乳寡糖調(diào)控新生仔豬腸道健康的研究進展

■吳秋杰 李 勇 卓 勇 吳 德

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，四川成都 611130；2.廣西商大科技股份有限公司，廣西種豬營養(yǎng)工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530105）

腸道疾病是引起新生仔豬發(fā)病和死亡的最主要原因[1]，關(guān)注早期腸道健康對提高仔豬存活率和后續(xù)生產(chǎn)性能具有重要意義[2]。新生仔豬腸道面臨多重挑戰(zhàn)[3]：首先是宮內(nèi)發(fā)育時以胎盤轉(zhuǎn)運養(yǎng)分為主，新生期以乳汁為營養(yǎng)來源，乳質(zhì)量不佳直接導致腸道發(fā)育受阻；其次，從宮內(nèi)發(fā)育到宮外發(fā)育的轉(zhuǎn)換打破原有菌群環(huán)境，腸道菌落多樣性面臨重塑，而乳成分與質(zhì)量是影響腸道微生物菌群平衡的重要外因之一；此外，由乳汁向固體飼料的轉(zhuǎn)換也對仔豬腸道健康帶來挑戰(zhàn)。因此，促進腸道快速發(fā)育，改善有益微生物在腸道內(nèi)的定植是提升新生仔豬健康水平的關(guān)鍵。

母乳作為新生期仔豬主要營養(yǎng)來源，其營養(yǎng)組成是設(shè)計新生期營養(yǎng)的黃金標準[4]。乳糖、乳脂、乳蛋白是被熟知的宏量營養(yǎng)素，其主要作為能量、蛋白來源發(fā)揮重要營養(yǎng)功能。乳寡糖（Milk oligosaccharides,MO）在乳中含量僅次于乳糖、乳脂、乳蛋白[5]。但作為一種低聚糖，乳寡糖在胃腸道中能夠抵抗內(nèi)源酶消化，大部分在后腸被微生物消化和代謝，是影響腸道微生物多樣性的重要因素，且乳寡糖作為一種重要的生物活性分子在保障新生動物的健康中發(fā)揮著特殊功能[6-7]。因此，本文從乳寡糖的結(jié)構(gòu)特點出發(fā)，綜述乳寡糖影響新生仔豬腸道健康的主要途徑及在新生仔豬日糧中的應用。

1 乳寡糖的特點

1.1 化學結(jié)構(gòu)

乳寡糖是一種源于母乳的功能性低聚糖。主要由6 種基本單元通過糖苷鍵鍵合組成。D-葡萄糖（Glc）、D-半乳糖（Gal）、N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）組成乳寡糖的核心結(jié)構(gòu)，另外的三個基團[L-巖藻糖（Fuc）、N-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuAc，又稱唾液酸）、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（NeuGc）]通過不同類型的糖苷鍵與核心結(jié)構(gòu)的非還原端連接，形成中性乳寡糖和酸性乳寡糖兩種類型[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)，中性乳寡糖主要以巖藻糖基化乳寡糖為代表，酸性乳寡糖主要以唾液酸化乳寡糖為代表，在動物腸道健康中發(fā)揮著重要且不同的調(diào)節(jié)功能[7，10]。

通過化學結(jié)構(gòu)的比較可以發(fā)現(xiàn)乳寡糖具有結(jié)構(gòu)上的特殊性，常見的功能性寡糖如低聚果糖、低聚木糖、甘露寡糖等通常只含有β-1,2 糖苷鍵，β-1,4 糖苷鍵，組成單體為普通單糖[11]，而乳寡糖在此基礎(chǔ)上，有額外的修飾基團以及不同的糖苷鍵，如唾液酸基團及對應的α-2，3，α-2，6糖苷鍵，巖藻糖基團及對應的α-1，2，α-1，3 糖苷鍵[12-13]。結(jié)構(gòu)決定功能，乳寡糖所具有的特殊糖苷鍵以及特殊的修飾基團，賦予乳寡糖不同于植物性寡糖、酵母寡糖的特殊功能[14]。

