物理方法在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性中的研究進(jìn)展

倪金波，尹 航，姜建勇

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬蕭山醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 311201)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是最早被發(fā)現(xiàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞，主要存在于骨髓組織，具有自我增殖和更新的能力。BMSCs在移植技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展為再生醫(yī)學(xué)等學(xué)科做出了重要貢獻(xiàn)[1]。適當(dāng)?shù)奈锢硪蛩?，如：力學(xué)、電磁場(chǎng)、溫度、激光、超聲等在 BMSCs 成骨分化過(guò)程中發(fā)揮著不可忽視的作用[2]。本文綜述近年來(lái)物理方法在BMSCs生物學(xué)特性中的相關(guān)研究進(jìn)展，為指導(dǎo)BMSCs在再生醫(yī)學(xué)和組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供新思路。

1 BMSCs生物學(xué)特性

1.1 生長(zhǎng)特性 BMSCs一般呈紡錘型，少量呈圓形、橢圓形、星型、多角型等，在形態(tài)學(xué)上與成纖維細(xì)胞類似。研究[3]表明，BMSCs具有貼壁性，一開(kāi)始生長(zhǎng)緩慢，之后進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，最后到達(dá)平臺(tái)期。BMSCs的生長(zhǎng)曲線呈“S”型。一般認(rèn)為，間充質(zhì)干細(xì)胞有分化成多種細(xì)胞的能力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力較強(qiáng)[4]，被認(rèn)為是骨組織損傷與修復(fù)的有效材料之一。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs和脂肪干細(xì)胞(ADSCs) 的增殖和分化能力隨著傳代次數(shù)的增加而下降[5-6]。Jiang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs治療骨缺損的能力隨著傳代次數(shù)的增加而減弱，其原因可能與端粒酶的活性和染色體的異質(zhì)性有關(guān)；BMSCs臨床應(yīng)用為3～5代。

1.2 表面分子標(biāo)記 人BMSCs的群體表達(dá)包括CD44、CD105、CD106、CD73和Sca-1，而在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中極少表達(dá)CD11a、CD45、CD235a、HLA-DR等表面標(biāo)記物[8-10]。鄒維艷等[4]研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠BMSCs低表達(dá)CD45，BALB/c大鼠BMSCs高表達(dá)CD45。當(dāng)BALB/c大鼠傳代培養(yǎng)至20多代后，CD45的表達(dá)也明顯下降。

2 力學(xué)因素的影響作用

有文獻(xiàn)[11]顯示，運(yùn)動(dòng)組成纖維集落形成單位(CFU-F)的集落數(shù)顯著高于久坐組，提示運(yùn)動(dòng)能夠顯著增加BMSCs與ADSCs的增殖能力。張麗等[3]進(jìn)一步闡述了剪切力、應(yīng)壓力、牽張力、微重力和離心力等力學(xué)因素在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)骨分化的過(guò)程中所扮演的角色。隨著研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)機(jī)械刺激可導(dǎo)致多種信號(hào)通路的激活，如整合素、離子通道、NO和前列腺素E2等，這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路會(huì)激活下游信號(hào)介質(zhì)并激活成骨分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，影響B(tài)MSCs的增殖分化。

2.1 剪切力 剪切力是細(xì)胞周?chē)鲃?dòng)的液體對(duì)細(xì)胞表面產(chǎn)生單位面積的力。在體外模擬過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)不同的流體剪切力會(huì)影響B(tài)MSCs的成骨分化。Liu等[12]認(rèn)為間歇性的流體剪切力比連續(xù)性的流體剪切力更能促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化，ERK1/2在該過(guò)程中具有關(guān)鍵作用。但另有研究[13]表明，流體剪切力會(huì)損傷BMSCs的存活和分化。流體剪切力的強(qiáng)度在BMSCs分化過(guò)程中具有重要作用。

