深海真菌Trichobotrys effuse DFFSCS021的次級代謝產(chǎn)物研究*

羅琴琴，陳子明，曾金鳳，曾 玲，鄭翠平，陸根蘭，王鋰韞，孫玉林**

(1.嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東湛江 524048；2.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江 524048)

0 引言

深海微生物對深海特殊生境(高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)等)的適應(yīng)，造就了其區(qū)別于陸生微生物的生物合成途徑和酶促反應(yīng)體系，因而具備產(chǎn)生具有新穎化學(xué)結(jié)構(gòu)和獨(dú)特生物活性代謝產(chǎn)物的能力，是開發(fā)天然活性藥物先導(dǎo)化合物的資源寶庫[1]。據(jù)統(tǒng)計，2017年被報道的來自微生物的海洋天然產(chǎn)物占總報道化合物的57%[2]。2018年，張長生等[3]著眼于生態(tài)環(huán)境、物種多樣性和應(yīng)用領(lǐng)域等方面，指出海洋微生物的研究是一個充滿著機(jī)遇和挑戰(zhàn)的領(lǐng)域。真菌是海洋微生物中重要的類群之一，其代謝產(chǎn)物豐富，且具有新奇的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及顯著的生物活性[4]，具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?017年，高嘯巍等[5]對深海真菌AcaromycesingoldiiFS121次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離得到化合物22-四烯-3-酮，該化合物在100 μg/mL濃度下，對SF-268、MCF-7、NCI-H460和HepG-2這4種腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出顯著的增殖抑制活性,其半數(shù)抑制率IC50值分別為5.3，6.5，12.2和6.1 μmol/L。2018年，馬新華等[6]對南海深海沉積物來源真菌Aspergillussp.MCCC3A400414次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行研究，從中分離得到5個化合物，即(22E,24R)-麥角甾-5,7,22-三烯-3β-醇、WIN 64821、diorcinol、9-十八碳烯酸和9,12-十八碳二烯酸。WIN 64821對腫瘤細(xì)胞株P(guān)ANC-1、MCF-7、HepG-2和A549表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性，其IC50值在7.14—15.78 μmol/L[6]。2019年，陳閃沖等[7]從深海真菌Phomopsistersa的次級代謝產(chǎn)物中分離得到5α，8α-表二氧麥角甾-6,22-二烯-3β-醇和麥角甾醇，這2個化合物對SF-268、MCF-7、HepG-2和A549 4種腫瘤細(xì)胞株具有一定的細(xì)胞毒活性。

雖然深海真菌的次級代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)豐富、活性廣泛，但開發(fā)程度較低，仍存在較大的挖掘空間。真菌TrichobotryseffuseDFFSCS021分離自我國南海北部2 403 m深的海底沉積物中，純菌株菌落呈絨狀，展開，有凹溝，直徑2—3 cm，中央淡粉色周圍白色，中間有小氣孔。2016年，Sun等[8]從該菌中分離得到3個新的大環(huán)內(nèi)酯類化合物trichobotryside A、trichobotrysides B-C，其中trichobotryside A具有較強(qiáng)的抗生物污損活性，對草苔蟲和藤壺幼蟲的半數(shù)最大效應(yīng)濃度(EC50)值分別為7.3和2.5 μg/mL。為進(jìn)一步發(fā)掘結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的新型化合物，本實(shí)驗(yàn)對真菌TrichobotryseffuseDFFSCS021的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，以期豐富其次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型，為海洋藥物先導(dǎo)化合物的開發(fā)與利用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Bruker Avance DRX-500MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(內(nèi)標(biāo)為TMS：德國布魯克儀器有限公司)、N-1210B型(EYELA)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)、LC-20AD型高效液相色譜儀(島津企業(yè)管理(中國)有限公司)、YMC-PACKODS-A型分析色譜柱(規(guī)格：150×4.6 mml.D.S - 5 μm，12 nm)、YMC-PACKODS-A型半制備色譜柱(規(guī)格：250×10 mml.D.S-5 μm，12 nm)，Bruker microTOF-QⅡ高分辨電噴霧質(zhì)譜儀(HR-ESI-MS)、Bruker amaZonSL低分辨電噴霧質(zhì)譜儀(ESI-MS)(布魯克(北京)科技有限公司)，iMark酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)、MCO-175型CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司)、SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)、ZF-7型三用紫外分析儀(上海顧村電光儀器廠)、CCA-1112A型冷卻水循環(huán)裝置(上海愛郎儀器有限公司)、SB-800DT型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)、Direct-Q5UV-R型超純水一體機(jī)(默克密理博(上海)實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技有限公司)、JJ-2型組織勻漿機(jī)(常州澳華儀器有限公司)，所用試劑均為分析純。

