大麻二酚對阿霉素心肌毒性的保護(hù)作用及機(jī)制研究

俞東霞, 吳玉宇

(浙江省青春醫(yī)院 心電圖室，浙江 杭州 310020)

阿霉素(doxorubicin，DOX)是目前臨床最常用的廣譜抗腫瘤藥物之一，但其劑量依賴性的心臟毒性副作用限制了臨床應(yīng)用。阿霉素心臟毒性還可發(fā)展至不可逆的心肌病及心力衰竭[1]。阿霉素心臟毒性的具體機(jī)制尚未闡明，可能與氧化/硝化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡機(jī)制激活、線粒體功能障礙、繼發(fā)炎癥反應(yīng)等相關(guān)[2]。大麻二酚(cannabidiol，CBD)是從大麻中提取的非精神類藥物，體內(nèi)不激活1型和2型大麻素受體，人體應(yīng)用安全。研究[2]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸炎、缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病及其并發(fā)癥等疾病模型中，大麻二酚具有抗氧化和抗炎作用。在國外，含大麻二酚的藥物已被臨床應(yīng)用于治療小兒癲癇、多發(fā)性硬化所致的疼痛和痙攣[3]。本研究利用小鼠阿霉素心臟毒性模型，在氧化/硝化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡信號通路等方面探討大麻二酚對阿霉素心臟毒性的保護(hù)作用及其機(jī)制，以期為阿霉素心臟毒性的防治研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 C57BL/6小鼠購自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 6～8周齡，雄性，體質(zhì)量22～30 g。阿霉素購自Med Chem Express公司，大麻二酚購自Tocris公司，血清肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，抗NAPDH氧化酶(NOX2)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、GAPDH抗體購自Santa Cruz公司，超氧化物岐化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Roche公司。

1.2 小鼠心肌毒性模型構(gòu)建 小鼠心肌毒性模型構(gòu)建[4]：C57BL/6小鼠腹腔單次注射阿霉素(20 mg/kg)，自由進(jìn)食進(jìn)水，5 d后麻醉下處死動(dòng)物獲取所需標(biāo)本。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只：⑴阿霉素致心臟毒性組(DOX組)：腹腔單次注射阿霉素(20 mg/kg)；⑵CBD干預(yù)組(DOX+CBD組)： 腹腔單次注射阿霉素(20 mg/kg)，在注射阿霉素前90 min腹腔注射大麻二酚(10 mg/kg)，次日開始每天腹腔注射大麻二酚(10 mg/kg)1次，注射5 d；⑶大麻二酚對照組(CBD組)：腹腔僅注射大麻二酚，劑量、療程按照DOX+CBD組中CBD使用；⑷陰性對照組(Control組)：僅腹腔注射等量的生理鹽水。藥物干預(yù)5 d后麻醉處死小鼠，獲取所需標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)的檢測。

1.4 CK和LDH測定 小鼠處死后留取血液標(biāo)本，靜置30 min后，3 500 r/min(有效離心半徑8.5 cm)離心5 min后取血清。按照CK和LDH測定試劑盒說明書方法檢測CK和LDH水平。

1.5 心肌組織NOX2、iNOS蛋白印跡測定 取小鼠部分心肌組織加RIPA裂解液在冰上裂解并提取蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。取100 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶封閉后，分別加入抗NOX2、iNOS、GAPDH一抗(一抗1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST洗脫后加二抗(二抗1∶2 500稀釋)，孵育1 h，ECL化學(xué)顯色發(fā)光。

1.6 心肌組織SOD、GSH、MDA水平測定 取小鼠部分心肌組織液氮保存，預(yù)冷PBS中勻漿。按照SOD、GSH、MDA檢測試劑盒說明書方法測定心肌組織中SOD、GSH、MDA水平。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 取小鼠部分心肌組織研磨，Trizol法提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。構(gòu)建PCR反應(yīng)體系，利用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，以GAPDH作為內(nèi)參，采用相對2-△△CT法進(jìn)行定量分析。引物序列由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大麻二酚對小鼠CK和LDH水平的影響 DOX組小鼠的血清CK和LDH水平高于陰性對照組和CBD組，CBD+DOX組的CK和LDH水平均低于DOX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 大麻二酚對小鼠氧化應(yīng)激損傷的影響 DOX組的NOX2、iNOS表達(dá)均高于陰性對照組和CBD組，CBD+DOX組的NOX2、iNOS表達(dá)均低于DOX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A，圖2B，圖2C)；DOX組的MDA水平高于陰性對照組和CBD組(圖2D)，SOD、GSH水平均低于陰性對照組和CBD組(圖2E，圖2F)；CBD+DOX組的MDA水平低于DOX組，CBD+DOX組的SOD、GSH水平均高于DOX組；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

*與Control、CBD組比較，P<0.05；#與DOX組比較，P<0.05。圖2 大麻二酚對小鼠氧化應(yīng)激損傷的影響

2.3 大麻二酚對小鼠心肌組織凋亡通路的影響 DOX組小鼠心肌組織的Caspase 3 mRNA、Caspase 8 mRNA、Caspase 9 mRNA水平均高于陰性對照組和CBD組，CBD+DOX組的Caspase 3 mRNA、Caspase 8 mRNA、Caspase 9 mRNA水平均低于DOX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

