子宮內(nèi)膜異位病灶中NF—κBp65的表達(dá)及意義

朱虹　高軍

[摘要] 目的 探討核轉(zhuǎn)錄因子kappaB p65（NF-κB p65）在不同部位子宮內(nèi)膜異位病灶中的表達(dá)及意義。 方法 收集我院住院手術(shù)的子宮內(nèi)膜異位癥手術(shù)組織標(biāo)本48例（包括盆腔外特殊部位的子宮內(nèi)膜異位癥16例，卵巢子宮內(nèi)膜異位癥32例），同期在位內(nèi)膜22例，正常子宮內(nèi)膜20例作為對(duì)照，采用免疫組化法檢測(cè)NF-κB p65在上述各組內(nèi)膜中的表達(dá)情況及與臨床分期的關(guān)系。 結(jié)果 各組內(nèi)膜均存在NF-κB p65的陽(yáng)性表達(dá)，NF-κB p65蛋白表達(dá)于腺上皮細(xì)胞的胞核和胞漿，在盆腔外子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶、卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常子宮內(nèi)膜中表達(dá)依次減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），增生期與分泌期的子宮內(nèi)膜相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。卵巢內(nèi)異癥異位內(nèi)膜中NF-κB p65的表達(dá)與臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性。 結(jié)論 盆腔外子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶、卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜中均存在NF-κB p65的高表達(dá)，提示其可能參與了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜異位癥；核轉(zhuǎn)錄因子kappaB p65；免疫組織化學(xué)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.31；R711.71 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）11-0019-03

[Abstract] Objective To explore the expressions and significance of NF-κB p65 in different place endometriosis.Methods A total of 48 specimans with endometriosis （16 cases of extrapelvic endometriosis，32 cases of ovarian endometriosis and meanwhile 22 cases of eutopic endometrium） were enrolled in the study，20 cases of normal endometrium were involed as control group. Immunoh istochemistry was used to detect the expressions of NF-κB p65 in above groups. Results The expressions of NF-κB p65 were found in the glandular epithelial cells in all groups. The extrapelvic endometriosis cases showed the highest expression，followed by ectopic endometrium， eutopic endometrium，and showing the lowest in normal endometrium，the difference among those groups was significant （P<0.05）. However， the difference between prolificative phase and secretory phase was not significant （P>0.05）. Furthermore， there was no correlation with clinical stages in ovarian endometriosis. Conclusion NF-κB p65 proteins are highly expressed in extrapelvic and ectopic endometrium，which suggests that they may participate in the development and progression of endometriosis.

[Key words] Endometriosis；Nuclear factor-κB p65； Immunohistochemistry

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）簡(jiǎn)稱(chēng)內(nèi)異癥，是指具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)種植在子宮腔被覆黏膜以外的其他部位引起的疾病，可導(dǎo)致痛經(jīng)、不孕、盆腔痛及月經(jīng)改變等癥狀，內(nèi)異癥具有類(lèi)似惡性腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的特性，復(fù)發(fā)率高，治療效果不理想，嚴(yán)重影響婦女的生活質(zhì)量。NF-κB作為一種關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子，已證實(shí)可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移。本研究中，我們采用免疫組化法檢測(cè)NF-κB p65蛋白在盆腔外內(nèi)異癥、卵巢內(nèi)異癥的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，了解NF-κB p65在上述各組內(nèi)膜的表達(dá)差異及與臨床分期的相關(guān)性，探討NF-κB p65在內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展中的作用，為內(nèi)異癥的診斷和治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究共收集組織標(biāo)本90例，均來(lái)自于江西省人民醫(yī)院婦科的住院患者，均經(jīng)病理證實(shí)；其中卵巢異位內(nèi)膜組織32例（巧克力囊腫），內(nèi)異癥在位內(nèi)膜22 例，正常子宮內(nèi)膜20 例，盆腔外內(nèi)異癥病灶16例；盆腔外內(nèi)異癥組標(biāo)本采集于2006年1月～2014 年8 月，異位部位包括直腸2 例，膀胱1 例，宮頸2 例，后穹隆1 例，腹壁10例；32例卵巢異位內(nèi)膜組標(biāo)本采集于2013年8月～2014 年8 月收治的卵巢巧克力囊腫患者，年齡19～45 歲，平均34.6 歲，按照1985 年美國(guó)生育協(xié)會(huì)修改的rAFS 分期法，Ⅰ期7例，Ⅱ期10例，Ⅲ期8 例，Ⅳ期7例；22 例卵巢內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜取自上述因內(nèi)異癥而行子宮切除的子宮在位內(nèi)膜，或診刮所得的子宮內(nèi)膜，其中增生期12例，分泌期10 例；正常對(duì)照組20例為同期因輸卵管性不孕癥、子宮畸形住院手術(shù)診刮所得的子宮內(nèi)膜，其中增生期10 例，分泌期10 例，均排除其他子宮內(nèi)膜病變。所有患者術(shù)前6個(gè)月未用過(guò)內(nèi)分泌藥物，6個(gè)月內(nèi)無(wú)妊娠和哺乳史，月經(jīng)規(guī)則。

