小干擾RNA技術(shù)在逆轉(zhuǎn)肝纖維化中應(yīng)用效果的研究進(jìn)展▲

馮一丹 呂蕊花 史琳娜 張喜榮 閆盎然

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)1 第二臨床醫(yī)學(xué)院，2 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，咸陽(yáng)市 712046，電子郵箱：1808827370@qq.com)

【提要】 肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展過(guò)程中的共同病理改變，發(fā)病時(shí)肝細(xì)胞發(fā)生炎癥壞死，肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生。目前認(rèn)為肝纖維化發(fā)生的主要機(jī)制是肝星狀細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在細(xì)胞間隙過(guò)度積累所致。小干擾RNA技術(shù)通過(guò)合成反義小分子RNA從而特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，在逆轉(zhuǎn)肝纖維化的過(guò)程中應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)具有強(qiáng)大的潛力。本文從抑制肝星狀細(xì)胞活化和增殖，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞衰老、凋亡與死亡，以及直接調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解3方面對(duì)小干擾RNA技術(shù)在逆轉(zhuǎn)肝纖維化中的應(yīng)用效果進(jìn)行綜述。

肝纖維化是多種病因?qū)е碌穆愿闻K疾病發(fā)展到肝硬化的中間過(guò)程，是一個(gè)可逆階段[1-3]。但目前還未發(fā)現(xiàn)可以有效逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物，臨床上主要通過(guò)去除原發(fā)病因或干預(yù)纖維化的進(jìn)程以達(dá)到逆轉(zhuǎn)肝纖維化的目的[4]。

RNA干擾技術(shù)于1998年首次被發(fā)現(xiàn)，是指雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)特異性誘導(dǎo)與之同源的mRNA降解或抑制其翻譯，使相應(yīng)基因表達(dá)關(guān)閉，從而誘導(dǎo)基因在轉(zhuǎn)錄后水平沉默[5]。之后RNA干擾技術(shù)迅速成為研究基因功能的工具之一，另外，該技術(shù)作為疾病靶向基因治療的新手段，已被用于各種疾病的治療[6]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)RNA干擾可以高效、準(zhǔn)確地沉默肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵基因，阻止其表達(dá)，認(rèn)為RNA干擾對(duì)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)有重要作用。本文分別從抑制肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化和增殖，促進(jìn)HSC的衰老、凋亡與死亡，直接調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成與降解3方面來(lái)對(duì)小干擾RNA技術(shù)在逆轉(zhuǎn)肝纖維化中應(yīng)用的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 小干擾RNA技術(shù)抑制HSC的活化與增殖

HSC可分為靜止表型和激活表型，正常情況下HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)肝臟受到外界刺激時(shí)HSC被激活，其表型可由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨??；罨腍SC最顯著的特征是表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，分泌多種致炎因子和致纖維化因子，并且實(shí)質(zhì)(如肝細(xì)胞)和非實(shí)質(zhì)(如巨噬細(xì)胞)細(xì)胞均可釋放HSC激活因子，使肝肌成纖維樣細(xì)胞分泌多種ECM，與此同時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)合成減少，相應(yīng)的組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)合成增加，從而導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。研究表明小干擾RNA可通過(guò)以下5種途徑抑制HSC的活化與增殖[7]。

1.1 抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad的表達(dá) 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor，TGF)-β1被認(rèn)為是促纖維化炎癥因子中最重要的介導(dǎo)因子，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均顯示沉默TGF-β1具有潛在治療肝纖維化的作用[8-9]。王魯文等[10]構(gòu)建TGF-β1 短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)沉默表達(dá)載體，并將其注入肝纖維化小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示小鼠肝內(nèi)TGF-β1、Smad3和α-SMA的表達(dá)下降，Smad7表達(dá)升高，抑制HSC的激活信號(hào)，細(xì)胞內(nèi)膠原合成減少，有效抑制了肝纖維化的發(fā)展。此外，TGF-β1小干擾RNA還能抑制肝組織中血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)-BB、PDGF-βR及肝組織中磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulatory protein kinase1/2，p-ERK1/2)的表達(dá)，從而起到改善肝纖維化的作用[11]。Fu等[12]將TGF-βRⅡshRNA轉(zhuǎn)入大鼠活化的HSC中，隨著TGF-βRⅡ和α-SMA水平的下降，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白與透明質(zhì)酸的表達(dá)水平也隨之降低，肝纖維化程度減輕。