1.2 乳寡糖的分泌規(guī)律

質(zhì)譜是檢測寡糖含量的主要方法[15-16]，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，品種、血型、生理階段的差異都影響著母乳中乳寡糖的含量及多樣性。人乳中的乳寡糖含量最多，種類最豐富，其初乳中含量為20～23 g/L，成熟乳中含量為7～12 g/L[4]。豬乳中，初乳中寡糖含量為11.85～12.19 g/L，常乳中含量為6.82～6.98 g/L[12]。分析不同階段母豬乳汁中寡糖含量及類型，發(fā)現(xiàn)乳寡糖的含量及多樣性隨著泌乳階段的進行而顯著下降[17-18]。初乳中寡糖含量多達55 種，主要為唾液酸化乳寡糖（占55%～80%）和中性乳寡糖（占18%～33%），其中巖藻糖基化乳寡糖占比0.89%，此外還有其他類型的寡糖[17]。同時，3’-巖藻糖基乳糖含量隨泌乳進行而增加，而2’-巖藻糖基乳糖含量逐漸下降[18]。新生仔豬腸道發(fā)育特點之一在于出生后數(shù)天內(nèi)迅速發(fā)育[19]。研究表明仔豬攝入初乳24 h 后小腸發(fā)育及其消化、水解、轉(zhuǎn)運營養(yǎng)物質(zhì)的能力均顯著提高[20-21]。結(jié)合乳寡糖在泌乳前期分泌更多的規(guī)律，暗示乳寡糖可能在新生仔豬腸道的早期生長發(fā)育中發(fā)揮了功能作用。Charbon?neau 等[22]分析比較了馬拉維地區(qū)營養(yǎng)不良嬰兒和健康嬰兒母乳的成分差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康組母乳的乳寡糖總含量顯著高于營養(yǎng)不良組；其中，巖藻糖基化乳寡糖和唾液酸化乳寡糖的含量不足是導致新生兒腸道發(fā)育受阻的重要原因。

2 乳寡糖改善新生仔豬腸道健康的作用途徑

大量研究表明，乳寡糖影響腸道健康的可能途徑主要有3 個方面：作為“誘餌”抵抗病原體的感染；作為信號分子調(diào)控腸道成熟；作為益生元調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡。

2.1 作為“誘餌”抵抗病原體的感染

與腸上皮細胞受體特異性結(jié)合是病原體感染腸道的第一步，而病原受體的化學本質(zhì)是特異性聚糖，MO 與特異性聚糖結(jié)構(gòu)的相似性，使MO 作為病原體特異性受體類似物，競爭性地抑制病原體與腸上皮黏附，從而保護新生動物免于腹瀉，這種結(jié)構(gòu)的相似性往往體現(xiàn)在α-1,2糖苷鍵連接的巖藻糖基團和唾液酸基團[23-25]。Li 等[26]的試驗中，新生仔豬感染輪狀病毒（RV）后，配方乳、人乳寡糖、半乳寡糖果寡糖混合物雖未對輪狀病毒產(chǎn)生預防作用，但乳寡糖的添加降低了仔豬腹瀉的持續(xù)時間。Hester等[27]采用一種急性輪狀病毒感染仔豬，通過測定輪狀病毒復制標志物黏膜非結(jié)構(gòu)蛋白-4（NSP4）的mRNA 表達，發(fā)現(xiàn)乳寡糖降低了輪狀病毒在回腸中的復制。其中，不同種類的酸性乳寡糖都有上述抑制效應，中性乳寡糖只有乳-N-新四糖（LNnT）有類似抑制效果，說明不同類型的乳寡糖影響輪狀病毒的能力不同，決定其“抗病毒”特性的關(guān)鍵在于它們不同的修飾基團。同樣能夠?qū)啝畈《井a(chǎn)生抑制作用的還有一種物質(zhì)叫作凝集素，在它的結(jié)構(gòu)中含有和酸性乳寡糖相似的唾液酸基團。Newburg等[28]將乳凝集素去唾液酸化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，凝集素失去唾液酸基團后對輪狀病毒的抑制作用完全喪失，這說明凝集素抵抗輪狀病毒的效應在于唾液酸基團的存在。Hester等[27]在體外輪狀病毒感染細胞模型的試驗中驗證了該觀點，用豬的OSU株輪狀病毒感染MA-104 細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含唾液酸（SA）的人乳寡糖（Human milk oligosaccharide, HMO）呈計量效應的抑制輪狀病毒與宿主細胞的感染和結(jié)合，而中性HMO并沒有這種抑制效應。

