南沙石珊瑚來源真菌Aspergillus terreus SCAU139的聚酮類代謝產(chǎn)物研究*

張曉勇，趙 婷，農(nóng)旭華**

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院,廣東廣州 510640；2.海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,海南?？?571158)

0 引言

珊瑚被稱為海洋中的熱帶雨林，其表面和組織內(nèi)部聚集著豐富的微生物資源[1]。這些微生物與珊瑚生活在一起，通過合成次級代謝產(chǎn)物(化學(xué)防御物質(zhì))共同抵御外敵入侵和病害防御，是藥物先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的重要來源[2]。自20世紀90年代 Dianne等[3]從一株柳珊瑚來源鏈霉菌Streptomycessp. PG-19代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)具有顯著細胞毒活性的八元環(huán)內(nèi)酯 octalactin A以來，國內(nèi)外學(xué)者從珊瑚來源微生物次級代謝產(chǎn)物中獲得多個結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的先導(dǎo)化合物，為創(chuàng)新藥物的研制提供了充分的分子基礎(chǔ)[4，5]。南沙群島海域地處我國最南端，海洋微生物資源豐富，目前國內(nèi)外對該海域微生物的天然產(chǎn)物化學(xué)研究開展得比較少，研究該海域微生物次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)信息并挖掘其生物學(xué)功能對我國開發(fā)利用南沙群島海洋微生物資源具有重要意義。本文對一株渚碧礁石珊瑚來源真菌SCAU139進行實驗室的規(guī)?；l(fā)酵和次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)分離鑒定，得到7個聚酮類化合物(1—7)，并測試他們對蘋果黑點致病菌Alternariaalternate和菠蘿黑心致病菌Curvulariaaustraliensis的抑制活性，初步揭示南沙海域海洋微生物代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性，為發(fā)現(xiàn)具有應(yīng)用潛力的創(chuàng)新農(nóng)藥提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 出發(fā)菌株

出發(fā)菌株SCAU139從南沙渚碧礁采集的石珊瑚樣品中分離到，并保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋生物資源保護與利用粵港聯(lián)合實驗室。指示菌蘋果黑點致病菌和菠蘿黑心致病菌保藏在中國科學(xué)院南海海洋研究所海洋微生物中心。

1.1.2 改良的PDA液體培養(yǎng)基

200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮沸20—30 min，用8層紗布過濾，加入20 g葡萄糖和30 g海鹽，攪拌均勻，補水定容到1 000 mL，自然pH值。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

柱層析硅膠(100—200目,200—300目)和高效薄層制備板(HSG-FR254R)，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司生產(chǎn)；凝膠LH-20，Pharmacia 公司生產(chǎn)；ESI-MS質(zhì)譜儀(Finnigan LCQDECAXP HPLC-MASS)，賽默飛公司生產(chǎn)；超導(dǎo)核磁共振儀(Bruker DRX-400型，內(nèi)標為 TMS)，布魯克公司生產(chǎn)；半制備型高效液相色譜儀(Agilent 1260 LC,Agilent Eclipse XDB-C18,ODS S-51T 1T 250×9.4 mm i.d.)，安捷倫公司生產(chǎn)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELAN-1100V-W型)，日本東京理化株式會社生產(chǎn)；液相用甲醇為色譜純，MERCK公司生產(chǎn)；其他溶劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌種發(fā)酵

從菌種保存的試管斜面上取一環(huán)在裝有15 mL新鮮改良PDA固體培養(yǎng)基的平板中劃線，放置在培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)3 d，再接種到裝有200 mL新鮮PDA液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，置于搖床28℃、200 r/min培養(yǎng)3 d制成種子液，按5%的接種量接種到裝有400 mL新鮮PDA液體培養(yǎng)基的1 000 mL錐形瓶，28℃靜置發(fā)酵28 d，共發(fā)酵50 L培養(yǎng)液。