Smads蛋白是TGF-β超家族信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一組蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的TGF-β受體的唯一底物。Smad通路在調(diào)控TGF-β1介導(dǎo)的ECM沉積過(guò)程中具有十分重要的作用,沒(méi)有Smads復(fù)合物的參與，TGF-β無(wú)法誘導(dǎo)HSC轉(zhuǎn)化、合成并分泌膠原及其他ECM[13]。轉(zhuǎn)染編碼Smad7基因的腺病毒至HSC可抑制TGF-β1的生物學(xué)活性，從而抑制HSC的活化并阻止肝纖維化的發(fā)生[14]。Liu等[15]采用小干擾RNA Smad7轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可阻斷吡喹酮介導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化和TGF-β1介導(dǎo)的Ⅰ型膠原(typeⅠ collagen,Col1)α1的增加，提示Smad7在吡喹酮抗肝纖維化過(guò)程中具有的關(guān)鍵作用。除此之外，HSC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)肝纖維化進(jìn)展也具有影響，Koo等[16]研究發(fā)現(xiàn)，存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的患者或小鼠的肝組織中Smad2表達(dá)水平增加，經(jīng)慢病毒載體將Smad2小干擾RNA轉(zhuǎn)入肝組織后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)HSC激活的作用減弱，這表明HSC中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)了肝纖維化的發(fā)生，且該過(guò)程是通過(guò)誘導(dǎo)Smad2的過(guò)度表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而采用小干擾RNA技術(shù)干擾Smad2表達(dá)可以抑制HSC激活從而緩解肝纖維化。

1.2 抑制高遷移率族蛋白B1的表達(dá) 高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是非組蛋白核內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白，主要由壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放以及單核/巨噬細(xì)胞受脂多糖等刺激后表達(dá)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1不僅在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，而且被釋放到胞外時(shí)可作為一種有效的炎癥介質(zhì)誘發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[18]。目前研究認(rèn)為，HMGB1有可能成為抗炎和防止組織損傷的重要靶點(diǎn)[19]。葛文松等[20]將HMGB1小干擾RNA用Lipofectamine包裹轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡加速，Col1、Ⅲ型膠原(typeⅢ collagen,Col3)表達(dá)水平也顯著降低。另有研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1小干擾RNA可顯著抑制肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的遷移及侵襲，并降低MMP-14蛋白的表達(dá)，這提示HMGB1小干擾RNA可以抑制肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌增殖，減少膠原沉積，具有預(yù)防及治療肝纖維化的潛力[21]。此外，Lan等[22]將HMGB1小干擾RNA導(dǎo)入到小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML-12中，發(fā)現(xiàn)其可減少AML-12細(xì)胞HMGB1的釋放以及炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷，阻斷其進(jìn)一步發(fā)展為脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化甚至肝癌。

1.3 抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá) 結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)在傷口愈合過(guò)程中呈過(guò)表達(dá)，誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致膠原積累，進(jìn)而加重肝纖維化[23]。Yu等[24]設(shè)計(jì)PEI-Fe3O4NP將CTGF小干擾RNA轉(zhuǎn)入HSC后發(fā)現(xiàn)，CTGF小干擾RNA可以降低活化HSC中CTGF的表達(dá)水平和膠原蛋白的產(chǎn)生。另有學(xué)者用CTGFshRNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，生長(zhǎng)繁殖被阻滯于S期，TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白的表達(dá)量下降，Smad7 mRNA及蛋白的表達(dá)水平升高，提示CTGF小干擾RNA在逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程中有重要作用[25]。血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)在肝損傷時(shí)呈過(guò)表達(dá)，因此被認(rèn)為是激活HSC的有效因子，可以顯著促進(jìn)HSC的增殖[4]。用小干擾RNA沉默PDGF受體β，發(fā)現(xiàn)PDGF受體β小干擾RNA能明顯抑制PDGF-BB的促HSC-T6細(xì)胞增殖效應(yīng)，降低CTGF、TIMP-1和Col1 mRNA表達(dá)水平[26]。此外，作為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族一員的胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PlGF)也能介導(dǎo)傷口愈合和炎癥反應(yīng)，在肝纖維化的發(fā)展和血管的生成中發(fā)揮重要作用。Li等[27]構(gòu)建PlGF小干擾RNA載體并經(jīng)尾靜脈注入膽管結(jié)扎的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)沉默PlGF可以降低小鼠肝臟的炎癥和纖維化程度，抑制HSC的激活與巨噬細(xì)胞的活化，并大幅降低了肝纖維化中促炎因子和趨化因子的表達(dá)水平，減輕肝纖維化程度。