基于唾液酸基團抵抗輪狀病毒的感染原理，巖藻糖基團同樣能夠特異性地抵抗病原菌的感染。研究發(fā)現(xiàn)，母乳中含有α-1,2 巖藻糖結(jié)構(gòu)的乳寡糖濃度越高，嬰兒腹瀉的比例越低，兩者之間呈現(xiàn)出一種負相關(guān)關(guān)系[29-30]。日糧添加2’-巖藻糖基乳糖增強新生仔豬感染輪狀病毒后的免疫水平，其機制與2’-巖藻糖基乳糖減少病毒黏附，促進免疫系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)[31]。在輪狀病毒感染的大鼠模型上的研究也觀察到類似的調(diào)控效應[32]。彎曲桿菌是引發(fā)新生兒腹瀉的一種致病性病原菌，其致病性的第一步在于黏附腸黏膜。Ruizpalacios等[33]研究表明，彎曲桿菌黏附腸黏膜取決于上皮細胞表面的巖藻糖基α-1，2表位配體，體外試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有α-1，2 巖藻糖基的乳寡糖可以抑制彎曲桿菌對腸黏膜的附著，體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，該結(jié)構(gòu)的乳寡糖可抑制彎曲桿菌在腸道的定植。這些證據(jù)表明巖藻糖基化的結(jié)構(gòu)充當了可溶性配體，其與腸上皮細胞表面受體競爭結(jié)合彎曲桿菌和靶向α-1，2 配體的其他病原體，從而抵抗該類病原體對新生動物腸道的感染。

2.2 作為信號分子調(diào)控腸道成熟

腸道成熟與腸上皮細胞的增殖和分化有關(guān)。在腸道遠端，乳寡糖被消化，而在近端腸道，未消化的乳寡糖作為信號分子可直接影響腸道上皮細胞。Kuntz等[34]用各種混合型乳寡糖和單一乳寡糖去培養(yǎng)3種不同譜系的腸道上皮細胞（HT-29、Caco-2、HIEC），研究發(fā)現(xiàn)酸性混合乳寡糖對3 種腸上皮細胞的生長都有劑量依賴性的抑制作用，單一寡糖中所有的酸性寡糖都抑制HT-29細胞的增殖。同時，該研究者檢測了不同乳寡糖對腸上皮細胞分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在混合寡糖中，酸性乳寡糖對HT-29 和HIEC 細胞的分化有顯著的誘導作用。在單一寡糖類型中，只有唾液酸乳寡糖具有誘導HT-29 和HIEC 細胞分化的作用，表明乳寡糖既是腸細胞的增殖抑制劑，又是分化誘導劑。研究者探討了乳寡糖抑制腸上皮增殖的分子機制[34]，通過流式分析發(fā)現(xiàn)中性酸性乳寡糖均能劑量依賴性地誘導細胞G2/M 期阻滯。G2/M 期為細胞復制后期，該時期占比越大，S 期（DNA 復制期）占比就越小，從而抑制細胞分裂。通過測定調(diào)節(jié)細胞周期關(guān)鍵蛋白的mRNA 水平，乳寡糖引起的G2/M 細胞周期停滯是通過EGFR 信號通路和細胞周期相關(guān)基因表達來誘導腸細胞生長停滯，其機制涉及EGFR 磷酸化、p38 激酶磷酸化，從而激活細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21cip1的活性而產(chǎn)生G2/M細胞周期停滯[35]。

