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      海洋來源真菌的曲酸發(fā)酵條件優(yōu)化*

      2021-01-14 08:45:08梁芳萍邢楠楠劉永宏高程海張杰良陳顯強(qiáng)
      廣西科學(xué) 2020年5期
      關(guān)鍵詞:海鹽鹽度真菌

      梁芳萍,邢楠楠,劉永宏,高程海,張杰良,陳顯強(qiáng)**

      (1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院,廣西南寧 530200;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心/廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530200;3.汕頭大學(xué)理學(xué)院生物系,廣東汕頭 515063)

      0 引言

      曲酸(Kojic acid)又名麴酸、曲菌酸,具有抗氧化、抗菌、殺蟲、抗腫瘤等廣泛的生物活性,曲酸及其衍生物現(xiàn)已開發(fā)成為護(hù)膚霜、洗液、肥皂和牙科護(hù)理產(chǎn)品,廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和制藥工業(yè)等領(lǐng)域[1-3]。醫(yī)學(xué)方面,有研究表明曲酸有望成為治療人角膜內(nèi)皮細(xì)胞衰老相關(guān)疾病的藥物[4],以及治療和預(yù)防馬爾尼菲藍(lán)狀菌感染的重要輔助藥物[5,6];另外,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明曲酸具有很強(qiáng)的抗弓形蟲活性[7]。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,曲酸可作為防治飛蝗的有機(jī)磷類殺蟲劑的增效劑[8]。在食品方面,曲酸可保鮮蔬菜,提高食品的保藏品質(zhì)[9]。雖然一些研究發(fā)現(xiàn)曲酸具有一定的致癌作用[10],但是在有效劑量濃度下曲酸的使用是安全的[1,3]。隨著研究的深入,曲酸的應(yīng)用范圍將會繼續(xù)擴(kuò)大。

      生產(chǎn)曲酸的菌種多見于曲霉屬和青霉屬真菌,如Aspergillusoryzae、A.flavus、A.tamarii、Penicilliumcitrinum、P.griseofulvum、P.purpurogenum和P.rubrum等[11]。這些真菌的曲酸產(chǎn)量與其發(fā)酵工藝密切相關(guān),發(fā)酵工藝的優(yōu)化是提高曲酸產(chǎn)量的研究熱點(diǎn)。目前,曲酸發(fā)酵工藝的優(yōu)化主要包括碳源、氮源、礦物質(zhì)元素、促進(jìn)劑等培養(yǎng)基成分優(yōu)化和發(fā)酵條件優(yōu)化[12,13]。在曲酸生產(chǎn)中,葡萄糖、蔗糖和淀粉通常用作碳源,蛋白胨和酵母膏則是常用的氮源。另外,部分農(nóng)工副產(chǎn)品也可用作曲酸發(fā)酵的培養(yǎng)基成分,如豆渣、黃漿水、木薯淀粉、白薯粉淀粉酶水解液、柑橘皮渣、豆餅粉、鰹油等[14-16]。魏少鵬等[17]研究發(fā)現(xiàn)在蔗糖與葡萄糖組合作為碳源時(shí),曲酸產(chǎn)量明顯高于單一碳源,蛋白胨與酵母提取物等有機(jī)氮比無機(jī)氮更有利于曲酸產(chǎn)量的提高。而低濃度的甲醇、乙醇、氯丙醇等作為添加劑也能夠提高曲酸產(chǎn)量[18]。

      本研究從海洋沉積物中發(fā)現(xiàn)一株曲霉Aspergillussp.GXIMD02003,其能夠在大米培養(yǎng)基中產(chǎn)曲酸。為進(jìn)一步提高該真菌的曲酸產(chǎn)量,本研究對海鹽含量和發(fā)酵時(shí)間對曲酸產(chǎn)量的影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。曲酸生產(chǎn)在工業(yè)化生產(chǎn)和工藝研究中多采用液體培養(yǎng)基發(fā)酵,但其所需設(shè)備和原料成本較高,因此本研究使用大米固體培養(yǎng)基,旨在規(guī)避曲酸生產(chǎn)中添加原料復(fù)雜、成本高、生產(chǎn)過程煩瑣的問題,簡化生產(chǎn)過程,從而獲得成本低廉的曲酸原料。

      1 材料與方法

      1.1 試劑與培養(yǎng)基

      曲酸對照品,廣州分析測試中心科力技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn);麥芽提取粉,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司生產(chǎn);海鹽,廣東省鹽業(yè)集團(tuán)多品種鹽股份有限公司生產(chǎn);大米,貴州鴻穗農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司生產(chǎn);甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮分析級試劑,均購買于成都市科隆化學(xué)品有限公司;甲酸(分析純)和磷酸(分析純),天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);磷酸二氫鉀(分析純),廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn);甲醇(色譜純),上海星可高純?nèi)軇┯邢薰旧a(chǎn)。

      種子培養(yǎng)基:稱取海鹽3 g、麥芽提取粉1.5 g于500 mL錐形瓶中,加入100 mL水和適量玻璃珠,搖勻,在121℃下高壓滅菌20 min,冷卻后備用。

