調(diào)控微小RNA-17-92表達(dá)對(duì)血吸蟲病大鼠肝纖維化的抑制作用▲

郭忠欣 李蘭花 康 慨 李雪飛 呂亞輝 朱 偉

(1 北京師范大學(xué)醫(yī)院公共衛(wèi)生科，北京市 100875，電子郵箱：gcm580@163.com；2 濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院流行病教研室，山東省濰坊市 261053)

血吸蟲病是一種臨床較為常見的慢性感染性寄生蟲疾病，在數(shù)十個(gè)非洲、亞洲、拉丁美洲國家流行，而在我國血吸蟲病主要在長江流域及其以南地區(qū)流行[1-2]，該病可對(duì)患者健康、生活質(zhì)量造成嚴(yán)重威脅[3-4]。血吸蟲病的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、胸痛、血痰、腹瀉、肝區(qū)疼痛、腹痛、侵入部位皮炎等，疾病發(fā)展還可導(dǎo)致消化道出血、腹腔積液、肝纖維化等并發(fā)癥的發(fā)生[5-7]。臨床上治療血吸蟲病的常用手段為藥物治療，但是尚無特效藥物用于治療血吸蟲病所致的肝纖維化，因此尋找治療抑制血吸蟲病肝纖維化的新靶點(diǎn)成為目前臨床醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。本研究建立血吸蟲病大鼠模型，并靶向調(diào)控微小RNA(mircoRNA,miRNA)-17-92表達(dá)，旨在探討調(diào)控miRNA-17-92表達(dá)對(duì)血吸蟲病大鼠肝纖維化的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取40只SD健康雄性大鼠，由華蘭生物工程股份有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(豫)2018-0014。鼠齡8～11(9.5±1.2)個(gè)月，體重230～247(238.5±6.8)g。在相對(duì)濕度50%～55%、溫度(23.1±1.9)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1周，光照12 h/d。

1.2 主要試劑 Lipofectamine 2000試劑購自滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司(批號(hào)：SND464)；miRNA-17-92模擬物購自上海易匯生物科技有限公司(批號(hào)：CL-0005)，miRNA-17-92抑制物購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：MA-0102)；兔抗小鼠透明質(zhì)酸抗體、兔抗小鼠Ⅲ型前膠原(typeⅢ procollagen，PCⅢ)抗體購自上海廣銳生物科技有限公司(批號(hào)：2013-11213、2013-1397)，兔抗小鼠層粘連蛋白抗體購自上海瓦蘭生物科技有限公司(批號(hào)：E03551)；大鼠抗小鼠白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-2抗體、大鼠抗小鼠IL-22抗體購自上?？泼羯锟萍加邢薰?批號(hào)：bs-4586R、bs-2623R)；兔抗小鼠活性氧簇抗體、兔抗小鼠8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)抗體購自上海梵態(tài)生物科技有限公司(批號(hào)：FT-T21239P、FT-P36089R)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA-17-92 RT-PCR試劑盒均購自QIAGEN公司(貨號(hào)：217184、218161、218193)；小鼠抗兔miRNA-17-92、轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅲ(transforming growth factor β receptor type Ⅲ,TGFβRⅢ)抗體購自亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司(批號(hào)：A25022-1、ABP57480)；大鼠抗小鼠Smad2、Smad3抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司(批號(hào)：FN-ER0645、FNab07994)；大鼠抗小鼠磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司(批號(hào)：FN-ER1910、ER1857、ER1520)；山羊抗兔IgG購自上海晶風(fēng)生物科技有限公司(批號(hào)：TF-0295G-SA)。

1.3 建模、分組和干預(yù)方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法選取10只大鼠作為正常組，不做處理。其余30只大鼠建立血吸蟲病模型：將大鼠腹部小塊區(qū)域被毛去除，采用生理鹽水濕潤裸露皮膚，顯微鏡下計(jì)數(shù)60條血吸蟲尾蚴(購自江蘇省血吸蟲病防治中心)，貼蓋在大鼠裸露皮膚處，持續(xù)10 min，以皮膚可見多處點(diǎn)狀充血為建模成功。20 d后將30只血吸蟲病大鼠模型隨機(jī)分為血吸蟲病組、上調(diào)組、下調(diào)組各10只。利用Lipofectamine 2000試劑將miRNA-17-92模擬物、miRNA-17-92抑制物稀釋為5 mmol/L的濃度，然后通過尾部靜脈分別注射入上調(diào)組、下調(diào)組大鼠體內(nèi)，正常組、血吸蟲病組大鼠經(jīng)尾部靜脈注射等量生理鹽水，各組的注射劑量均為1 mL/次，間隔12 h注射一次，共2次。注射結(jié)束后24 h檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 獲取標(biāo)本：對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉(25%烏拉坦，0.5 mL/100 g，腹腔注射)處理后，頸椎脫臼法處死，取各組大鼠腹部靜脈血3 mL,室溫下靜置2 h，4℃下2 000 r/min離心15 min后分離上清液，在-80℃環(huán)境中保存待檢，并留取肝臟組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 觀察肝臟組織病理學(xué)：取大鼠肝臟組織固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片。將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度乙醇中各水化3 min。使用蘇木精染色15 min后采用TBST清洗3次(5 min/次)，使用鹽酸乙醇溶液分化處理30 s，充分清洗后使用1%伊紅染色，使用不同濃度乙醇進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡(深視光谷儀器有限公司，型號(hào)：SGO-KK209)進(jìn)行觀察。