Perdijk 等[36]運用基因芯片技術(shù)和IPA 鑒定，結(jié)果顯示SL（唾液酸乳寡糖）調(diào)節(jié)了Caco-2小腸上皮細胞的細胞周期進程和有絲分裂通路。為了研究這些轉(zhuǎn)錄效應是否可轉(zhuǎn)化為細胞周期進展和細胞增殖的表型，在含有唾液酸乳寡糖（SL）的完全培養(yǎng)基中下培養(yǎng)Caco-2細胞4 d，使用流式細胞術(shù)評估細胞數(shù)和活細胞比例，結(jié)果顯示，在高濃度SL 情況下，細胞數(shù)量減少，上皮細胞分化標志物（堿性磷酸酶活性）增加，說明唾液酸乳寡糖抑制了細胞增殖，并誘導了細胞分化。這些結(jié)果顯示乳寡糖作為一種信號因子調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞分化之間的平衡。

2.3 作為益生元調(diào)控腸道微生物菌群平衡

乳寡糖在前腸抵抗內(nèi)源酶消化，在后腸可作為益生元調(diào)控腸道微生物的菌群平衡。Perdijk 等[36]在體外試驗中發(fā)現(xiàn)，唾液酸乳寡糖促進了雙歧桿菌和擬桿菌的生長。眾所周知，雙歧桿菌是一種有益的腸道微生物，擬桿菌是共生菌，二者是新生動物腸道菌群中的優(yōu)勢菌。發(fā)表于Cell 雜志的報道也證明純化的唾液酸化牛乳寡糖主要由脆弱擬桿菌代謝[22]，脆弱擬桿菌還能產(chǎn)生多糖A 誘導CD4+T 細胞分化成腸道中的調(diào)節(jié)性T細胞，從而促進免疫穩(wěn)態(tài)[37]，在早期生命中免疫系統(tǒng)發(fā)育中扮演著重要的角色。Rudloff 等[38]在研究早產(chǎn)豬的乳寡糖代謝試驗中發(fā)現(xiàn)，仔豬結(jié)腸內(nèi)容物中，雙歧桿菌的豐度和乳寡糖濃度呈負相關(guān)，且單一乳寡糖2’-FL 與雙歧桿菌的豐度呈現(xiàn)更強的負相關(guān)關(guān)系，表明乳寡糖調(diào)節(jié)了雙歧桿菌在后腸的生長和定植。Li等[26]在新生仔豬的研究中發(fā)現(xiàn)，飼喂人源乳寡糖的仔豬的微生物菌群與配方乳組和益生元組的微生物群都不同，人乳寡糖組仔豬的結(jié)腸內(nèi)容物中未分類的Lachnospiraceae（毛螺菌科）的數(shù)量顯著增加。毛螺菌科分離株在無菌小鼠中能抑制艱難梭菌的定植[39]，臨床研究也表明毛螺菌科豐度降低與慢性腸道疾病（如炎癥性腸?。┫嚓P(guān)[40]，且毛螺菌科含有大量的丁酸鹽產(chǎn)生菌，從而可以發(fā)酵乳寡糖產(chǎn)生對腸道形態(tài)和屏障功能有益的短鏈脂肪酸[41]。上述研究結(jié)果都表明，乳寡糖可通過影響新生期仔豬的腸道微生物菌群平衡調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)育，維護機體健康。