2.2 應(yīng)壓力 靜水壓是椎間盤(pán)在人直立、彎腰和行走等日常活動(dòng)中的主要受力形式。研究[14]發(fā)現(xiàn)，流體靜水壓能顯著增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的效率。Cheng等[15]通過(guò)同位素氨基酸標(biāo)記法(SILAC)檢測(cè)BMSCs在機(jī)械刺激后的差異表達(dá)，結(jié)果顯示，在靜水壓力刺激下，BMSCs中經(jīng)典的膜機(jī)械受體整合素β1增加；炭疽毒素蛋白受體(ANTXR1)特異性激活Smad2，并上調(diào)Smad4的表達(dá)，活化的Smad2轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核調(diào)節(jié)軟骨形成。還有相關(guān)研究顯示，雌激素受體[16]、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白R(shí)AS[17]等都參與相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.3 牽張力 人體運(yùn)動(dòng)過(guò)程中會(huì)受到肌肉收縮與舒張產(chǎn)生的拉力，即牽張力。研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，牽張力是激活和促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的一個(gè)重要因素。目前，研究更多的是牽張力刺激的頻率、時(shí)間、大小和影響B(tài)MSCs的機(jī)制。有研究[18]提出：12%的牽張力和600 με、0.25 Hz的拉伸應(yīng)變有利于促進(jìn)細(xì)胞紡錘體形狀的穩(wěn)定。Nam等[20]采用不同速率和應(yīng)變的機(jī)械單軸拉伸體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施加4%的應(yīng)變+1 Hz時(shí)，細(xì)胞的增殖速度最快，而在8%應(yīng)變+1 Hz負(fù)載下，膠原蛋白的產(chǎn)生和張力基因表達(dá)最高。

2.4 微重力 又稱“零重力”，微重力環(huán)境對(duì)人體的骨骼肌肉有一定的影響，也同樣影響著B(niǎo)MSCs的增殖和分化。微重力的效應(yīng)模擬設(shè)施有很多，其中后肢/尾懸吊微重力活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑楸容^理想的模型[21]。在實(shí)驗(yàn)?zāi)M下，研究發(fā)現(xiàn)微重力抑制BMSCs細(xì)胞學(xué)形態(tài)的穩(wěn)定。Dai等[22]觀察模擬微重力下BMSCs的群體生長(zhǎng)，并用CD34、CD44和CD106進(jìn)行標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，且生長(zhǎng)因子等促進(jìn)BMSCs增殖的細(xì)胞因子的影響力弱于重力下的刺激。有研究[23]報(bào)道，其相關(guān)機(jī)制可能與RhoA蛋白活性變化，影響細(xì)胞骨架與黏附性有關(guān)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖與成骨分化。在微重力的作用下，Coll2、ANCN和Coll10等軟骨相關(guān)因子高度表達(dá)，提示微重力作用有利于BMSCs分化為軟骨細(xì)胞并維持其穩(wěn)定[24-25]。還有研究[26]發(fā)現(xiàn)，回轉(zhuǎn)器模擬微重力(SMG)顯著抑制了具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)的表達(dá)，TAZ是骨形成的重要調(diào)節(jié)因子。另有研究[27]表明，在微重力作用下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞骨架的改變和多電位標(biāo)記OCT4的上調(diào)改變了分化的潛能；在短時(shí)間微重力的影響下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有向內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的能力。隨著組織工程的不斷深入，利用空間基地對(duì)BMSCs的研究也取得新的突破。

2.5 離心力 蔣斌等[28]通過(guò)模擬裝置體外研究發(fā)現(xiàn)，低轉(zhuǎn)速的離心力促進(jìn)BMSCs的增殖，而高轉(zhuǎn)速則起到抑制作用，其中最適宜的離心力速度為500 r(12 cm)/min。李曉亮等[29]的實(shí)驗(yàn)探討了不同分化周期對(duì)低轉(zhuǎn)速下BMSCs增殖和分化能力的影響，結(jié)果顯示，離心力能顯著促進(jìn)BMSCs的增殖與骨化。

