珊瑚來(lái)源放線菌Streptomyces albidoflavus M13.1的次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)成分研究*

林玉坤，謝春蘭，賈凌云，張改云，楊獻(xiàn)文，潘英妮**

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110016；2.自然資源部第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，福建廈門 361005)

0 引言

海洋放線菌是海洋微生物的重要組成部分，也是產(chǎn)生多種天然化合物的重要來(lái)源。鏈霉菌是海洋放線菌中研究最多的一個(gè)菌屬，截至2016年從海洋鏈霉菌中分離得到的次級(jí)代謝產(chǎn)物有547個(gè)[1]，包括生物堿類、甾體類、萜類、聚酮類等化合物，其中生物堿類化合物是主要的結(jié)構(gòu)類型。迄今為止，大多數(shù)鏈霉屬放線菌是從海洋沉積物中分離得到的，而從珊瑚中分離到的鏈霉屬放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)珊瑚來(lái)源的鏈霉屬放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，豐富珊瑚來(lái)源的鏈霉屬放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類型，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)珊瑚來(lái)源鏈霉屬放線菌的化學(xué)成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器和試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(N-1100，上海誒朗科技有限公司)，核磁共振儀(Bruker Avance Ⅱ 400 MHz)，高分辨質(zhì)譜儀(Waters Xevo G2 Q-TOF)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-800，上海元析儀器有限公司)，中壓制備體系(C-605，BUCHI)，反向色譜柱(ODS，YMC)，柱層層析硅膠和薄層層析硅膠板(山東省煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品)，Sephadex LH-20凝膠(GE Healthcare Bio-Sciences AB)，分析純?cè)噭?廣州市化學(xué)試劑廠)。

1.1.2 菌種

放線菌分離自海南瓊東海域蜂巢珊瑚樣品，經(jīng)16S rRNA序列分析鑒定為StreptomycesalbidoflavusM13.1[2]。菌種保存于廈門海洋微生物菌種保藏管理中心。

1.2 菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)

將保存于-80℃甘油管的菌株接種到已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基[3]上，于28℃恒溫箱中培養(yǎng)3—5 d；挑取單菌落接種到2216E液體培養(yǎng)基中，于28℃，180 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d，作為發(fā)酵的種子液；取20 mL發(fā)酵種子液接種至裝有380 mL液體培養(yǎng)基[4](含有淀粉20 g、葡萄糖10 g、酵母提取粉5 g、細(xì)菌學(xué)蛋白胨5 g、海鹽30 g)的1 L錐形瓶中，共接種100瓶，于28℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d，共得到40 L發(fā)酵液。

1.3 提取與分離

將發(fā)酵液離心得到上清液，用等體積的乙酸乙酯萃取上清液，萃取3次后合并萃取液，減壓濃縮得到乙酸乙酯粗提物21 g。將得到的粗提物用硅膠拌樣后置于柱層析硅膠中，用洗脫劑石油醚和二氯甲烷-甲醇(體積比50∶1→1∶1)依次進(jìn)行洗脫，在薄層硅膠板上點(diǎn)樣、展開(kāi)、顯色后，將其劃為10個(gè)餾分(Fr1-Fr10)。

Fr3 (69.8 mg)經(jīng)過(guò)ODS反相硅膠中壓色譜柱甲醇-水(體積比50∶50→100∶0)、Sephadex LH-20凝膠洗脫得到化合物1(25.8 mg)、2(46.8 mg)。Fr5(186.5 mg)經(jīng)過(guò)ODS反相硅膠中壓色譜柱甲醇-水(體積比60∶40→100∶0)、Sephadex LH-20凝膠及薄層色譜板制備得到化合物3(1.5 mg)。Fr7(1.04 g)經(jīng)過(guò)ODS反相硅膠中壓色譜柱甲醇-水(體積比15∶85→100∶0)、Sephadex LH-20凝膠甲醇-水洗脫得到化合物4(4.1 mg)和5(5.1 mg)。Fr8(419.2 mg)經(jīng)過(guò)ODS反相硅膠中壓色譜柱甲醇-水(體積比50∶50→100∶0)、Sephadex LH-20凝膠洗脫得到化合物6(66.2 mg)、7(3.5 mg)、8(57.8 mg)。Fr9(317.6 mg)經(jīng)過(guò)ODS反相硅膠中壓色譜柱甲醇-水(體積比15∶85→100∶0)、Sephadex LH-20凝膠洗脫得到化合物9(2.4 mg)、10(4.7 mg)。最后一段Fr10(611.0 mg)經(jīng)過(guò)ODS反相硅膠中壓色譜柱甲醇-水(體積比25∶75→100∶0)、Sephadex LH-20凝膠及乙腈-水(體積比10∶90→95∶5)的HPLC液相色譜柱純化得到化合物11(13.6 mg)、12(2.0 mg)、13(2.6 mg)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z: 247.133 9 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH7.71 (1H,dd,J=5.7,1.1 Hz,H-3),6.11(1H,dd,J=5.7,1.9 Hz,H-2),5.13(1H,m,H-4),2.57(1H,m,H-10),2.14 (3H,s,H-12),1.80(1H,m,H-5a),1.60—1.69(2H,m,H-9a,H-5b),1.34—1.46(7H,m),1.06(3H,d,J=7.0 Hz,H-13);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC216.5(C-11),176.4(C-1),160.2(C-3),122.1(C-2),86.1(C-4),48.6(C-10),34.5(C-5),34.3(C-9),30.9(C-7),28.7(C-12),28.5(C-8),26.4(C-6),17.1(C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為5-(6-methyl-7-oxooctyl)furan-2(5H)-one。