3 乳寡糖在新生仔豬日糧中的應用

乳寡糖對新生仔豬健康的調(diào)控效應正處于研究熱點和前沿，但乳寡糖對仔豬腸道健康的影響尚存在爭議。Charbonneau 等[22]給無菌仔豬定植了營養(yǎng)不良嬰兒的腸道微生物，在基礎(chǔ)飲食中添加唾液酸化乳寡糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)唾液酸化乳寡糖極顯著提高了新生仔豬的體增重。在此基礎(chǔ)上再引入有害菌大腸桿菌的定植，結(jié)果顯示乳寡糖仍然極顯著地提高了仔豬的體增重，從而引起營養(yǎng)學家的廣泛關(guān)注。研究考察了牛乳寡糖對早產(chǎn)仔豬生長性能以及腸道微生物的影響[42]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)飲食中添加唾液酸乳寡糖對早產(chǎn)仔豬的生長性能以及結(jié)腸微生物多樣性沒有顯著影響。進一步比較了剖腹產(chǎn)人工喂養(yǎng)與自然分娩哺乳的仔豬腸道發(fā)育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自然分娩哺乳的仔豬腸道刷狀緣酶和腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)物顯著高于剖腹產(chǎn)人工喂養(yǎng)的仔豬，該結(jié)果說明分娩方式以及人工飼養(yǎng)條件可能掩蓋了乳寡糖對腸道健康的潛在作用，且試驗中仔豬進行了口服抗生素處理，這也可能影響了腸道微生物的組成[43]。與此同時，在豬乳中，3’-SL、6’-SL寡糖為優(yōu)勢乳寡糖，該研究添加的乳寡糖混合物只含有4.5%的3’-SL、6’-SL，且牛乳中SL 以Neu5Gc 為代表，而Neu5Gc在豬乳中幾乎不存在[8，12，44]。豬乳優(yōu)勢乳寡糖3’-SL、6’-SL并不是試驗中混合乳寡糖主要的SL，也可能導致乳寡糖對仔豬腸道健康的影響沒有達到顯著差異。Cilieborg等[45]研究了巖藻糖基乳寡糖對大腸桿菌攻毒的新生仔豬的影響，研究發(fā)現(xiàn)巖藻糖基乳寡糖對大腸桿菌攻毒導致的腹瀉沒有緩解作用，但有降低大腸桿菌攻毒導致的失重的趨勢。該試驗還研究了大腸桿菌攻毒后巖藻糖基乳寡糖對新生仔豬小腸絨毛和刷狀緣酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加2’-FL的仔豬腸絨毛顯著高于未添加2’-FL 的仔豬。此試驗處理時間只有8 d，處理時間過短以及大腸桿菌攻毒濃度過高可能是2’-FL 沒有對腸道產(chǎn)生明顯積極效果的原因[36]。同時，當前大多研究主要以豬為模型研究乳寡糖對新生動物腸道健康的影響，其處理劑量、飼喂環(huán)境、營養(yǎng)干預方式與實際生產(chǎn)有一定差異，導致乳寡糖在仔豬上的飼喂效果存在差異，因而需要更多的生產(chǎn)試驗研究乳寡糖對新生仔豬腸道健康的影響。

4 總結(jié)與展望

乳寡糖是新生哺乳動物重要的功能性低聚糖，其特定的結(jié)構(gòu)賦予其特殊的生理功能，不同模型的試驗已經(jīng)證明乳寡糖對新生動物腸道健康的積極效果。根據(jù)特殊乳寡糖可作為病原體特異性受體類似物，競爭性地抑制病原體與腸上皮黏附的特性，可以開發(fā)由黏膜病原體引起的腸道疾病的新型預防和治療劑，從而代替抗生素的使用。生產(chǎn)中已經(jīng)開始以乳寡糖為重要手段研發(fā)仔豬的抗病營養(yǎng)技術(shù)[46]，對于禁抗背景下，提高新生健康水平及存活率具有重要作用。

但目前有關(guān)乳寡糖在生產(chǎn)中的應用尚存亟待研究的問題，如目前尚缺乏混合型乳寡糖最佳比例的研究，且現(xiàn)有的研究大多采用的是體外模型，還需要使用更多體內(nèi)試驗研究乳寡糖、微生物群、宿主之間的復雜相互作用。