*與Control、CBD組比較，P<0.05；#與DOX組比較，P<0.05。圖3 大麻二酚對小鼠心肌組織凋亡通路的影響

2.4 大麻二酚對小鼠TNF-α、IL-1β mRNA水平的影響 DOX組小鼠心肌組織的TNF-α mRNA、IL-1β mRNA水平均高于陰性對照組和CBD組，CBD+DOX組的TNF-α mRNA、IL-1β mRNA水平均低于DOX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

3 討論

阿霉素引起的心肌病是一個(gè)復(fù)雜的過程，具體機(jī)制目前尚不明確，除營養(yǎng)支持外無有效治療措施。

*與Control、CBD組比較，P<0.05；#與DOX組比較，P<0.05。圖4 大麻二酚對小鼠TNF-α、IL-1β mRNA水平的影響

大麻二酚從大麻中提取，在多種炎性疾病或神經(jīng)退行性病變模型中被證實(shí)具有潛在的抗氧化抗炎作用，且上述作用與經(jīng)典的G蛋白偶聯(lián)受體CB1、CB2無關(guān)[5]。

研究[6]發(fā)現(xiàn)，腹腔注射阿霉素能顯著提高心肌組織中氧化/硝化應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)損害體內(nèi)抗氧化保護(hù)機(jī)制。NADPH氧化酶(尤其是NOX2)依賴性的氧自由基(ROS)在阿霉素心臟損傷中起重要作用。本研究結(jié)果顯示，阿霉素腹腔注射不僅能顯著提高小鼠心肌組織中NOX2水平，同時(shí)也增加了iNOS表達(dá)，因iNOS產(chǎn)生的NO和超氧陰離子參與過氧亞硝酸鹽的形成，提示iNOS參與了阿霉素致心肌損傷過程。3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine, 3-NT)是過氧亞硝酸鹽形成的標(biāo)志，廣義上代表了硝化應(yīng)激的水平。過氧亞硝酸鹽可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，是ROS產(chǎn)生的標(biāo)志。關(guān)鍵收縮蛋白、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道的硝基化觸發(fā)促分裂素原活化蛋白激酶(MARP)的激活，后者活化細(xì)胞凋亡通路、影響線粒體功能。上述因素又反過來促使更多活性氧自由基產(chǎn)生，惡性循環(huán)不斷加重，最終導(dǎo)致心肌損傷、心臟功能障礙。阿霉素誘導(dǎo)小鼠心肌中NOX2、iNOS表達(dá)增高，ROS產(chǎn)生增多，同時(shí)損害了體內(nèi)抗氧化保護(hù)機(jī)制(減低了GSH和SOD水平)，導(dǎo)致組織氧化/應(yīng)激損傷，3-NT和MDA升高，最終影響組織器官功能。本研究結(jié)果顯示，CBD能下調(diào)NADPH氧化酶(NOX2)表達(dá)，減少DOX誘導(dǎo)的心肌組織ROS產(chǎn)生；CBD降低DOX誘導(dǎo)的iNOS表達(dá)升高，減少了產(chǎn)生過氧化亞硝酸鹽所需的NO；同時(shí)CBD通過增加體內(nèi)氧自由基的清除(增加了GSH和SOD水平)，來緩解DOX引起的小鼠心肌組織中氧化應(yīng)激損傷(降低了MDA水平)。研究[7]認(rèn)為，阻斷NADPH氧化酶和iNOS通路在多個(gè)模型中起重要作用，如順鉑腎損傷、臟器缺血再灌注損傷等。本研究結(jié)果提示上述通路在阿霉素心肌損傷中起重要作用，阻斷上述通路可能減輕其心臟毒性。

阿霉素引起心肌組織中凋亡通路的活化(Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9表達(dá)升高)，炎癥反應(yīng)(TNF-α，IL-1β表達(dá)增高)，促進(jìn)心肌組織損傷。研究[8-9]報(bào)道，在糖尿病心肌病、心肌梗死動(dòng)物模型中，CBD都有降低炎癥反應(yīng)的作用，而且在大麻素受體2敲除小鼠中，CBD亦有抗氧化應(yīng)激和抗炎作用，這更證實(shí)了CBD并不通過大麻素受體發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，CBD可明顯減低DOX誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)增加，降低相關(guān)炎癥反應(yīng)；另一方面，CBD減輕DOX誘導(dǎo)的心肌組織中凋亡通路的激活，減輕心肌組織損傷。

CBD能減輕DOX心肌毒性作用，但CBD是否影響DOX的抗腫瘤效應(yīng)目前尚未完全明了。CBD對多個(gè)腫瘤細(xì)胞系都具有抗腫瘤活性；CBD可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性，而基質(zhì)金屬蛋白酶在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用，提示CBD對抗腫瘤藥物可能是起協(xié)同而非拮抗作用[10]，后續(xù)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，CBD可能通過緩解氧化/硝化應(yīng)激反應(yīng)、減輕炎癥反應(yīng)，下調(diào)凋亡通路激活等機(jī)制緩解小鼠DOX心臟毒性作用。