      大米固體培養(yǎng)基:稱取75 g大米放入500 mL錐形瓶中,加入75 mL一定濃度的海鹽水,搖勻,在121℃下高壓滅菌20 min,冷卻后備用。

      1.2 儀器

      LC-2030C 3D Plus型高效液相色譜儀(日本島津),N-1300V-WB型小型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司),ZWYR-2102型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司),HR1500-IIB2型生物安全柜(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司),MLS-3781L-PC型高壓滅菌鍋(SANYO Techno Solutions Tottori Co,Ltd.),SB-5200D型超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

      1.3 菌種

      菌株分離于廣西潿洲島的海泥,經(jīng)過ITS rDNA基因序列分析,鑒定該菌株為真菌Aspergillussp.,保藏于廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院,編號為GXIMD02003。

      1.4 方法

      1.4.1 種子液制備

      在生物安全柜中將平板培養(yǎng)基的菌種接種于種子培養(yǎng)基中,在25℃、180 r/min下培養(yǎng)72 h作為種子液。

      1.4.2 曲酸發(fā)酵條件考察

      (1)最佳鹽度

      配制鹽度分別為0、1%、2%、3%、5%、7%的海鹽水溶液,按1.1節(jié)方法制備大米固體培養(yǎng)基,分別接入種子液5 mL,25℃靜置發(fā)酵30 d,每個(gè)濃度取3份樣品測定曲酸含量,取平均值。

      (2)最佳發(fā)酵時(shí)間

      使用最佳鹽度制備的大米固體培養(yǎng)基,接入種子液5 mL進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),分別在第15,20,25,30,35,40天取兩份樣品,檢測曲酸含量,計(jì)算平均值。

      1.4.3 發(fā)酵條件驗(yàn)證

      在最佳鹽度和發(fā)酵時(shí)間條件下發(fā)酵,高效液相色譜法(HPLC)檢測曲酸含量,計(jì)算曲酸產(chǎn)量,從而驗(yàn)證研究結(jié)果的可重現(xiàn)性。

      1.4.4 曲酸的提取與檢測

      (1)曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

      稱取曲酸對照品5 mg,精密稱量,超純水溶解后,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,定容至刻度線。配置成0.54 mg/mL曲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。在使用時(shí),用超純水稀釋至所需濃度,分別以質(zhì)量濃度為8.44,16.88,33.75,67.5,135 mg/L的曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣,記錄色譜圖。以色譜峰面積(Y)對樣品溶液的質(zhì)量濃度(X,mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得回歸方程為Y=24389.37X+2678.94,相關(guān)系數(shù)R=0.999 99 (R2=1),結(jié)果說明在8.44-135 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好。

      (2)曲酸的提取

      曲酸的提取方法基于文獻(xiàn)[19,20]并作適當(dāng)調(diào)整。由于曲酸易溶于水,因此通常采用水作為曲酸的提取溶劑。為確定最佳的提取參數(shù),本研究考察液料比和超聲提取次數(shù)對曲酸提取的影響。其提取方法簡述如下:將發(fā)酵后的大米培養(yǎng)基攪碎,稱取適量樣品,加入一定比例的蒸餾水超聲提取,過濾,合并過濾液;回收溶劑后得到樣品,加入超純水溶解,定容于10 mL容量瓶中備用。

      (3)曲酸的高效液相色譜法檢測

      曲酸檢測參照文獻(xiàn)[19,20]已報(bào)道的方法。色譜柱:Inertsil ODS-SP (5 μm,150 mm×4.6 mm);流動相:2‰磷酸水溶液(A)/甲醇(B)(95∶5) 等度洗脫;流速:1.2 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:269 nm;進(jìn)樣體積:10 μL。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 曲酸提取條件的確定

      隨著提取溶劑體積的增加,大米培養(yǎng)基中曲酸的提取量均有不同程度提高。方差分析顯示,當(dāng)液料比達(dá)到15∶1后,繼續(xù)增大液料比,曲酸提取率沒有顯著提高,即液料比15∶1和20∶1的提取結(jié)果無顯著性差異,因此選擇液料比為15∶1(圖1a)。另外,隨著超聲提取次數(shù)的增加,曲酸提取量有所增加,超聲提取1次、2次、3次所得的曲酸含量皆存在顯著性差異,超聲提取4次與超聲提取3次無顯著性差異(圖1b)。因此,3次為最佳提取次數(shù)。根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果,確定液料比15∶1,提取3次為曲酸的最佳提取方案。

      圖1 提取條件的考察

      2.2 鹽度對曲酸產(chǎn)量的影響

      在0、1%、2%、3%、5%、7%鹽度下,每克大米產(chǎn)生的曲酸量分別是11.9,23.6,24.3,21.7,19.9,19.8 mg (圖2)。結(jié)果表明,隨鹽度的增加,曲酸產(chǎn)量增高,在2%海鹽的培養(yǎng)基中曲酸產(chǎn)量最高;當(dāng)海鹽含量大于2%后,曲酸產(chǎn)量呈稍微下降趨勢。但總體而言,含有海鹽的大米培養(yǎng)基所產(chǎn)生的曲酸量高于不含海鹽的大米培養(yǎng)基。此外,海鹽含量影響Aspergillussp.代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性,如圖3所示,不含海鹽和1%海鹽培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分復(fù)雜,非曲酸成分占比較高;而當(dāng)鹽度達(dá)到2%時(shí),代謝產(chǎn)物成分簡單,主要為曲酸。

