基于機(jī)械攪拌式光照發(fā)酵罐的紫球藻高產(chǎn)藻紅蛋白培養(yǎng)條件優(yōu)化*

陳曉倩，劉永宏，黃炳耀

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院，廣西南寧 530200)

0 引言

藻紅蛋白是一種具有高度熒光特性和光穩(wěn)定性的藻膽蛋白，是極好的天然色素和熒光劑，可以廣泛應(yīng)用在醫(yī)療衛(wèi)生、食品、化妝品以及染料等行業(yè)[1-4]。此外，藻紅蛋白還可以作為優(yōu)良的蛋白質(zhì)來源，添加在食品、藥品以及動(dòng)物飼料中[1,3]。在大多數(shù)紅藻中，藻紅蛋白可占藻膽蛋白的70%以上[5]，其中以紫球藻(Porphyridiumcruentum)的含量最高，因此紫球藻是生產(chǎn)藻紅蛋白的優(yōu)質(zhì)材料。在紫球藻的類囊體膜上，藻紅蛋白與其他3種藻膽蛋白聚合形成高度有序的超分子復(fù)合體，即藻膽體(Polyunsaturated Fatty Acids,PBSs)[6-9]。在自然狀態(tài)下，PBSs結(jié)構(gòu)完整，并與類囊體膜結(jié)合緊密，這時(shí)紫球藻呈現(xiàn)紫紅色[10-12]。當(dāng)受到外界脅迫時(shí)，作為儲(chǔ)藏蛋白的藻紅蛋白與連接器多肽分離并從PBSs上降解下來[6]，用作氮源以供藻類生存。在此過程中，紫球藻開始褪色，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)黃綠色。因此，普遍認(rèn)為生長(zhǎng)環(huán)境因素會(huì)影響紫球藻藻紅蛋白的積累。有研究發(fā)現(xiàn)，氮鹽含量對(duì)藻紅蛋白的積累有顯著的影響，高氮對(duì)其有抑制作用[13，14]；另外，低光條件下的細(xì)胞需要更多的藻膽蛋白用來吸收更多的光能，因此低光能刺激藻膽蛋白的合成與積累[15，16]。

目前，實(shí)驗(yàn)室多采用搖瓶、充氣等方式進(jìn)行紫球藻的培養(yǎng)，但這些常用培養(yǎng)方式均存在平行性差、可控性不佳的缺點(diǎn)。小型普通機(jī)械攪拌式光照發(fā)酵罐是實(shí)驗(yàn)室常見發(fā)酵裝置，可控性好、技術(shù)條件成熟，僅需對(duì)光源進(jìn)行調(diào)整就可用來培養(yǎng)光合微生物，大大增加了設(shè)備的利用率。為避免實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)紫球藻的一系列不良因素影響，本研究選用容量為10 L的小型機(jī)械攪拌式光照發(fā)酵罐作為培養(yǎng)紫球藻的光生物反應(yīng)器，采用單因素法(分別以攪拌速率、光照強(qiáng)度、氮濃度、NaCl濃度作為單一變量因子)[17，18]，對(duì)紫球藻發(fā)酵生產(chǎn)藻紅蛋白的條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳生產(chǎn)條件，為紫球藻藻紅蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫球藻藻種由山東大學(xué)(威海)提供，由本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

微量元素營養(yǎng)液的配制參考文獻(xiàn)[18-20]，具體配方為2 mmol/L FeCl3·6H2O，7 mmol/L MnCl2，1 mmol/L ZnCl2，1 mmol/L CoCl2·6H2O，1 mmol/L CuSO4·5H2O，1 mmol/L (NH4)6Mo7O2，2 mmol/L EDTA-2Na。

人工海水培養(yǎng)基(Artificial Seawater,ASW) 的配制參考文獻(xiàn)[18-20]，具體配方為0.74 g/L CaSO4，0.8 g/L KCl，2.6 g/L MgCl2·6H2O，1.9 g/L MgSO4，1 mL f/2維生素母液，1 mL微量元素營養(yǎng)液。

f/2維生素母液參考市面所售品牌MwVin的維生素溶液配方，具體配方為0.5 mg/L 維生素B12，100 mg/L鹽酸硫胺素，0.5 mg/L生物素。

1.2 方法

1.2.1 紫球藻培養(yǎng)

共設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)均以ASW作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，NaNO3作為氮源，用NaCl調(diào)整培養(yǎng)基鹽度。各組的培養(yǎng)溫度均為25℃，通氣量為120 L/h。