1.4 抑制血管緊張素Ⅱ的表達(dá) 血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)通過(guò)誘導(dǎo)NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)依賴性氧化應(yīng)激來(lái)加重肝纖維化。AngⅡ的七肽片段Ang-(1-7)可降低AngⅡ的水平，從而預(yù)防肝纖維化。Zhang等[28]給予AngⅡ 刺激肝細(xì)胞之前采用NOX4小干擾RNA預(yù)處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AngⅡ誘導(dǎo)的肝細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化被抑制。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)NOX4小干擾RNA可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活和膠原蛋白合成[29]。Alamandine是新發(fā)現(xiàn)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)的組成成分，有研究發(fā)現(xiàn)，其可通過(guò)MrgD受體對(duì)AngⅡ 發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，研究人員針對(duì)MrgD受體設(shè)計(jì)了MrgD受體小干擾RNA并將其轉(zhuǎn)入HSC中，發(fā)現(xiàn)Alamandine以及MrgD受體激動(dòng)劑β-alanine都不能抑制AngⅡ的誘導(dǎo)作用，提示Alamandine是通過(guò)MrgD受體抑制NOX4介導(dǎo)的活性氧生成來(lái)調(diào)控HSC自噬，阻斷Ang誘導(dǎo)肝纖維化作用[30]。

1.5 抑制瘦素的表達(dá) 瘦素是由ob基因編碼的分泌型蛋白質(zhì)，主要由貯脂細(xì)胞產(chǎn)生。研究表明，活化的HSC中瘦素 mRNA和蛋白質(zhì)合成均增加。薛秀蘭等[31-32]設(shè)計(jì)瘦素小干擾RNA并將其轉(zhuǎn)入HSC中，同時(shí)將其轉(zhuǎn)染后的HSC導(dǎo)入肝纖維化大鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘦素小干擾RNA可以有效地抑制HSC細(xì)胞增殖，促進(jìn)HSC細(xì)胞凋亡，顯著抑制Col1和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的表達(dá)。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染瘦素shRNA的肝纖維化組織中，Col1及Col3的沉積程度均明顯下降，從而減緩了肝纖維化的發(fā)展程度[33]。

2 小干擾RNA技術(shù)促進(jìn)HSC的衰老、凋亡與死亡

各種不良刺激可以激活處于靜止?fàn)顟B(tài)的HSC，使其轉(zhuǎn)化為肝肌成纖維樣細(xì)胞，不斷生成ECM，導(dǎo)致肝纖維化。因此，促進(jìn)HSC的衰老、凋亡與死亡是減輕肝纖維化的有效途徑。

2.1 抑制半乳糖凝集素3的表達(dá) 半乳糖凝集素3(galectin 3,Gal-3)存在于多種組織和細(xì)胞內(nèi),參與細(xì)胞黏附、增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等多種病理生理過(guò)程，還參與腎、肺等纖維化形成過(guò)程[34]。Henderson等[35]研究發(fā)現(xiàn)，沉默Gal-3基因后，肌成纖維細(xì)胞活化和Col1的表達(dá)被阻斷，肝纖維化程度明顯減輕。有學(xué)者構(gòu)建Gal-3小干擾RNA并將其轉(zhuǎn)染至大鼠肝星狀細(xì)胞系rHSC-99細(xì)胞，也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖明顯受抑制，細(xì)胞凋亡率增高，細(xì)胞死亡率增加了1.7～2.2倍[36-37]。

2.2 抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2家族的表達(dá) B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因作為一種抗凋亡蛋白基因，可保護(hù)細(xì)胞免于病毒、氧化劑等刺激而引起的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在人肝纖維化過(guò)程中Bcl-2過(guò)表達(dá),可導(dǎo)致HSC持續(xù)活化，從而使慢性肝病遷延難愈[38]。Tian等[39]采用肝靶向納米顆粒將阿霉素(DOX)和Bcl-2小干擾RNA轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞內(nèi)，結(jié)果顯示，該干預(yù)可以誘導(dǎo)更多的HepG2細(xì)胞凋亡。另有學(xué)者構(gòu)建pGPU6-GFP-shRNA并將其轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HSC-T6的Bcl-2基因表達(dá)抑制率達(dá)80%，HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑，這表明沉默Bcl-2能有效抑制HSC中Bcl-2的表達(dá)及HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng),促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞凋亡[40]。