1.2 主要試劑

兔抗人NF-κB p65多克隆抗體即用型工作液購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

離體標(biāo)本取材后置于4%多聚甲醛中固定，脫水，石蠟包埋，每份標(biāo)本切片3 張，厚度為4 μm，部分盆腔外內(nèi)異癥病例少見(jiàn)，收集既往病例蠟塊重新切片。分別進(jìn)行NF-κB p65的免疫組化染色和HE 染色。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

細(xì)胞漿內(nèi)棕黃色顆粒狀著色即為陽(yáng)性。按FDA 推薦的染色強(qiáng)度分級(jí)：①陰性（-）：細(xì)胞無(wú)著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)< 5%；②弱陽(yáng)性（+）：細(xì)胞輕度著色呈淡黃色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)5%～25%；③陽(yáng)性（++）：細(xì)胞著色呈深黃色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%；④強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：細(xì)胞明顯著色，呈棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%。結(jié)果判斷在雙盲下進(jìn)行，每張切片由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生分別計(jì)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，多組間比較采用χ2檢驗(yàn)的Fisher確切概率法，兩兩比較采用Pearson卡方檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB p65在各組中的表達(dá)情況

NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)主要見(jiàn)于子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿，在異位內(nèi)膜的間質(zhì)中亦有表達(dá)，見(jiàn)封三圖2～5。

2.2 NF-κB p65在各組子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況

NF-κB p65在盆腔外子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶、卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)依次減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）；兩兩相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜中增生期與分泌期NF-κB p65表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 卵巢內(nèi)異癥異位內(nèi)膜中NF-κB p65與臨床分期的相關(guān)性

卵巢內(nèi)異癥異位內(nèi)膜NF-κB p65在子宮內(nèi)膜異位癥rAFS臨床各期的表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示與rAFS臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表2。

3 討論

內(nèi)異癥的發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，約占生育年齡婦女的15%。因其具有侵襲、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤生物學(xué)行為，可在盆腔內(nèi)形成嚴(yán)重而廣泛的粘連，造成痛經(jīng)、慢性盆腔痛、性交痛及月經(jīng)改變等癥狀。近年來(lái)隨著剖宮產(chǎn)率增高，盆腔外的內(nèi)異癥如腹壁切口內(nèi)異癥的報(bào)道逐年增高[1，2]，嚴(yán)重影響患者健康與生活質(zhì)量。內(nèi)異癥治療方法采用外科手術(shù)和激素治療，但除根治性手術(shù)外，其余治療效果均不理想，復(fù)發(fā)率高，是當(dāng)前婦科領(lǐng)域研究亟待解決的問(wèn)題之一。探討內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制成為了內(nèi)異癥研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是1986年由Bltimore和Rwiansen 在漿細(xì)胞和成熟B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，主要存在形式是p50 和RelA（p65）組成的異源二聚體。NF-κB作為多條信號(hào)轉(zhuǎn)錄途徑的交匯點(diǎn)，活化后可促進(jìn)白介素（IL）、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、黏附分子（ICAM）、凋亡相關(guān)因子（caspase-8）等表達(dá)[3-6]，參與機(jī)體免疫、炎癥、應(yīng)激等反應(yīng)的生理病理過(guò)程[7]。內(nèi)異癥相關(guān)的大多數(shù)細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)子都有功能性的NF-κB p65結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB 的激活后可導(dǎo)致上述細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的種植、侵襲和轉(zhuǎn)移。