化合物2：白色粉末，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z: 319.081 6 [2M+Na]+。1H-NMR (CD3OD,400 MHz),δH7.60—7.38 (5H,m),7.67 (1H,d,J=16.0 Hz,H-8),6.47 (1H,d,J=16.0 Hz,H-7);13C-NMR (CD3OD,100 MHz),δC170.9 (COOH),146.9 (C-1),136.3 (C-4),131.9 (C-8),130.5 (C-3,C-5),129.7 (C-2,C-6),119.4 (C-7)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為肉桂酸。

化合物3：黃色粉末，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z:211.1143 [M+H]+。1H-NMR (CD3OD,400 MHz),δH4.25 (1H,t,J=6.92 Hz,H-9),4.12 (1H,m,H-6),3.51—3.48 (2H,m,H-3),2.32—2.26 (2H,m,H-5),2.06—1.83 (4H,m),1.48—1.53 (1H,m),0.95 (3H,d,J=2.68 Hz,H-12),0.94 (3H,d,J=2.44 Hz,H-13);13C-NMR (CD3OD,100 MHz),δC173.3(C-1),169.4(C-7),60.8(C-6),55.1(C-9),46.9 (C-3),39.9 (C-10),29.6 (C-5),26.2 (C-11),24.1 (C-4),23.8 (C-12),22.7 (C-13)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為環(huán)(亮-脯)二肽。

化合物4：白色粉末，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z:265.144 6 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH7.71(1H,d,J=5.7Hz,H-4),6.11(1H,dd,J=5.7,1.5 Hz,H-3),5.14(1H,m,H-5),3.56(1H,d,J=6.4 Hz,H-7′),1.82—1.64(2H,m,H-1′),1.49—1.36(8H,m,H-2′,3′,4′,5′),1.11(3H,d,J=6.4 Hz,H-8′),1.07(3H,s,6′-Me);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC176.4(C-2),160.2(C-4),122.0(C-3),86.1(C-5),76.2(C-6′),74.6(C-7′),39.5(C-5′),34.5 (C-1′),31.6(C-4′),26.5(C-2′),24.7(C-3′),22.1(C6′-Me),18.1 (C-8′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為5-(6,7-dihydroxy-6-methyloctyl)furan-2(5H)-one。

化合物5：白色粉末，1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH4.20(2H,m,H-3,6),3.51(2H,m,H-9),2.50—2.00(4H,m,H-7,H-8),1.37(3H,d,J=6.92 Hz,H-10);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC173.1(C-2),169.6(C-5),61.0(C-6),52.6(C-3),46.9(C-9),29.7(C-7),24.1(C-8),16.2(C-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為環(huán)(丙-脯)二肽。

化合物6：白色粉末，1H-NMR (CD3OD,400 MHz),δH7.58(1H,d,J=15.92 Hz,H-7),7.43(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),6.81(2H,d,J=8.35 Hz,H-3,5),6.26(1H,d,J=15.88 Hz,H-8);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC171.2(C-9),161.1(C-4),146.5(C-7),131.1(C-2,6),127.2(C-1),115.8(C-3,5),115.8(C-8)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為香豆酸。

化合物7：白色粉末，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z: 207.110 7 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH4.0(1H,d,J=0.72 Hz,H-3),3.93(1H,dd,J=8.4,4.72 Hz,H-6),1.75(2H,m,H-7),1.63(1H,m,H-8),1.44(3H,d,J=7.08 Hz,H-11),0.96(6H,t,J=6.84 Hz,H-9,10);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC172.0(C-2),171.5(C-5),55.1(C-6),52.4(C-3),45.6(C-7),25.8(C-8),24.0(C-10),22.6(C-9),21.4(C-11)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為環(huán)(丙-亮)二肽。

化合物8：白色粉末，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z:202.084 8 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH7.04(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),6.73(2H,d,J=8.44 Hz,H-3′,5′),3.34(2H,t,J=7.24 Hz,H-1),2.69(2H,t,J=7.6 Hz,H-2),1.91(3H,s,H-Me);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC173.7(C=O),157.3(C-4′),131.7(C-1′),131.2(C-2′,6′),116.7 (C-3′,5′),42.9(C-1),36.1(C-2),23.0(Me)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為N-乙?；野?。