深海真菌TrichobotryseffuseDFFSCS021，采自南海北部(112°30.203′E,18°1.654′N) 2 403 m深的海底沉積物中，經(jīng)分離培養(yǎng)純化后得到純菌株保藏于中國科學(xué)院海洋微生物中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定

深海真菌TrichobotryseffuseDFFSCS021的總DNA按照文獻(xiàn)[9]方法提取，設(shè)計引物對總DNA中的ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物并連接到PCR21載體(Invitrogen)中。16S rRNA基因序列送生工生物工程(上海)股份有限公司測定，將測得的16S rRNA基因序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)其與T.effusaisolate 1179 (accession No.KJ630313)相似度為99%。

1.2.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

從PDA固體培養(yǎng)基平板上，用接種環(huán)刮取2環(huán)該菌株的孢子,接種于盛有PDA液體培養(yǎng)基的三角錐形瓶中，置于搖床上180 r/min、28℃恒溫培養(yǎng)3—7 d，待三角錐形瓶中菌絲體生長成球形黃豆粒大小時，將生長好的種子液接種到含80 g大米培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，每瓶接種10 mL，共接種50瓶，28℃靜置30 d。

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，海鹽36 g，蒸餾水溶解定容至1 000 mL。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加20 g瓊脂。

大米培養(yǎng)基：大米 80 g，酵母膏 0.4 g，葡萄糖0.4 g，海鹽 3.6 g，蒸餾水溶解定容至120 mL。

1.2.3 高效液相色譜(HPLC)分析及半制備

分析條件：流速為1 mL/min，流動相為MeOH/H2O體系，檢測波長為210，254，280，360 nm，柱溫箱溫度為35℃，進(jìn)樣量為5 μL。半制備條件：流速為3 mL/min，流動相為MeOH/H2O體系，檢測波長為210，254，280，360 nm，柱溫箱溫度為35℃，進(jìn)樣量為60 μL。分析時根據(jù)化合物的極性來調(diào)整MeOH/H2O的比例，以達(dá)到半制備的目的。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

將發(fā)酵好的大米培養(yǎng)基用80%丙酮-水浸泡，接著用組織勻漿機(jī)破壁，之后超聲30 min，用布氏漏斗抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去丙酮，將剩下的水相再用乙酸乙酯進(jìn)行萃取(V乙酸乙酯∶V水=2∶1)，靜置分層，取上層乙酸乙酯相進(jìn)行濃縮稱量，共得到浸膏30 g。

將乙酸乙酯萃取的浸膏30 g 經(jīng)硅膠( 100—200目)柱層析，以氯仿/甲醇(體積比1∶0—0∶1)進(jìn)行梯度洗脫，最后合并為7個流分( Fr 01—Fr 07)。

流分Fr 05 (4 g)經(jīng)硅膠 (200—300目)柱層析，以氯仿/甲醇 (體積比20∶1—1∶1)梯度進(jìn)行洗脫，得到4個亞流分 (Fr 0501—Fr 0504)，亞流分Fr 0502 (280 mg)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析得到4個亞流分 (Fr 050201—Fr 050204)，亞流分Fr 050204(80 mg)經(jīng)半制備HPLC進(jìn)一步純化得到化合物1(V甲醇∶V水=10∶90，tR= 20.5 min，26 mg)。

流分Fr 03 (7.5 g)經(jīng)硅膠 (200—300目)柱層析，以氯仿/丙酮 (體積比50∶1—0∶1)梯度進(jìn)行洗脫，得到4個亞流分 (Fr 0301—Fr 0304)，亞流分Fr 0302 (1 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析得到4個亞流分 (Fr 030201—Fr 030204)，亞流分Fr 030201 (65 mg)經(jīng)硅膠 (200—300目)柱層析，以氯仿/丙酮 (體積比20∶1)等度進(jìn)行洗脫，得到化合物2(13.5 mg)。

流分Fr 04 (0.7 g)經(jīng)硅膠 (200—300目)柱層析，以氯仿/甲醇 (體積比20∶1—0∶1)梯度進(jìn)行洗脫，得到4個亞流分 (Fr 0401—Fr 0404)，亞流分Fr 0401 (244.1 mg)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析得到3個亞流分 (Fr 040101—Fr 040103)，亞流分Fr 040103 (45.5 mg)經(jīng)半制備HPLC進(jìn)一步純化得到化合物4(V甲醇∶V水=35∶75) ，tR=30.5 min，4.9 mg)。亞流分Fr 0402 (122.6 mg)經(jīng)半制備HPLC進(jìn)一步純化得到化合物3(V甲醇∶V水=33∶77，tR=28 min，15 mg)。