1.2.2 化合物的提取分離

取1.2.1節(jié)發(fā)酵液，經(jīng)8層紗布過濾得到菌液和菌體，菌液用乙酸乙酯萃取濃縮，菌體用80%丙酮浸泡并超聲提取濃縮，菌液和菌體粗提物合并得到浸膏30 g。 浸膏用甲醇溶解，過正相柱層析(100—200目)，氯仿-甲醇 (體積比100∶0—0∶100)梯度洗脫，得到6個部位(Fr.1-Fr.6)。部位Fr.3過減壓反相色譜柱得到5個餾分(Fr.3-1-Fr.3-5)，餾分Fr.3-2過LH-20凝膠柱收集到5個小餾分(Fr.3-2-1—Fr.3-2-5)，餾分Fr.3-2-2 由HPLC制備(體積比45∶55)得到化合物1(5 mg，tR=15 min)和2(8 mg，tR=10 min)；餾分Fr.3-2-3過凝膠柱得到3個小餾分(Fr.3-2-3-1—Fr.3-2-3-3)，餾分Fr.3-2-3-2由HPLC制備(體積比55∶45)得到化合物3(10 mg，tR=13 min)和4(6 mg，tR=18 min)；部位Fr.4繼續(xù)過正相柱層析(200—300目)收集到6個餾分(Fr.4-1—Fr.4-6)，餾分Fr.4-2過減壓反相色譜柱得到5個餾分(Fr.4-2-1—Fr.4-2-5)，小餾分Fr.4-2-3由HPLC制備(體積比60∶40)得到化合物5(13 mg，tR=16 min)和6(9 mg，tR=21 min)；小餾分Fr.4-2-4由HPLC制備(體積比60∶40)得到化合物7(7 mg，tR= 12 min)。

1.2.3 抗菌實驗

按照文獻[6]的藥敏紙片法，將蘋果黑點致病菌和菠蘿黑心致病菌接種到改良的PDA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)3 d，得到的菌液超聲打散并使用脫脂棉過濾。使用涂布棒將濾液均勻涂布到改良的PDA固體培養(yǎng)基上。樣品初始濃度均為10 mg/mL，陽性對照多菌靈(CAS：10605-21-7，Aladdin)殺菌劑的初始濃度為2 mg/mL。用打孔器將濾紙制成直徑6 mm的無菌小圓紙片，用定量移液槍吸取5 μL待測化合物的甲醇溶液滴加在濾紙片上，待甲醇揮發(fā)干后，將其貼于準備好的含菌固體培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)24—48 h，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈。重復(fù)2次。

1.2.4 菌株鑒定

海洋真菌菌株SCAU139分離自中國南沙渚碧礁石珊瑚，其總DNA 按照文獻[7]的方法提取。采用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3′) 對總DNA 中的ITS 序列進行PCR 擴增，回收純化PCR 產(chǎn)物并委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行ITS測序測定。將測出來的ITS序列在GenBank上進行BLAST 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

從一株渚碧礁石珊瑚來源真菌SCAU139的次級代謝產(chǎn)物中鑒定出7個聚酮類化合物，他們的結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 真菌SCAU139代謝產(chǎn)物中鑒定出的化學(xué)結(jié)構(gòu)

2.2 單體化合物的波譜數(shù)據(jù)

化合物1：淡黃色粉末,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH9.73 (1H,s,H-7),7.60 (1H,dd,J=2.0 Hz,H-2),7.58 (1H,J=2.0,8.0 Hz,H-6),6.94 (1H,d,J=8.0 Hz,H-5),5.29 (1H,m,H-9),3.27 (2H,d,J=7.0 Hz,H-8),1.71(3H,s,H-12),1.67 (3H,s,H-11);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC190.9 (C-7),161.8 (C-4),132.1 (C-10),130.6 (C-2),130.1 (C-6),128.5 (C-3),127.9 (C-1),121.9 (C-9),115.1 (C-5),27.7 (C-8),25.5 (C-11),17.6 (C-12)。經(jīng)與文獻[8]的數(shù)據(jù)對比,鑒定化合物1為4-hydroxy-3-(3-methyl-2-buten-1-yl)-benzaldehyde。