攪拌速率組：本組培養(yǎng)基的氮濃度均為5 mmol/L，NaCl濃度為30‰，光照強(qiáng)度為5 000 Lx，以攪拌速率為可變條件設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，攪拌速率分別為50，100，150，200，250 r/min。

光照強(qiáng)度組：本組培養(yǎng)基的氮濃度均為5 mmol/L，NaCl濃度為30‰，攪拌速率為200 r/min，以光照強(qiáng)度為可變條件設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，光照強(qiáng)度分別為2 000，4 000，5 000，6 000，8 000 Lx。

氮濃度組：本組培養(yǎng)基的NaCl濃度均為30‰，光照強(qiáng)度為5 000 Lx，攪拌速率為200 r/min，以氮濃度為可變條件設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，氮濃度分別為2，4，6，8，10 mmol/L。

NaCl濃度組：本組培養(yǎng)基的氮濃度均為5 mmol/L，光照強(qiáng)度為5 000 Lx，攪拌速率為200 r/min，以NaCl濃度為可變條件設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，NaCl濃度分別為10‰、20‰、30‰、40‰、50‰。

1.2.2 藻紅蛋白相對(duì)含量的測(cè)定方法

迄今為止，已經(jīng)從紫球藻中分離純化出兩種藻紅蛋白，B-藻紅蛋白和b-藻紅蛋白，其中以B-藻紅蛋白含量最多且最為穩(wěn)定[19]。B-藻紅蛋白和b-藻紅蛋白均在545 nm處有一主要吸收峰[21]，所以一般以藻體蛋白粗提液在545 nm處的吸光度代表藻紅蛋白的相對(duì)含量。

測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[18]。每天固定時(shí)間取樣一次，每次取不同實(shí)驗(yàn)組的藻液5 mL作為測(cè)試樣品。樣品于5 000 r/min條件下離心5 min，除去上清，藻細(xì)胞沉淀使用3 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH值為7.0)進(jìn)行懸浮。然后使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行藻細(xì)胞破碎，超聲功率50 W，工作時(shí)間7 s，間歇時(shí)間5 s，循環(huán)30次。破碎完畢后，對(duì)樣品進(jìn)行離心(5 000 r/min，10 min)，所得上清液即為藻紅蛋白測(cè)試液。然后使用分光光度計(jì)測(cè)其在545 nm處的吸光度，最后以每107個(gè)細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的吸光度作為藻紅蛋白相對(duì)含量的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 攪拌速率對(duì)紫球藻藻紅蛋白含量的影響

紫球藻可產(chǎn)生大量胞外多糖，具有一定的黏性，當(dāng)攪拌速率過低時(shí)會(huì)導(dǎo)致藻體沉積，而速率過高時(shí)會(huì)對(duì)藻體造成機(jī)械損傷[22]，所以攪拌速率過低和過高均會(huì)影響紫球藻生長(zhǎng)和藻紅蛋白的積累(圖1)。在培養(yǎng)期內(nèi)，比較各組藻紅蛋白的產(chǎn)量，大致呈現(xiàn)150 r/min組>100 r/min組>200 r/min組>50 r/min組>250 r/min組的趨勢(shì)；在培養(yǎng)的4—7 d內(nèi)，各組藻紅蛋白的合成速率最快。在收獲時(shí)(第9天)，150 r/min組的藻紅蛋白產(chǎn)量最高。另外，當(dāng)設(shè)置攪拌速率為50 r/min時(shí)，前期培養(yǎng)過程中藻體易沉積，生長(zhǎng)速度緩慢，氮源消耗也較緩慢，所以在后期其藻紅蛋白產(chǎn)量較其他組有所上升；而攪拌速度過高時(shí)，藻紅蛋白的積累會(huì)受到一定抑制。綜上所述，在生產(chǎn)紫球藻藻紅蛋白時(shí)，攪拌速率建議使用150 r/min。