1.4.3 檢測(cè)血清中肝功能、肝纖維化指標(biāo)水平：使用全自動(dòng)生化分析儀(深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限責(zé)任公司，型號(hào)：VDVIA3500)檢測(cè)血清中肝功能指標(biāo)，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyltransferase,GGT)、ALT、AST水平；采用放射免疫分析法，使用相應(yīng)試劑檢測(cè)血清中肝纖維化指標(biāo)，透明質(zhì)酸、PCⅢ、層粘連蛋白水平。嚴(yán)格按照試劑說明書步驟進(jìn)行操作。

1.4.4 檢測(cè)血清中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)指標(biāo)水平：將血清標(biāo)本、稀釋液以及檢測(cè)卡平衡至24℃，對(duì)檢測(cè)卡進(jìn)行編號(hào)后置于平臺(tái)之上，配制標(biāo)準(zhǔn)液并按照1 ∶10比例對(duì)待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行稀釋。酶標(biāo)板中添加100 μL血清標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)液，混合均勻后在恒溫箱(37℃)中靜置0.5 h，采用TBST緩沖液洗板3次(5 min/次)，每孔中添加50 μL一抗以及50 μL蒸餾水，混勻后37℃環(huán)境中靜置0.5 h。采用TBST緩沖液洗板3次(5 min/次)后每孔中添加100 μL酶標(biāo)抗體，37℃環(huán)境中靜置10 min，采用TBST緩沖液洗板3次(5 min/次)后每孔中添加100 μL底物液，37℃、陰暗環(huán)境中靜置15 min后每孔中添加100 μL終止液混勻，使用酶標(biāo)儀(賽默飛公司，型號(hào)：Varioskan LUX)檢測(cè)波長為450 nm處的吸光值。

1.4.5 實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)肝組織miRNA-17-92的相對(duì)表達(dá)水平：提取肝臟組織總RNA，檢測(cè)RNA純度、含量，反轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA。使用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物。miRNA-17-92上游引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物序列為5′-GTGTTCAAAGTCTTACCGTGC-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為5′-GGGGACATCCGATAAAATTGG-3′，下游引物序列為5′-GATTTGTGCGTGTCATCATCCTTG-3′。PCR儀購自杭州朗基科學(xué)儀器有限公司(型號(hào)：T30D)。配置反應(yīng)體系，包括0.4 μL上下游引物、1 μL cDNA模板、10 μL SYBR Green，加蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件為97℃預(yù)熱8 min、95℃變性5 s、60℃退火31 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct方法計(jì)算出miRNA-17-92的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 蛋白免疫印跡法檢測(cè)TGF-β/Smads通路、PI3K/Akt通路的蛋白相對(duì)表達(dá)水平：將各組大鼠肝臟組織剪碎后加入裂解液裂解30 min，然后3 000 r/min離心處理10 min(離心半徑3 cm)，取上清液，提取50 μg蛋白，煮沸5 min使蛋白變性后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后依據(jù)蛋白分子大小把凝膠切開并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,采用Western封閉液室溫封閉90 min；按比例稀釋一抗(待測(cè)蛋白抗體按1 ∶1 000，內(nèi)參抗體按1 ∶2 000)后4℃孵育過夜，使用Western洗滌液洗滌5次，10 min /次；加入稀釋山羊抗兔IgG(1 ∶5 000),室溫水平搖床孵育60 min,Western洗滌液洗滌5次,10 min /次。經(jīng)過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑顯色和曝光后，使用Image J圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)條帶的灰度值,以待測(cè)蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組大鼠的肝組織病理學(xué)變化 正常組大鼠肝組織細(xì)胞排列整齊且緊密，結(jié)構(gòu)較為清晰，大小均一；血吸蟲病組大鼠肝組織細(xì)胞排列雜亂且疏松，出現(xiàn)部分細(xì)胞壞死、結(jié)構(gòu)損壞、纖維結(jié)締組織增生、炎性細(xì)胞浸潤狀況；下調(diào)組大鼠肝組織細(xì)胞排列雜亂且疏松，出現(xiàn)明顯細(xì)胞壞死、結(jié)構(gòu)損壞、纖維結(jié)締組織增生、炎性細(xì)胞浸潤狀況；上調(diào)組大鼠肝組織細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞壞死、結(jié)構(gòu)損壞、纖維結(jié)締組織增生、炎性細(xì)胞浸潤狀況均較血吸蟲病組明顯減輕。見圖1。