化合物2：白色晶體,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH6.67 (1H,dq,J=7.0,16.0 Hz,H-7),6.33 (1H,d,J=16.0 Hz,H-6),6.00 (1H,s,H-5),5.77 (1H,d,J=7.0 Hz,H-3),5.68 (1H,d,J=7.0 Hz,H-2),4.53 (1H,brd,J=5.0 Hz,2-OH),3.93 (1H,brd,J=3.5 Hz,3-OH),1.82 (3H,d,J=7.0 Hz,8-CH3);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC204.1 (C-1),169.0 (C-4),140.1 (C-7),125.8 (C-6),125.2 (C-5),81.2 (C-2),76.8 (C-3),19.5 (C-8)。 經(jīng)與文獻[9]的數(shù)據(jù)對比,確定化合物2為土曲霉酮 (terrein)。

化合物3：淡黃色粉末,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH9.77 (s,CHO),7.74 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2,H-6),6.91 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,H-5);13C NMR (400 MHz,DMSO-d6)δC190.8 (1-CHO),163.9 (C-4),132.1 (C-1),128.1 (C-2,C-6),116.0 (C-3,C-5)。經(jīng)與文獻[10]的數(shù)據(jù)對比,確定化合物3為對羥基苯甲醛 (4-hydroxybenzaldehyde)。

化合物4:白色晶體,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH5.96 (1H,d,J=16.0 Hz,H-15),5.80 (1H,dd,J=6.0,9.6 Hz,H-13),5.51 (1H,m,H-16),5.23 (1H,m,H-10),5.19 (1H,s,H-5),4.49 (4.09,m,H-3),2.65 (H-2a),2.41 (H-2b),1.31-1.96 (10H,m,CH2-4,CH2-6,CH2-7,CH2-11,CH2-22),1.07 (6H,m,CH3-23,CH3-24),0.84 (6H,m,CH3-18,CH3-19);13C NMR (400 MHz,DMSO-d6)δC175.5 (C-20),170.2 (C-1),133.1 (C-16),131.5 (C-14),129.1 (C-13),128.2 (C-15),75.8 (C-5),67.4 (C-10),61.3 (C-3),40.7 (C-21),38.5 (C-2),36.4 (C-9),36.0 (C-8),35.4 (C-4),32.4 (C-6),31.9 (C-11),30.1 (C-17),26.9 (C-12),26.3 (C-22),23.6 (C-7),22.6 (C-19),16.0 (C-24),13.6(C-18),11.4 (C-23)。經(jīng)與文獻[11]的數(shù)據(jù)對比,確定化合物4為洛伐他汀 (monacolin K)。

化合物5：無色晶體,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH10.54 (1H,brs,1-OH),9.96 (1H,brs,17-OH),7.51 (2H,d,J=8.8 Hz,H-3,H-5),6.89 (2H,d,J=8.8 Hz,H-2,H-6),6.54 (1H,d,J=8.8 Hz,H-16),6.49 (1H,dd,J=2.4,8.4 Hz,H-15),6.37(1H,brd,J=2.0 Hz,H-19),5.02 (1H,m,H-21),3.74 (3H,s,CH3-12),3.00 (2H,m,CH2-20),1.62 (3H,s,CH3-23),1.53 (3H,s,CH3-24);13CNMR (100 MHz,DMSO-d6)δC169.9 (C-11),167.9 (C-9),157.9 (C-1),153.8 (C-17),138.1 (C-8),131.4 (C-22),130.9 (C-19),128.8 (C-3,C-5),128.4 (C-15),127.5 (C-7),126.5 (C-18),123.1(C-14),122.4 (C-21),121.1 (C-4),115.8 (C-2,C-6),114.1 (C-16),84.7 (C-10),53.5 (C-12),38.1 (C-13),27.5 (C-20),25.5 (C-23),17.5 (C-24)。 經(jīng)與文獻[12]的數(shù)據(jù)對比,確定化合物5為butyrolactone Ⅰ。