圖1 攪拌速率對(duì)紫球藻藻紅蛋白含量的影響

2.2 光照強(qiáng)度對(duì)紫球藻藻紅蛋白含量的影響

由圖2可知，紫球藻藻紅蛋白的含量與光照強(qiáng)度呈反比。光照較弱時(shí)，紫球藻藻紅蛋白的產(chǎn)量較高；光照較強(qiáng)時(shí)，其積累量卻會(huì)相對(duì)降低。本實(shí)驗(yàn)中，各組藻紅蛋白的積累量情況是2 000 Lx組>4 000 Lx組>5 000 Lx組>6 000 Lx組>8 000 Lx組，收獲時(shí)，2 000 Lx組藻紅蛋白產(chǎn)量最高。紫球藻為光合自養(yǎng)生物，藻紅蛋白為其重要的捕光色素蛋白，當(dāng)光照強(qiáng)度改變時(shí)，紫球藻自身會(huì)做出相應(yīng)改變來適應(yīng)環(huán)境變化。本研究中，當(dāng)光照強(qiáng)度為2 000 Lx時(shí)，紫球藻藻紅蛋白含量最高，此時(shí)藻體顏色最深；隨著光強(qiáng)增加，藻紅蛋白含量降低。盧曉等[23]、陳偉洲等[24]在研究紅藻門的江蘺時(shí)也發(fā)現(xiàn)藻紅蛋白隨光強(qiáng)變化有相似的情況，這或許是因?yàn)榈凸庀录?xì)胞需要更多的藻膽蛋白以便吸收更多的光能，所以更能刺激藻膽蛋白的合成與積累[14，15]。

圖2 光照強(qiáng)度對(duì)紫球藻藻紅蛋白含量的影響

2.3 氮濃度對(duì)紫球藻藻紅蛋白含量的影響

由圖3可知，各實(shí)驗(yàn)組藻紅蛋白含量總體呈現(xiàn)8 mmol/L組>10 mmol/L組>6 mmol/L組>4 mmol/L組>2 mmol/L組的變化趨勢(shì)，在收獲時(shí)8 mmol/L組藻紅蛋白產(chǎn)量最高。在培養(yǎng)過程中，低氮組(2，4 mmol/L組)的藻紅蛋白產(chǎn)量先增加，后因?yàn)榈吹南钠浜恐饾u降低(藻液顏色變淺)；而6，8，10 mmol/L組藻紅蛋白含量隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸升高(藻液顏色變深)。在一定氮濃度范圍內(nèi)(2—8 mmol/L)，藻紅蛋白含量與氮濃度成正比，但過高氮濃度(10 mmol/L)并不能有效提高藻紅蛋白含量，該結(jié)果與前人已公布的研究結(jié)果[13-16]基本一致。因此，在以NaNO3為氮源生產(chǎn)紫球藻藻紅蛋白時(shí)，其氮濃度建議使用8 mmol/L。

圖3 氮濃度對(duì)紫球藻藻紅蛋白含量的影響

2.4 NaCl濃度對(duì)紫球藻藻紅蛋白含量的影響

紫球藻對(duì)鹽度適應(yīng)性較強(qiáng)，淡水、海水中均能生長(zhǎng)，但當(dāng)前關(guān)于NaCl濃度對(duì)紫球藻藻紅蛋白含量影響的研究較少。從本研究結(jié)果可以看出(圖4)，在培養(yǎng)期內(nèi)，各組藻紅蛋白的產(chǎn)量從高到低依次為20‰組>10‰組>30‰組>40‰組>50‰組，收獲時(shí)，20‰組藻紅蛋白產(chǎn)量最高。這說明紫球藻生產(chǎn)藻紅蛋白需要適宜的NaCl濃度，濃度過低或過高對(duì)其積累都有一定程度的抑制。因此，在生產(chǎn)紫球藻藻紅蛋白時(shí)，NaCl濃度建議使用20‰。

圖4 NaCl濃度對(duì)紫球藻藻紅蛋白含量的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用攪拌式光照發(fā)酵罐培養(yǎng)紫球藻生產(chǎn)藻紅蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，以攪拌速率、光照強(qiáng)度、氮濃度和NaCl濃度作為單一變量因子，藻紅蛋白分別在150 r/min的攪拌速率、2 000 Lx的光照強(qiáng)度、8 mmol/L的氮濃度、20‰的NaCl濃度條件下積累量達(dá)到最高值。此外，從成本效益上看，上述發(fā)酵條件也是較優(yōu)的選擇:20‰的NaCl減少了原料的使用，150 r/min的攪拌速率和2 000 Lx的光照強(qiáng)度使發(fā)酵過程中的能源損耗較低。本研究為單因素實(shí)驗(yàn)分析，為得到更加合理的生產(chǎn)方案，還需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步使用多因素分析，確定最佳生產(chǎn)條件，為紫球藻藻紅蛋白的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。