圖1 4組大鼠的肝組織病理學(xué)變化(蘇木精-伊紅染色，×100)

2.2 4組大鼠肝功能指標(biāo)水平的比較 與正常組比較，血吸蟲病組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠的血清GGT、ALT、AST水平均升高；與血吸蟲病組比較，下調(diào)組大鼠的血清GGT、ALT、AST水平均上升，上調(diào)組大鼠的血清GGT、ALT、AST水平均降低；與下調(diào)組相比，上調(diào)組大鼠的血清GGT、ALT、AST水平均降低(均P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠肝功能指標(biāo)水平的比較(x±s，U/L)

2.3 4組大鼠肝纖維化指標(biāo)的比較 與正常組比較，血吸蟲病組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠的血清透明質(zhì)酸、PCⅢ、層粘連蛋白水平均升高；與血吸蟲病組比較，下調(diào)組的血清透明質(zhì)酸、PCⅢ、層粘連蛋白水平升高，上調(diào)組大鼠的血清透明質(zhì)酸、PCⅢ、層粘連蛋白水平均降低；與下調(diào)組大鼠比較，上調(diào)組大鼠的血清透明質(zhì)酸、PCⅢ、層粘連蛋白水平均降低(均P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠肝纖維化指標(biāo)水平的比較(x±s，μg/L)

2.4 4組大鼠氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)的比較 與正常組比較，血吸蟲病組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠的血清活性氧簇、8-OHdG、IL-2、IL-22水平均升高；與血吸蟲病組比較，下調(diào)組大鼠的血清活性氧簇、8-OHdG、IL-2、IL-22水平升高，上調(diào)組大鼠的血清活性氧簇、8-OHdG、IL-2、IL-22水平均降低；與下調(diào)組大鼠比較，上調(diào)組大鼠的血清活性氧簇、8-OHdG、IL-2、IL-22水平均降低(均P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)的比較(x±s)

2.5 4組大鼠的miRNA-17-92及TGF-β/Smad通路蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 與正常組比較，血吸蟲病組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠miRNA-17-92的相對(duì)表達(dá)量較低，TGFβRⅢ、Smad2、Smad3蛋白的相對(duì)表達(dá)量較高；與血吸蟲病組比較，下調(diào)組大鼠miRNA-17-92的相對(duì)表達(dá)量較低，TGFβRⅢ、Smad2、Smad3蛋白的相對(duì)表達(dá)量較高，上調(diào)組大鼠miRNA-17-92的相對(duì)表達(dá)量較高，TGFβRⅢ、Smad2、Smad3蛋白的相對(duì)表達(dá)量較低；與下調(diào)組大鼠比較，上調(diào)組大鼠miRNA-17-92的相對(duì)表達(dá)量較高，TGFβRⅢ、Smad2、Smad3蛋白的相對(duì)表達(dá)量較低(均P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠miRNA-17-92及TGF-β/Smad通路蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

2.6 4組大鼠PI3K/Akt通路蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較 與正常組比較，血吸蟲病組、下調(diào)組、上調(diào)組大鼠PI3K、Akt、mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量較高；與血吸蟲病組比較，下調(diào)組PI3K、Akt、mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量較高，上調(diào)組大鼠PI3K、Akt、mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量較低；與下調(diào)組比較，上調(diào)組大鼠PI3K、Akt、mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量較低(均P<0.05)。見表5。

表5 4組大鼠PI3K/Akt通路蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

3 討 論

作為一種慢性感染性免疫系統(tǒng)疾病，血吸蟲病廣泛分布于全球數(shù)十個(gè)國家和地區(qū)[8-9]。有研究顯示，隨著血吸蟲病的發(fā)展，沉積于機(jī)體肝臟組織中的蟲卵會(huì)導(dǎo)致肝損傷、肝纖維化，可嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，因此尋找一種安全有效的治療手段具有重要意義[10-11]。目前臨床上尚無一種特效的治療血吸蟲病所致肝纖維化的藥物，越來越多的專家學(xué)者開始致力于這方面的研究。

