C 型凝集素Dectin-2 對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化M2 型巨噬細(xì)胞活化和凋亡的作用及機(jī)制研究

徐玉順 鄭 丹 宋 偉

動(dòng)脈粥樣硬化是一種動(dòng)脈壁慢性炎性疾病，由免疫細(xì)胞的侵入、增殖和激活驅(qū)動(dòng)和維持，巨噬細(xì)胞在其中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。巨噬細(xì)胞的活化分為經(jīng)典激活（M1）型和交替活化（M2）型，M2 型巨噬細(xì)胞在人類和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中起預(yù)防作用[2]。在白介素4（IL-4）刺激下，巨噬細(xì)胞發(fā)生M2 型活化，抵抗氧化修飾低密度脂蛋白（ox-LDL）的攝取以及轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞，進(jìn)而減小噬斑大小和增強(qiáng)噬斑穩(wěn)定性[3]。然而M2 型巨噬細(xì)胞活化機(jī)制尚不明確。樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)凝集素-2（Dectin-2）是C 型凝集素受體家族成員，此前研究發(fā)現(xiàn)Dectin-2 在固有巨噬細(xì)胞（稱為Kupffer 細(xì)胞）中發(fā)揮功能，以介導(dǎo)癌細(xì)胞的攝取和清除[4]。研究表明，敲除造血細(xì)胞Dectin-2 可以明顯降低動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域炎癥反應(yīng)，提示Dectin-2 可能參與調(diào)控巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[5]。然而Dectin-2 對(duì)M2 型巨噬細(xì)胞的具體作用以及調(diào)控機(jī)制尚不明確，基于此，本研究將探討Dectin-2 對(duì)M2型巨噬細(xì)胞活化的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng) 物 C57BL/6 小鼠（6～8 周齡，雄性，SPF級(jí)）購(gòu)自維亞生物科技（上海）有限公司，使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2020-0001。

1.2 試 劑 巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）（批號(hào)121357）購(gòu)自賽業(yè)生物科技有限公司；胎牛血清（批號(hào)12484010）、DMEM/F12（批號(hào)11320033）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；鼠IL-4 因子（批號(hào)PRP100498）購(gòu)自艾美捷科技有限公司；紅細(xì)胞裂解液（批號(hào)155246）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)QP056）及熒光定量PCR 試劑盒（批號(hào)QP076）均購(gòu)自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒（批號(hào)23185）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen Life Technologies Inc.，Carlsbad，CA；兔單抗Dectin-2（批號(hào)ab107572）購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；兔單抗信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（STAT6）（批號(hào)5397）、兔單抗磷酸化信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（p-STAT6）（批號(hào)56554）、山羊抗兔Alexa Fluor 488 偶聯(lián)二抗（批號(hào)265121）均購(gòu)自賽信通（上海）生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器 CFX96 Touch 熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)[BIO-RAD 儀，伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司]；FACSAriaTMⅢ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司）；酶標(biāo)儀SpectraMax 5 [美谷分子儀器（上海）有限公司]HerasafeTM2030i Biological Safety Cabinets 生物安全柜（美國(guó)賽默飛公司）；Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR 公司）；VE 680 微型垂直電泳設(shè)備（上海天能科技有限公司）；-80℃超低溫冰箱（美國(guó)賽默飛公司）；CelMate 二氧化碳培養(yǎng)箱（Esco Lifesciences，新加坡藝思高科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 骨髓來(lái)源巨噬（BMDM）的分離和培養(yǎng) 小鼠采用椎脫臼處死后，利用75%酒精消毒，取小鼠后肢股骨，用1mL 注射器吸取含有1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基插入股骨處反復(fù)沖洗，收集沖洗液離心沉降細(xì)胞。加入紅細(xì)胞裂解液破紅后再次離心，750rpm 離心5min，加入含巨噬細(xì)胞M-CSF 的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，加50U/mL 青霉素和鏈霉素。7 天后即可得到成熟的骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞。為敲降巨噬細(xì)胞Dectin-2，細(xì)胞鋪板后轉(zhuǎn)染siDectin-2 或及其對(duì)照siNC，6h 后換液，24h 檢測(cè)敲降效率。對(duì)于M2 極化，BMDM 用IL-4（20ng/mL）處理24h 即可檢測(cè)M2 極化標(biāo)志物，對(duì)照組加入等體積PBS。