流分Fr 02 (0.52 g)經(jīng)硅膠 (200—300目)柱層析，以石油醚/氯仿 (體積比50∶1—0∶1)梯度進(jìn)行洗脫，得到3個亞流分 (Fr 0201—Fr 0203)，亞流分Fr 0201 (175.9 mg)經(jīng)半制備HPLC進(jìn)一步純化得到化合物5(V甲醇∶V水=85∶15，tR=44 min，3.1 mg)。

1.2.5 細(xì)胞毒活性測定

參照文獻(xiàn)[10]的方法，取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至2×105個/mL，按每孔200 μL加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放入37℃培養(yǎng)箱中并通入體積分?jǐn)?shù)5% CO2，培養(yǎng)4 h?；衔飿悠贩謩e設(shè)定5個濃度梯度，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，同時設(shè)陽性、陰性對照，每孔腫瘤細(xì)胞中分別加樣品液或空白液2 μL，再培養(yǎng)72 h。然后每孔加四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在37℃、2 000 r/min條件下，離心8 min，吸去上清液。每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，在微量振蕩器上振蕩15 min，至結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測定每孔在570 nm處的吸光值(OD值)。取3孔平均OD值，按對細(xì)胞增殖的抑制率(IR，%)=[(OD空白-OD樣品)/OD空白]×100%,計算樣品IR，并采用bliss法計算出半數(shù)抑制率IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1—5的結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1—5的結(jié)構(gòu)

化合物1：白色無定形粉末。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δH7.12(1H,d,J= 7.5 Hz,H-6),5.74(1H,d,J=7.5 Hz,H-5),3.80(3H,m,1-NCH3),3.35(3H,m,3-NCH3)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:162.3(s,C-4),151.4(s,C-2),144.6(d,J=5.5 Hz,C-6),102.4(d,J=5.5 Hz,C-5),36.7(s,3H),28.2(s,3H)。低分辨質(zhì)譜(+)-ESIMS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z141.1[M+H]+和281.1[2M+H]+，(-)-ESIMS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z139.3 [M-H]-。上述氫譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)[11]一致，故鑒定該化合物為1,3-dimethyluracil。

化合物2：無色油狀物。1H NMR (500 MHz,CDCl3)δH7.05(1H,dd,J1=7.0 Hz,J2=15.5 Hz,H-3),6.78(1H,dd,J1=6.5 Hz,J2=16.0 Hz,H-7),6.09(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),5.85(1H,d,J=15.5 Hz,H-2),2.29(2H,m,H-4),2.28(2H,m,H-6),2.26(3H,s,H-10),1.67(2H,m,H-5)；13C NMR(125 MHz,CDCl3)δC198.5(C,C-9),170.6(C,C-1),150.8(CH,C-3),146.9(CH,C-7),131.8(CH,C-8),121.2(CH,C-2),31.7(CH2,C-4),31.6(CH2,C-6),21.7(CH3,C-10),26.3(CH2,C-5)。(+) -HRESIMS 給出的分子式為C10H15O3(m/z183.101 5 [M+H]+，calcd.for C10H15O3,183.101 6)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]一致，故鑒定該化合物為[2E,7E]-9-oxo-2,7-decadienoic acid。

化合物3：無色粉末。1H NMR (500 MHz,CDCl3)δH6.88(1H,d,J=10.0 Hz,H-1),5.80(1H,s,H-9),5.93(1H,d,J=10.0 Hz,H-2),4.24 (1H,d,J=7.0 Hz,H-8),3.87(1H,m,H-7),2.45(1H,dd,J1=6.5 Hz,J2=13.5 Hz,H-4),1.97(1H,dd,J1=2.5 Hz,J2=12.5 Hz,H-6a),1.65(1H,t,J=12.5 Hz,H-6b),1.07(3H,s,H-12),1.06(3H,s,H-11)；13C NMR (125 MHz,CDCl3)δC200.8(C,C-3),143.8(CH,C-1),142.1(C,C-10),131.8(CH,C-9),127.2(CH,C-2),74.4(CH,C-8),70.0(CH,C-7),53.2(CH,C-4),42.0(CH2,C-6),41.2(C,C-5),20.1(CH3,C-12),7.2(CH3,C-11)。(+) -HRESIMS 給出的分子式為C12H17O3(m/z209.078 7 [M+H]+，calcd.for C12H17O3,209.078 1)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道一致，故鑒定該化合物為periconianones H。

