21 cases of both negative expression. Conclusion： Gpx4 and PCNA are highly expressed in pathological tissues of DLBCL.

[Key words] DLBCL Gpx4 PCNA Immunohistochemistry

First-author’s address： Ningxia Medical University， Yinchuan 750000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.33.014

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是最常見的非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL），是一種B細(xì)胞增殖的侵襲性淋巴瘤，常累及淋巴結(jié)或結(jié)外淋巴組織，占所有NHL的30%～40%，其在亞洲地區(qū)的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美地區(qū)[1]。研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生與體內(nèi)氧化應(yīng)激高度相關(guān)，高水平氧化應(yīng)激直接導(dǎo)致組織損傷，引起相關(guān)病理性改變，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。Gpx4是體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶系中最重要的亞單位[2-3]，是氧化應(yīng)激過程中重要的抗氧化酶。研究表明，Gpx4在各系統(tǒng)惡性腫瘤中異常表達(dá)，基因敲除后通過特征性的鐵死亡引起腫瘤細(xì)胞死亡[4]。此外，PCNA參與細(xì)胞DNA的合成，調(diào)控細(xì)胞增殖，其表達(dá)水平反映了腫瘤的惡性程度，是腫瘤細(xì)胞增殖可靠的標(biāo)志物。本研究通過免疫組化法檢測(cè)Gpx4和PCNA在DLBCL組織中的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床資料的關(guān)系，探討兩者在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 本研究收集2016年1月-2019年12月甘肅省人民醫(yī)院經(jīng)病理活檢確診的DLBCL患者的臨床資料67例，設(shè)為淋巴瘤組，其中男33例，女34例;年齡16～79歲，中位年齡53歲。DLBCL診斷依據(jù)《淋巴瘤病理診斷》標(biāo)準(zhǔn)[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合DLBCL診斷標(biāo)準(zhǔn);（2）年齡16～80歲;（3）資料完整，病理組織取材良好;（4）初診患者，入組前均未進(jìn)行治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有其他系統(tǒng)惡性腫瘤者;（2）有心臟疾病;（3）有肝臟疾患;（4）有感染性疾病;（5）有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患。同期收集20例反應(yīng)性增生性淋巴組織作為對(duì)照組?；颊咧橥獠⒑炇鹬橥鈺?，本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 采用免疫組化法檢測(cè)兩組石蠟標(biāo)本中Gpx4、PCNA的表達(dá)水平。兔抗人Gpx4、PCNA多克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司，按說明書進(jìn)行操作，Gpx4抗體的稀釋濃度為1︰400，PCNA抗體的稀釋濃度為1︰800。對(duì)結(jié)果評(píng)定如下：由兩位具有豐富經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師雙盲閱片，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。分別對(duì)Gpx4和PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度兩個(gè)變量進(jìn)行評(píng)分。二者得分乘積如下：0分者計(jì)陰性;1～4分者計(jì)弱陽(yáng)性（+）;5～8分者計(jì)中度陽(yáng)性（++）;9～12分者計(jì)強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組中Gpx4、PCNA的表達(dá)情況比較 Gpx4呈淡黃色、棕褐色彌漫表達(dá)于細(xì)胞膜上（圖1），PCNA呈棕褐色，主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)（圖2），兩者在淋巴瘤組中陽(yáng)性表達(dá)率分別為31.34%、64.18%，而對(duì)照組的陽(yáng)性表達(dá)率分別為5.00%、15.00%，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2 Gpx4、PCNA的表達(dá)與DLBCL患者臨床資料之間的關(guān)系 不同LDH水平、臨床分期、B癥狀情況、骨髓侵犯情況DLBCL患者的PCNA表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;不同臨床分期、B癥狀情況DLBCL患者的Gpx4表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 DLBCL組織中Gpx4和PCNA表達(dá)的關(guān)系 在67例DLBCL組織中，Gpx4和PCNA陽(yáng)性表達(dá)分別為21、43例，其中兩者同時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)的有18例，同時(shí)呈現(xiàn)陰性表達(dá)的21例。見表3。

3 討論

DLBCL具有明顯的侵襲性和生物學(xué)異質(zhì)性，部分患者接受R-CHOP標(biāo)準(zhǔn)化療方案后可治愈，近年來隨著分子圖譜的出現(xiàn)，自體干細(xì)胞移植以及嵌合抗原受體T細(xì)胞的輸注，明顯改善患者臨床癥狀及預(yù)后，但仍有大約40%的患者最終死于復(fù)發(fā)性疾病[6-7]。因此迫切需要探索新的分子生物學(xué)標(biāo)志物及有效的腫瘤治療分子靶點(diǎn)，提高DLBCL的診治水平及積極改善預(yù)后。