3 電磁場(chǎng)的影響作用

張敏等[30]研究顯示，脈沖電磁場(chǎng)(pulsed electromagnetic field, PEMF)能顯著增加BMSCs的增殖能力并保持其長(zhǎng)梭形態(tài)，15 Hz頻率、1 mT磁感應(yīng)強(qiáng)度條件能顯著促進(jìn)BMSCs增殖和堿性磷酸酶活性。Ongaro等[31]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PEMF的成骨作用與堿性磷酸酶活性、骨鈣素水平和基質(zhì)礦化等早期或晚期的成骨生物活性因子相關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-Catenin信號(hào)通路[32]，PKA和ERK1/2通路[33]在PEMF誘導(dǎo)BMSCs成骨分化的過(guò)程中起著重要作用，磁場(chǎng)激活了cAMP和MAPK等信號(hào)通路。然而有關(guān)電磁場(chǎng)促進(jìn)骨分化還有爭(zhēng)議，相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步研究闡明。

4 超聲波的影響作用

早期研究[34]發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度的超聲脈沖能顯著增高兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性和骨鈣素的含量，這為超聲波在骨組織工程的運(yùn)用和為解決骨折愈合的臨床治療提供了新思路。He等[35]的研究顯示，低強(qiáng)度脈沖超聲在誘導(dǎo)劑的作用下能加速BMSCs的早期成骨和血管的生成。進(jìn)一步的研究[36]發(fā)現(xiàn)，超聲波的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞間的縫隙連接有關(guān)，同時(shí)縫隙連接有助于超聲波對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的刺激作用，這種刺激作用可能與激活ERK1/2和/或P38通路有關(guān)。另一項(xiàng)研究[37]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1處理的骨髓基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)整合素-mTOR信號(hào)通路能顯著促進(jìn)軟骨形成，為治療關(guān)節(jié)軟骨損傷與老化帶來(lái)了不同思路。然而超聲波能否誘導(dǎo)分化BMSCs成更多不同類型的細(xì)胞、組織，并拓展臨床治療手段，需進(jìn)一步探索。

5 溫度的影響作用

有研究[38]顯示，穩(wěn)定的溫度控制能縮短細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間和提高細(xì)胞的質(zhì)量。也有研究[39]提出，較高的溫度反而比37℃下更有利于BMSCs的復(fù)蘇和分化。可見(jiàn)在BMSCs的增殖和分化過(guò)程中，溫度扮演著重要的角色。Ren等[40]研究發(fā)現(xiàn)，低溫能夠抑制BMSCs的增殖和分化，卻增加了BMSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的比例，其機(jī)制可能與小泛素類修飾物(SUMO)的基化有關(guān)。SUMO提高BMSCs在低溫下的耐受性，以此增強(qiáng)SUMO和BMSCs靶蛋白的結(jié)合能力。

6 激光的影響作用

有研究[41-42]顯示，激光療法能影響B(tài)MSCs的生物學(xué)特性，促進(jìn)其增殖和分泌。Wang等[43]研究不同能量強(qiáng)度的低強(qiáng)度激光對(duì)BMSCs的影響，結(jié)果顯示，2 J/cm2和4 J/cm2的密度能顯著促進(jìn)健康和炎癥下BMSCs的增殖和成骨分化，但當(dāng)強(qiáng)度到達(dá)16 J/cm2時(shí)，反而抑制BMSCs的生長(zhǎng)發(fā)育，表明在創(chuàng)傷早期、局部炎癥情況下，低強(qiáng)度激光照射能促進(jìn)BMSCs對(duì)于骨組織缺損的修復(fù)。另有研究[44]表明，綠色激光照射能增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化，綠色激光治療的主要優(yōu)點(diǎn)是減少出血和疼痛。綠光的適宜強(qiáng)度是4 J/cm2，與之前的研究結(jié)論相似，有關(guān)激光強(qiáng)度的研究還有待進(jìn)一步深入。

7 展望

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞和肝細(xì)胞等[45]。故BMSCs在生物醫(yī)學(xué)、組織工程等領(lǐng)域?yàn)楦鞣N疾病提供新的臨床思路，帶來(lái)新的臨床療法，解決實(shí)際的臨床問(wèn)題。隨著研究的深入，不同的物理刺激誘導(dǎo)BMSCs定向分化的研究已取得重要的進(jìn)展，但各個(gè)物理刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、不同物理刺激促分化強(qiáng)度的量化、最佳物理刺激條件尋找等問(wèn)題尚需進(jìn)一步的探索。