化合物4：無色粉末。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δH7.21(1H,d,J=10.0 Hz,H-9),6.30(1H,d,J=10.0 Hz,H-8),6.53(1H,s,H-1),6.38(1H,s,H-4),2.53(1H,dd,J1=7.0 Hz,J2=13.5 Hz,H-6),1.25(3H,s,H-11),1.31(3H,d,J=7.0 Hz,H-12)；13C NMR(125 MHz,CDCl3)δC198.6(C,C-7),181.1(C,C-2),160.8(C,C-10),147.3(C,C-3),141.6(CH,C-9),131.8(CH,C-8),125.9(CH,C-1),123.1(CH,C-4),50.9(CH,C-6),45.2(C,C-5),23.4(CH3,C-11),8.2(CH3,C-12)。(+) -HRESIMS 給出的分子式為C12H13O3(m/z205.086 0 [M+H]+，calcd.for C12H13O3,205.085 9)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道一致，故鑒定該化合物為botryosphaeridione。

化合物5：無色油狀物。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δH7.48(1H,m,H-6),7.56(1H,m,H-4′),7.63(2H,m,H-6′,H-2′),7.49(2H,m,H-5′,H-3′),6.40(1H,dd,J1=2.5 Hz,J2=9.0 Hz,H-5),6.50(1H,d,J=2.5 Hz,H-3),4.02(2H,m,H-8),1.30(2H,m,H-13),1.26(2H,m,H-11),1.33(2H,m,H-12),1.80(2H,m,H-9),1.46(2H,m,H-10),1.28(2H,m,H-14),0.89(3H,s,H-15)；13C NMR(125 MHz,CDCl3)δC200.1(C,C-7),166.3(C,C-2),165.8(C,C-4),138.3(C,C-1′),135.2(CH,C-6),131.4 (CH,C-4′),128.9(CH,C-6′,C-2′),128.3(CH,C-5′,C-3′),113.0(C,C-1),107.8(CH,C-5),101.5(CH,C-3),68.5(CH2,C-8),31.8(CH2,C-13),29.3(CH2,C-11),29.2(CH2,C-12),28.9(CH2,C-9),26.0(CH2,C-10),22.7(CH2,C-14),11.4(CH3,C-15)。(+) -HRESIMS 給出的分子式為C21H27O3(m/z327.196 1 [M+H]+，calcd.for C21H27O3,327.195 5)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道一致，故鑒定該化合物為2-hydroxy-(4-octyloxy)benzophenone。

2.2 化合物活性測定

化合物3對人肝癌細(xì)胞 (HepG-2)、人食管癌細(xì)胞 (Eca109)、人急性骨髓白血病細(xì)胞 (KG-1a)、人前列腺癌細(xì)胞 (PC-3)和人喉癌細(xì)胞 (Hep2)均未顯示出細(xì)胞毒活性，僅對人宮頸癌細(xì)胞 (Hela)顯示出弱的抑制活性，其IC50值為20.5 μmol/L (表1)。該結(jié)果與文獻(xiàn)[13]報道的化合物periconianones H對Hela顯示出弱的細(xì)胞毒活性(IC50=16.5 μmol/L)的結(jié)果較為一致。

表1 化合物3的細(xì)胞毒活性測試結(jié)果

3 結(jié)論

本研究對來源于南海北部2 403 m深的海底沉積物中1株真菌TrichobotryseffuseDFFSCS021的乙酸乙酯萃取物進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中獲得5個單體化合物，分別為1,3-dimethyluracil (1)、[2E,7E]-9-oxo-2,7-decadienoic acid (2)、periconianones H (3)、botryosphaeridione (4)和2-hydroxy-(4-octyloxy) benzophenone (5)，均為首次從該菌株中分離得到。對化合物3進(jìn)行細(xì)胞毒活性篩選，結(jié)果表明該化合物對5株腫瘤細(xì)胞株HepG-2、Eca109、KG-1a、PC-3和Hep2均未顯示出細(xì)胞毒活性，僅對Hela顯示弱的抑制活性。另外，據(jù)報道，化合物4對雙子葉植物萵苣的種子萌發(fā)具有顯著的抑制活性[14]，化合物2，5的活性數(shù)據(jù)未見報道。接下來將對剩余的4個化合物進(jìn)行多種生物活性篩選，例如抑制種子萌發(fā)、抗菌以及抗生物污損等，以期為進(jìn)一步研究該菌屬的海洋真菌提供活性數(shù)據(jù)和參考資料。