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度快，需氧量高，承受的氧化應(yīng)激多。為了減少這種氧化應(yīng)激，腫瘤細(xì)胞形成了不同的還原酶系統(tǒng)和胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（XC-）等抗氧化系統(tǒng)[8-9]。這些抗氧化系統(tǒng)和相關(guān)分子對(duì)癌癥進(jìn)展至關(guān)重要，因此成為抗癌藥物的靶點(diǎn)，并在多種癌癥治療中作為生物標(biāo)記物[10]。Gpx4是體內(nèi)抗氧化酶系中最重要的亞單位，也是一種細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑，它在氧化動(dòng)態(tài)平衡中起著主要作用[11]。Gpx家族包括八種亞型，在人體內(nèi)Gpx1、Gpx2、Gpx3和Gpx4主要作用是減少組織細(xì)胞內(nèi)的高水平過氧化物，減輕對(duì)機(jī)體的危害[12-13]。目前對(duì)于Gpx5～Gpx8的研究很局限。Gpx4主要表達(dá)于機(jī)體組織生物膜上，可以還原體內(nèi)過量的活性氧，催化機(jī)體細(xì)胞內(nèi)的H2O2分解，清除體內(nèi)有毒物質(zhì)。作用機(jī)制是將GSH作為抗氧化過程的底物，將體內(nèi)產(chǎn)生的過量有毒物質(zhì)進(jìn)行分解和轉(zhuǎn)化，從而與SOD和CAT一同構(gòu)成體內(nèi)重要的抗氧化系統(tǒng)。據(jù)相關(guān)報(bào)道，在基因敲除動(dòng)物模型中可觀察到脂質(zhì)過氧化[14]，說明了Gpx4對(duì)于保護(hù)細(xì)胞免受脂質(zhì)過氧化的重要性。近年來，文獻(xiàn)[15-17]報(bào)道Gpx4在結(jié)直腸癌，肝癌，肺癌等多種實(shí)體腫瘤中過表達(dá)，且與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等相關(guān)。在本研究中，與對(duì)照組相比，DLBCL組Gpx4表達(dá)的陽(yáng)性率較高，提示Gpx4可能參與DLBCL的進(jìn)展。

細(xì)胞生長(zhǎng)的基本特征是細(xì)胞增殖，腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為主要是由細(xì)胞的生長(zhǎng)行為和增殖狀態(tài)所決定的，腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物可客觀反映它的增殖潛能。PCNA是一種存在于生物體組織細(xì)胞核內(nèi)，其蛋白相對(duì)分子量大小為36 kD的核蛋白多肽，且生物種屬間無明顯的特異性，細(xì)胞內(nèi)DNA的合成速率及腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)均由細(xì)胞核內(nèi)PCNA蛋白的合成水平所反映，是可靠的腫瘤細(xì)胞增殖標(biāo)志物之一。PCNA形成一個(gè)DNA的同源三聚體環(huán)，電荷呈非對(duì)稱分布，并沿著三聚體環(huán)滑動(dòng)，錨定DNA聚合酶和其他DNA編輯酶。此外，還通過蛋白盒（PIP-box）的序列與調(diào)節(jié)蛋白相互作用[18]。研究認(rèn)為PCNA的異常表達(dá)參與各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。Juríková等[20]研究報(bào)道PCNA的高水平表達(dá)與惡性腫瘤細(xì)胞的高度異型性、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，同時(shí)與患者惡性腫瘤的臨床分期、遠(yuǎn)處浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等存在相關(guān)性，提示PCNA高水平表達(dá)增加了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性。Leoncini等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NHL的惡性程度越高，病理組織中PCNA陽(yáng)性表達(dá)水平也越強(qiáng)。文獻(xiàn)[22-23]研究一直認(rèn)為PCNA可作為判定NHL預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，在67例DLBCL病理組織中PCNA的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，提示PCNA參與了DLBCL疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Gpx4和PCNA在DLBCL病理組織中呈高水平表達(dá)。由于本研究所納入樣本量有限，對(duì)照組淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織病例20例，可能造成選擇性偏移，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果出現(xiàn)誤差，本研究未對(duì)所有入組病例進(jìn)行定期隨訪，未做生存分析和對(duì)DLBCL患者預(yù)后的評(píng)價(jià)，需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量、選擇其他新技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究，為DLBCL的臨床診斷與治療提供新的參考。

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（收稿日期：2021-04-07） （本文編輯：姬思雨）