2.3 抑制核因子κB家族的表達(dá) 核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)參與細(xì)胞對(duì)外部刺激的反應(yīng),由p50和p65組成的異源二聚體是NF-κB家族成員最常見(jiàn)的形式。NF-κB的激活在細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和分化中起關(guān)鍵作用，且活化的NF-κB信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)其下游的靶基因如環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)、Bcl-2等,抑制細(xì)胞凋亡。Cui等[41]采用NF-κBp65小干擾RNA轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞72 h后，再用脂多糖刺激細(xì)胞1h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κBp65小干擾RNA可有效降低HSC-T6細(xì)胞中Bcl-2、Col1、α-SMA、TGFβ1、抗凋亡蛋白A1和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)的mRNA表達(dá)水平，MMP-2活性增高，促進(jìn)HSC凋亡。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，增高半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase3)活性可明顯促進(jìn)HSC凋亡，這表明p65小干擾RNA可以特異性地阻斷NF-κB基因表達(dá)，促進(jìn)HSC的凋亡[42]。此外，張彥亮等[43]發(fā)現(xiàn)核因子κB激酶抑制劑(inhibitor of nuclear factor kappaB kinase，IKKβ)小干擾RNA可使HSC的凋亡率顯著增加，Caspase3和Bcl-2相關(guān)x蛋白表達(dá)水平均明顯升高，而NF-κBp65和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平明顯下降，HSC凋亡增加，肝纖維化被抑制。

另外，NF-κB還可以直接促進(jìn)HSC的衰老和死亡。賈巖[44]研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇誘導(dǎo)的程序性壞死信號(hào)可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制促細(xì)胞生長(zhǎng)的NF-κB的mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)一步抑制骨膜蛋白介導(dǎo)的活化型HSC的遷移、黏附,進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)經(jīng)尾靜脈將COX2 shRNA慢病毒載體注入肝纖維化大鼠體內(nèi)后，肝纖維化組織細(xì)胞衰老指數(shù)明顯增加，α-SMA mRNA、COX-2 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，p53 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明COX2 shRNA可促進(jìn)肝纖維化組織細(xì)胞衰老[45]。

3 小干擾RNA技術(shù)直接調(diào)節(jié)ECM的合成與降解

多種病因可導(dǎo)致肝臟炎癥，使ECM沉積導(dǎo)致肝纖維化，而在這個(gè)過(guò)程中，這些病因可能均通過(guò)誘導(dǎo)相似的下游通路導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，因此，調(diào)控這個(gè)相似的下游通路或許可以阻斷ECM沉積，從而實(shí)現(xiàn)抗纖維化治療[46]。研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族端酶募集結(jié)構(gòu)域5(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family caspase recruitment domain containing 5,NLRC5)在肝纖維化中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致HSC中Col1和α-SMA的表達(dá)水平上調(diào)，而NLRC5小干擾RNA可降低Col1和α-SMA的表達(dá)水平[47]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)阻斷NLRC5表達(dá)可降低α-SMA、Col1α1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平，表明NLRC5可以通過(guò)干預(yù)HSC活化和ECM合成來(lái)調(diào)節(jié)或抑制與肝纖維化相關(guān)的關(guān)鍵基因[48]。

3.1 調(diào)節(jié)纖溶酶原激活物抑制劑1/尿激酶型纖溶酶原激活劑的平衡 由尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator，uPA)、纖溶酶、纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1)和MMP構(gòu)成的反應(yīng)體系是調(diào)節(jié)ECM降解的主要途徑，在肝纖維化形成和發(fā)展中起重要作用[49]。纖溶酶原激活物/纖溶酶系統(tǒng)位于纖維溶解系統(tǒng)的上游，能夠直接降解基質(zhì)成分，并通過(guò)激活MMP間接抑制ECM的沉積[49]。越來(lái)越多的研究表明纖溶酶原激活物/纖溶酶系統(tǒng)在調(diào)節(jié)ECM降解和沉積之間的平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[49-51]。Hu等[49]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)PAI-1表達(dá)水平后肝纖維化得到明顯改善，原因可能是下調(diào)PAI-1表達(dá)水平后，MMP-9及MMP-13表達(dá)水平上調(diào)，TIMP-1的表達(dá)水平下調(diào)，從而促進(jìn)ECM降解。還有學(xué)者將重組腺病毒質(zhì)粒pAdshPAI感染HSC-T6細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，Col1、Col3、α-SMA、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低，MMP-9和MMP-13 mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，肝細(xì)胞增殖加快，凋亡減少，HSC增殖減慢，G0/G1期時(shí)相HSC-T6細(xì)胞數(shù)目明顯增高，S期細(xì)胞數(shù)百分比明顯降低，提示沉默PAI-1可誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞周期靜止，抑制其增殖，減緩肝纖維化進(jìn)程[51]。