血吸蟲病的發(fā)生、發(fā)展可引起肝功能損傷甚至肝硬化等，減輕肝功能損傷的嚴(yán)重程度對(duì)血吸蟲病治療、預(yù)后改善具有重要意義[12]。miRNA廣泛存在于大多數(shù)生物中，具有組織特異性、穩(wěn)定性、保守性等特點(diǎn)，與機(jī)體組織細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)[13-14]。miRNA-17-92作為miRNA家族的重要成員，其表達(dá)水平的變化與血管疾病、機(jī)體正常生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)[15]。有研究顯示，miRNA-17-92缺失對(duì)肝臟再生具有抑制作用，進(jìn)而引發(fā)了肝功能損傷[16]。但目前鮮有miRNA-17-92在血吸蟲病方面的研究。本研究結(jié)果顯示，血吸蟲病大鼠的血清GGT、ALT、AST水平上升，而上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)后血吸蟲病大鼠的血清GGT、ALT、AST水平下降，說明血吸蟲病大鼠出現(xiàn)一定程度的肝功能損傷，而上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)能夠緩解大鼠的肝功能損傷嚴(yán)重程度，改善血吸蟲病大鼠的肝功能指標(biāo)。

肝組織持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)造成纖維結(jié)締組織增生并大量沉積，進(jìn)而促進(jìn)肝組織纖維化的發(fā)生、發(fā)展[17]。有研究顯示，蟲卵可溶性抗原會(huì)對(duì)血吸蟲患者機(jī)體進(jìn)行持續(xù)刺進(jìn)，進(jìn)而引發(fā)了免疫應(yīng)答，導(dǎo)致組織損傷、蟲卵肉芽腫等慢性炎癥的發(fā)生，最終引發(fā)肝纖維化，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，這對(duì)患者的預(yù)后造成了嚴(yán)重影響[18]。本研究結(jié)果顯示，血吸蟲病大鼠的血清透明質(zhì)酸、PCⅢ、層粘連蛋白水平升高，肝組織細(xì)胞排列雜亂且疏松，出現(xiàn)部分細(xì)胞壞死、結(jié)構(gòu)損壞、纖維結(jié)締組織增生、炎性細(xì)胞浸潤狀況；而上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)的血吸蟲病大鼠的血清透明質(zhì)酸、PCⅢ、層粘連蛋白水平下降，且肝組織細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞壞死、結(jié)構(gòu)損壞、纖維結(jié)締組織增生、炎性細(xì)胞浸潤狀況較血吸蟲病組均明顯減輕，這說明血吸蟲病大鼠出現(xiàn)肝纖維化現(xiàn)象，而上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)能夠減輕其肝纖維化程度。研究表明，TGF-β/Smad信號(hào)通路在機(jī)體組織纖維化發(fā)展過程中起到重要作用[19]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)的血吸蟲病大鼠TGFβRⅢ、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)下調(diào)，說明上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)能夠靶向調(diào)控TGF-β/Smad通路蛋白表達(dá)，這可能是其抑制肝纖維化發(fā)展、發(fā)揮肝臟保護(hù)作用的可能機(jī)制之一。

肝損傷、肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展伴隨著肝組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)[20]?；钚匝醮鼐哂幸欢ㄑ趸?，肝損傷發(fā)展過程中活性氧簇大量生成[21]，致使氧化產(chǎn)物8-OHdG大量生成。IL-2、IL-22是常用的評(píng)價(jià)機(jī)體炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，二者水平變化與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[22-23]。本研究結(jié)果顯示，血吸蟲病大鼠的血清活性氧簇、8-OHdG、IL-2、IL-22水平上升，而上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)的血吸蟲病大鼠的血清活性氧簇、8-OHdG、IL-2、IL-22水平下調(diào)，這說明上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)能夠有效地減輕血吸蟲病大鼠肝組織氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，從而減輕肝纖維化。

肝臟組織細(xì)胞凋亡是慢性肝損傷、肝纖維化發(fā)展過程中的主要特征[24-25]。PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白P13K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡能力密切相關(guān)，靶向調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)，能夠干預(yù)細(xì)胞增殖、凋亡[26]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)的血吸蟲病大鼠PI3K、Akt、mTOR的蛋白相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)，因此我們推測(cè)上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)可能通過靶向調(diào)控PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)，抑制肝臟組織細(xì)胞凋亡，從而起到抑制肝纖維化發(fā)展的作用。

綜上所述，上調(diào)miRNA-17-92表達(dá)能夠改善血吸蟲病大鼠模型的肝功能和肝纖維化程度，其作用機(jī)制可能是調(diào)控miRNA-17-92能夠減輕肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，并靶向調(diào)控TGF-β/Smad通路、PI3K/Akt通路蛋白從而抑制肝纖維化及肝組織細(xì)胞凋亡，這或許可為血吸蟲病所致肝纖維化的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。