化合物9：白色粉末，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z: 283.107 1 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH7.30—7.20(5H,m,H-Ar),4.48(1H,t,J=4.96 Hz,H-4),4.35(1H,dd,J=11.6,4.1 Hz,H-6),4.27(1H,t,J=4.72 Hz,H-9),3.70(2H,dd,J=13.0,5.08 Hz,H-3),3.27—3.13(2H,m,H-5),2.05(2H,dd,J=13.5,5.92 Hz,H-10);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC171.8(C-1),167.6(C-7),137.9(C-1′),131.5(C-2′,6′),130.0(C-3′,5′),128.6(C-4′),69.0(C-4),58.8(C-6),58.1(C-9),55.7 (C-3),39.4(C-5),38.5(C-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為環(huán)(4-羥基-脯-苯丙)二肽。

化合物10：白色粉末，1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH4.00(1H,q,J=7 Hz,H-2),3.91(2H,brs,H-2′),1.43(3H,d,J=7.04 Hz,H-3);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC172.1(C-1),169.3(C-1′),52.2(C-2),45.9(C-2′),19.9(C-3)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為環(huán)(甘-丙)二肽。

化合物11：白色粉末，1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH4.22(1H,m,H-2),4.09(1H,d,J=16.8 Hz,H-2′),3.73(1H,d,J=16.8 Hz,H-2′),3.55—3.50(2H,m,H-5),2.30—1.85(4H,m,H-3,4);13C-NMR (CD3OD,100 MHz),δC172.5(C-1),166.9(C-1′),60.3(C-2),47.5(C-2′),46.8(C-5),29.9(C-3),23.8(C-4)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為環(huán)(甘-脯)二肽。

化合物12：白色晶體，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z：267.1 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH8.00(1H,d,J=8.08 Hz,H-6),5.88(1H,d,J=4.56 Hz,H-1′),5.69 (1H,d,J=8.08 Hz,H-5),4.15(2H,m,H-2′,3′),3.99(1H,m,H-4′),3.38(2H,dd,J=12.28,2.72 Hz,H-5′);13C-NMR(CD3OD,100 MHz),δC166.8(C-4),153.0(C-2),143.2(C-6),103.2(C-5),91.2(C-1′),86.8(C-4′),76.2(C-3′),71.8(C-2′),62.8(C-5′)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為尿嘧啶核苷。

化合物13：白色粉末，高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MSm/z:281.075 3 [M+Na]+。1H-NMR(CD3OD,400 MHz),δH8.08(1H,d,J=8.12 Hz,H-6),5.94(1H,d,J=3.6 Hz,H-1′),5.68(1H,d,J=8.08 Hz,H-5),4.23(1H,t,J=5.6 Hz,H-3′),3.96(1H,m,H-4′),3.84(2H,m,H-5′),3.75 (1H,dd,J=12.36,2.92 Hz,H-2′),3.51(3H,s,-OCH3);13C-NMR (CD3OD,100 MHz),δC166.7(C-4),152.7(C-2),143(C-6),103.0(C-5),89.3(C-1′),86.6(C-4′),85.5(C-2′),70.3(C-3′),62.1(C-5′),59.3(C2′-OMe)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]與文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物為2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷。

化合物1—13的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1—13結(jié)構(gòu)

2.2 化合物活性測(cè)定結(jié)果

采用 CCK-8法，測(cè)定13個(gè)化合物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞(HELA)、食管癌細(xì)胞(ECA-109)、肝癌細(xì)胞(BEL-7402)、膀胱癌細(xì)胞(BIU-87)、胰腺癌細(xì)(PANC-1)的抗細(xì)胞增殖活性。結(jié)果顯示，13個(gè)化合物均無(wú)明顯的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性。

3 結(jié)論

從放線菌S.albidoflavusM13.1次級(jí)代謝產(chǎn)物中，分離獲得13個(gè)化合物。經(jīng)鑒定，其中有6個(gè)二肽類化合物，分別為環(huán)(亮-脯)二肽(3)、環(huán)(丙-脯)二肽(5)、環(huán)(丙-亮)二肽(7)、環(huán)(4-羥基-脯-苯丙)二肽(9)、環(huán)(甘-丙)二肽(10)、環(huán)(甘-脯)二肽(11)；有2個(gè)呋喃類化合物，分別為5-(6-methyl-7-oxooctyl)furan-2(5H)-one(1)、5-(6,7-dihydroxy-6-methyloctyl)furan-2(5H) -one(4)；有2個(gè)核苷類化合物，分別為尿嘧啶核苷(12)、2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷(13)；此外還有1個(gè)肉桂酸(2)、1個(gè)香豆酸(6)、1個(gè)N-乙酰基酪胺(8)。以上13個(gè)化合物均為首次從珊瑚來(lái)源的S.albidoflavusM13.1 樣品中分離得到。對(duì)13個(gè)化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)明顯的活性化學(xué)成分。