      圖2 不同鹽度條件下的曲酸產(chǎn)量

      A-F:濃度依次為0、1%、2%、3%、5%、7%的海鹽培養(yǎng)基,G:曲酸對照品

      2.3 發(fā)酵時(shí)間對曲酸產(chǎn)量的影響

      在15,20,25,30,35,40 d時(shí)的曲酸產(chǎn)量分別為10.1,13.8,17.0,25.8,26.5,26.2 mg/g (圖4)。隨發(fā)酵時(shí)間增加,曲酸的產(chǎn)量越來越高,但30 d后曲酸的產(chǎn)量增幅不大。因此,曲酸的最佳發(fā)酵時(shí)間為30 d。

      圖4 不同發(fā)酵時(shí)間的曲酸產(chǎn)量

      2.4 最佳發(fā)酵條件下的曲酸產(chǎn)量

      為進(jìn)一步驗(yàn)證最佳條件下的曲酸產(chǎn)量,采用2%海鹽的大米培養(yǎng)基發(fā)酵30 d,HPLC檢測曲酸含量,測得最佳發(fā)酵條件下1 000 g大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的曲酸含量為24.2 mg/g (圖5)。

      圖5 最佳發(fā)酵條件下的發(fā)酵產(chǎn)物HPLC圖

      3 討論

      海鹽的主要成分是氯化鈉,氯化鈉對維持細(xì)胞的正常形態(tài)有重要的作用。當(dāng)鹽度提高到一定濃度后,可能使菌體處于滲透壓相對較高的狀態(tài)而影響真菌的生長或刺激真菌自身代謝的酶活性,從而影響代謝產(chǎn)物的變化。與空白組相比,含海鹽大米培養(yǎng)基的曲酸產(chǎn)量均有明顯的增加。另外,海鹽的含量影響Aspergillussp.代謝產(chǎn)物的復(fù)雜性(圖3),Ola等[21]使用不含鹽的大米培養(yǎng)基培養(yǎng)Aspergillussp.,其代謝產(chǎn)物中主要含曲酸,與本研究結(jié)果不一致,其原因可能是文獻(xiàn)的菌種Aspergillussp.是從植物中分離出,其生長條件不需要鹽來維持菌體滲透壓便可產(chǎn)生曲酸。

      真菌的發(fā)酵過程可分為真菌生長階段與代謝產(chǎn)物積累階段。在發(fā)酵的前期階段,大米培養(yǎng)基養(yǎng)分充足,真菌處于生長繁殖時(shí)期,代謝產(chǎn)物積累相對較少,曲酸含量相對較低。隨著真菌大量繁殖,其代謝產(chǎn)物不斷積累,曲酸含量明顯增加,Aspergillussp.GXIMD02003的曲酸產(chǎn)量在發(fā)酵30 d達(dá)到最高,為1 000 g大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生24.2 g曲酸。李天笑等[22]發(fā)明專利比較米曲霉(A.oryzaeATCC42129)、雜色曲霉菌(A.versicolorATCC28286)以及黃曲霉(A.flavus)、煙曲霉(A.fumigatus)、倫氏曲霉(A.lentulus)在不含鹽的大米固體培養(yǎng)基發(fā)酵的曲酸產(chǎn)量,A.versicolorATCC28286的產(chǎn)量最高,為1 000 g大米培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)6.2 g曲酸[22]。本研究采用含鹽大米固體培養(yǎng)基發(fā)酵Aspergillussp.GXIMD02003,所得曲酸產(chǎn)量高于其報(bào)道的雜色曲霉菌(A.versicolorATCC28286)和黃曲霉(A.flavus) 的曲酸產(chǎn)量,分別為3.9倍和22.9倍。

      4 結(jié)論

      曲酸在生活中被廣泛應(yīng)用,市場需求不斷增加,如何提高曲酸產(chǎn)量備受學(xué)者們關(guān)注,而優(yōu)化真菌發(fā)酵工藝是提高曲酸產(chǎn)量的一種重要方法。本研究發(fā)現(xiàn)海洋來源真菌Aspergillussp.GXIMD02003能夠產(chǎn)生曲酸,其在含2%海鹽的大米培養(yǎng)基發(fā)酵30 d時(shí)曲酸產(chǎn)量相對最高。該研究結(jié)果說明海洋來源真菌Aspergillussp.GXIMD02003可以作為曲酸的生產(chǎn)菌株,海鹽影響該菌株的曲酸代謝。此外,本研究所提供發(fā)酵工藝所需儀器設(shè)備簡單、生產(chǎn)成本低、操作簡單,利于工業(yè)化生產(chǎn)。

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