3.2 調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的平衡 肝纖維化的特征是ECM過(guò)度積累，主要病因是ECM生成的增加和ECM降解的減少。ECM降解減少是由于MMP和TIMP之間的不平衡，MMP幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，從而調(diào)節(jié)ECM降解過(guò)程。肝損傷后，TIMP-1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致ECM降解減少[4]。Li等[52]研究發(fā)現(xiàn)，沉默MMP-2可導(dǎo)致HSC存活率降低，纖維形成標(biāo)志物減少。TIMP-1在活化的HSC中呈高表達(dá)，并通過(guò)抑制基質(zhì)降解和細(xì)胞凋亡促進(jìn)肝纖維化，采用小干擾RNA沉默TIMP-1后可以減少HSC的增殖和纖維形成[52]。另有學(xué)者靶向沉默大鼠體內(nèi)TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，其上游細(xì)胞因子PDGF及其受體的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平降低，最終抑制HSCs活化增殖、減輕肝纖維化[53]。

4 小干擾RNA技術(shù)調(diào)控其他作用因子

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)是調(diào)節(jié)機(jī)體氧化還原反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)節(jié)多種抗氧化基因的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控肝臟的氧化損傷在肝纖維化的防治中發(fā)揮重要作用[54]。Prestigiacomo等[55]采用小干擾RNA技術(shù)敲除HSC細(xì)胞的Nrf2后發(fā)現(xiàn)，HSC被激活，HSC遷移及增殖增加，α-SMA和ECM表達(dá)水平升高。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Nrf2小干擾RNA可使TGF-β1誘導(dǎo)的活性氧物質(zhì)增多，促進(jìn)PAI-1表達(dá)水平及Smad3的磷酸化水平增高，促進(jìn)肝纖維化，提示Nrf2在肝纖維化形成與發(fā)展過(guò)程中有重要作用[56]。

自噬可以促進(jìn)HSC活化，腫瘤相關(guān)基因H19參與了自噬的調(diào)控,其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)HSC的活化，而長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)-H19已經(jīng)被證實(shí)是調(diào)控肝纖維化發(fā)生發(fā)展的重要分子[57]。有研究顯示，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白1(insulin-like growth factor binding protein-related protein 1，IGFBPrP1)是一種新發(fā)現(xiàn)的致肝纖維化因子，將小干擾RNA-H19轉(zhuǎn)入IGFBPrP1過(guò)表達(dá)的小鼠的肝星狀細(xì)胞株16 h后，IGFBPrP1 mRNA、LC3B mRNA、α-SMA mRNA的表達(dá)水平受到抑制，肝纖維化減輕[58]。此外，HSC的活化往往伴隨著脂滴的消失，LncRNA-H19與脂肪酸、膽汁酸和葡萄糖等多種代謝方式有關(guān)，將小干擾RNA LncRNA-H19轉(zhuǎn)入HSC后，HSC的活化被抑制，HSC中的脂滴含量增加，這提示降低LncRNA-H19的水平，可以恢復(fù)HSC脂滴含量,抑制HSC活化,改善肝纖維化[57]。

近年來(lái)，很多學(xué)者應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)減輕肝纖維化程度，如設(shè)計(jì)了人骨形成蛋白9小干擾RNA、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2小干擾RNA、上皮細(xì)胞黏附分子小干擾RNA、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體小干擾RNA、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白8樣分子2小干擾RNA，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)上述小干擾RNA技術(shù)具有很好地減輕肝纖維化的效果[59-63]。

5 小 結(jié)

肝纖維化是多種病因?qū)е碌母螕p傷之后的修復(fù)代償過(guò)程，是疾病進(jìn)展到肝硬化甚至肝癌的可逆階段。應(yīng)用小干擾RNA技術(shù)沉默肝纖維化過(guò)程中的關(guān)鍵基因，可以抑制HSC活化及增殖，促進(jìn)HSC凋亡，減少ECM沉積，從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化。但現(xiàn)階段小干擾RNA技術(shù)的應(yīng)用大多限于細(xì)胞與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尚未進(jìn)行臨床試驗(yàn)，其在臨床上的應(yīng)用效果如何還有待進(jìn)一步深入研究。