已有研究顯示，NF-κB p65在內(nèi)異癥患者的在位及異位內(nèi)膜中均有表達(dá)，且表達(dá)異常增高，而在正常子宮內(nèi)膜組織表達(dá)微弱，提示NF-κB p65在內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制中有重要作用[8-12]。NF-κB在月經(jīng)周期中增生期和分泌期的表達(dá)是否存在差異，眾多研究結(jié)論不一。本研究結(jié)果顯示，卵巢異位內(nèi)膜NF-κB p65表達(dá)高于同期在位內(nèi)膜（P<0.05），且明顯高于正常內(nèi)膜（P<0.05）；在位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜NF-κB p65表達(dá)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與多數(shù)國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道一致，提示的過(guò)度激活參與了內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)病過(guò)程。但NF-κB p65的表達(dá)在正常人群及內(nèi)異癥人群的增生期、分泌期表達(dá)無(wú)顯著性差異，與Gonzalez-Ramos R等的研究結(jié)果相似[10，13]。

本研究初步探討了盆腔外內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制，盆腔外內(nèi)異癥可發(fā)生于膀胱、輸尿管、腸管、闌尾、手術(shù)瘢痕、疝囊、肺、腎、膈和肢體等盆腔外特殊部位。其中以剖宮產(chǎn)術(shù)后腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥最為常見(jiàn)，目前認(rèn)為，腹壁切口子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制是手術(shù)時(shí)子宮內(nèi)膜帶至切口直接種植所致，屬醫(yī)源性種植。本研究結(jié)果顯示，盆腔外異位病灶中NF-κB p65表達(dá)明顯高于卵巢異位內(nèi)膜、同期在位內(nèi)膜，且明顯高于正常內(nèi)膜（P<0.05）。再次證實(shí)了NF-κB p65的高表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子的活性，利于內(nèi)膜的種植和生長(zhǎng)。

卵巢內(nèi)異癥病例中，臨床各期的的表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示與rAFS臨床分期無(wú)明顯相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)，I～I(xiàn)I期患者的病灶中亦可存在NF-κB p65的高表達(dá)，其原因可能與現(xiàn)行的rAFS 臨床分期僅考慮病灶的大小、深淺，而未考慮到病變的性質(zhì)有關(guān)。在內(nèi)異癥發(fā)病初期，主要為紅色病變，位置表淺，但血管生成旺盛，而且其腺體和間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能完整，具有很強(qiáng)的侵襲能力，本研究中1例Ⅱ期患者NF-κB p65表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，該患者術(shù)中卵巢囊腫與盆底輕度粘連，但盆腔內(nèi)可見(jiàn)散在紅色病灶，提示病灶處于生長(zhǎng)活躍期，因此NF-κB p65的表達(dá)明顯增高。Ramos等[14]研究也表明，腹膜內(nèi)異癥病灶中NF-κB 被活化，其中紅色內(nèi)異癥病灶中NF-κB 的活性明顯高于黑色病灶，表明NF-κB活化與內(nèi)異癥發(fā)病有關(guān)。

綜上所述，NF-κB p65參與調(diào)控了子宮內(nèi)膜的異位種植，異常活化的NF-κB p65 在EMs發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，我們?cè)O(shè)想通過(guò)調(diào)控NF-κB p65有可能調(diào)控內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步探討其在內(nèi)異癥中侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制，將有助于為內(nèi)異癥患者的治療提供新的靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2015-02-13）