化合物6：淡黃色油狀物,1H NMR (400 MHz,CDCl3) 7.62 (2H,d,J=8.8 Hz,H-2′,H-6′),6.91 (2H,d,J=8.8 Hz,H-3″,H-5″),6.65 (1H,s,H-2″),6.55 (1H,dd,J=2.0,8.4 Hz,H-6″),6.49 (1H,d,J=8.4 Hz,H-5″),4.52 (1H,t,J=8.8 Hz,H-8″),3.77 (3H,s,5-OCH3),3.57 (1H,d,H-6α),3.49 (1H,d,H-6β),3.04 (2H,m,CH2-7″),1.28 (3H,s,CH3-10″),1.15(3H,s,CH3-11″);13CNMR (100 MHz,CDCl3)δC169.7 (C-5),169.2 (C-1),158.8 (C-4″),156.6 (C-4′),137.3 (C-2),130.1(C-6″),129.5 (C-2′,C-6′),128.0 (C-3),126.9 (C-2″),126.8 (C-3″),124.7 (C-1″),122.2 (C-1′),116.1(C-3′,C-5′),108.5 (C-5″),89.2 (C-8″),86.0 (C-4),72.3 (C-9″),53.6 (5-OCH3),38.9 (C-6),30.5 (C-7″),25.9 (C-10″),23.9 (C-11″)。 經(jīng)與文獻[13]的數(shù)據(jù)對比,確定化合物6為pernolide D。

化合物7：淡黃色粉末,1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δH6.90 (1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.69 (1H,d,J=2.0 Hz,H-4),6.23 (2H,s,H-3′ and H-5′),4.35 (2H,s,4′-CH2OH),3.64 (3H,s,3-OCH3),3.63 (3H,s,1-COOCH3);13C NMR (100 MHz,DMSO-d6)δC199.9 (C-7),165.7 (1-COOCH3),161.8 (C-2′,C-6′),158.2 (C-5),156.8 (C-3),152.2(C-4′),127.9 (C-1),126.2 (C-6),109.8 (C-1′),107.2 (C-3′,C-5′),104.1 (C-2),103.5 (C-4),62.4 (4′-CH2OH),56.0 (3′-OCH3),52.1 (1-COOCH3)。經(jīng)與文獻[14]的數(shù)據(jù)對比,確定化合物7為hydroxysulochrin。

2.3 菌株的鑒定

海洋真菌菌株SCAU139的ITS序列在GenBank上進行BLAST 分析，發(fā)現(xiàn)該序列與已知菌株AspergillusterreusKU743892的相似度為99%，同時結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)分析(圖2)，鑒定菌株SCAU139為A.terreus。

圖2 真菌A.terreus SCAU139的形態(tài)學(xué)特征

2.4 抗真菌實驗結(jié)果

對分離到的7個單體化合物，采用濾紙片法測試其對蘋果黑點致病菌和菠蘿黑心致病菌的抑制活性。結(jié)果顯示：化合物1—7對上述2種真菌的生長無明顯的抑制活性，陽性對照多菌靈能較顯著抑制這2種真菌的活性，抑制圈直徑約為20 mm。

3 結(jié)論

對一株南沙石珊瑚來源真菌A.terreusSCAU139進行次級代謝產(chǎn)物的化學(xué)研究，得到7個聚酮類化合物，化合物2在其他海洋真菌菌株的代謝產(chǎn)物中也有發(fā)現(xiàn)[15-17]，暗示其具有一定的化學(xué)生態(tài)學(xué)意義。初步測試7個化合物對蘋果黑點致病菌Alternariaalternate和菠蘿黑心致病菌Curvulariaaustraliensis的抑制活性，結(jié)果表明他們沒有明顯的抗真菌活性。