2.2 熒光定量PCR 巨噬細(xì)胞經(jīng)上述IL-4 刺激后，利用trizol 法提取RNA，逆轉(zhuǎn)為cDNA。RT-PCR 引物均購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，引物序列如下：GAPDH：上游引物5'-TGGATTTGGACGCATTGGTC-3'；下游引物5'-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3'；Dectin-2：上游引物5'-AAGCGGAGCAGAATTTCATCA-3’；下游引物5'-CCATTTGCCATTACCTTGTGGA-3'；Arg1：上游引物5'-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-3'；下游引物5'-AGGAGCTGTCATTAGGGACATC-3'；Ym1：上游引物5'-TCTCTACTCCTCAGAACCGTCAGA-3'；下游引物5'-ATGTTTGTCCTTAGGAGGGCTTC-3'；FIZZ1：上游引物5'-TACTTGCAACTGCCTGTGCTTACT-3'；下游引物5'-TATCAAAGCTGGGTTCTCCACCTC-3'。RT-PCR 程序?yàn)椋?4℃，2min 預(yù)變形；98℃，10s 變性；60℃，30s 退火；72℃，30s 延伸；循環(huán)數(shù)：35 個(gè)。

2.3 細(xì)胞免疫熒光 巨噬細(xì)胞鋪板于細(xì)胞爬片上，經(jīng)上述步驟加入IL-4 刺激后，取出經(jīng)4%PAF 固定，0.5% triton 破膜后，利用5% BSA 封閉液封閉，兔單抗Dectin-2（稀釋于5%BSA 中，稀釋比1:200）4℃孵育過(guò)夜。PBS 洗去一抗后室溫孵育山羊抗兔Alexa Fluor 488 偶聯(lián)二抗（稀釋于5%BSA 中，稀釋比1:400）1h。利用DAPI 室溫孵育10min 標(biāo)記細(xì)胞核。通過(guò)Nikon A1R 共聚焦顯微鏡成像分析。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將siDectin-2 或及其對(duì)照siNC 轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞（1.5×105/孔）鋪板并與ox-LDL 孵育24h，然后在收集前用胰蛋白酶消化。通過(guò)膜聯(lián)蛋白V/PI 雙重染色，通過(guò)細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒確定凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析染色的細(xì)胞。

2.5 蛋白免疫印跡（WB）法檢測(cè)STAT6 磷酸化 將siDectin-2 或及其對(duì)照siNC 轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞（1.5×105/孔）鋪板并加入IL-4（20ng/mL）刺激24h。收集細(xì)胞蛋白后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。4℃過(guò)夜孵育一抗（抗體稀釋比均為1:1000），熒光二抗室溫孵育1h。掃膜儀進(jìn)行顯影。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 IL-4 刺激促進(jìn)巨噬細(xì)胞Dectin-2 表達(dá) 利用IL-4 刺激BMDM 24h 后檢測(cè)Dectin-2 表達(dá)，結(jié)果顯示，IL-4 在10、20ng/mL 的濃度下均促進(jìn)Dectin-2 的表達(dá)（見(jiàn)表1），同時(shí)IL-4（20ng/mL）刺激巨噬細(xì)胞后，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)也觀察到Dectin-2 在巨噬細(xì)胞中表達(dá)升高，見(jiàn)插頁(yè)圖1。

圖1 IL-4 刺激巨噬細(xì)胞Dectin-2 表達(dá)上調(diào)（免疫熒光X800）

表1 各組Dectin-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）

表1 各組Dectin-2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）

注：對(duì)照組為巨噬細(xì)胞加入PBS 培養(yǎng)24h；IL-4（10ng/mL）組為巨噬細(xì)胞加入10ng/mL IL-4 培養(yǎng)24h；IL-4（20ng/mL）組為巨噬細(xì)胞加入20ng/mL IL-4 培養(yǎng)24h；Dectin-2 為樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)凝集素-2；IL-4為白介素4；與對(duì)照組比較，aP＜0.05

3.2 Dectin-2 缺失抑制M2 型巨噬細(xì)胞活化 通過(guò)siRNA 敲降BMDM 中Dectin-2 后，利用IL-4（20ng/mL）刺激24h 檢測(cè)巨噬細(xì)胞M2 型活化標(biāo)志物，結(jié)果顯示，與IL-4+siNC 組相比，IL-4+siDectin-2 組中巨噬細(xì)胞M2 型標(biāo)志物精氨酸酶1（Arg1）、抵抗素樣分子α（FIZZ1）、幾丁質(zhì)酶3（Ym1）的表達(dá)均明顯下調(diào)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組Arg1、FIZZ1、Ym1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）

表2 各組Arg1、FIZZ1、Ym1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）

注：siNC 組為巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染siNC 24h 加入PBS 培養(yǎng)24h；siDectin-2組為巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染siDectin-2 敲降Dectin-2 加入PBS 培養(yǎng)24h；IL-4+siNC 組為巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染siNC 24h 后加入IL-4（20ng/mL）刺激24h；IL-4+siDectin-2 組為巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染siDectin-2 24h 后加入IL-4（20ng/mL）刺激24h；Dectin-2 為樹(shù)突狀細(xì)胞相關(guān)凝集素-2；Arg1 為精氨酸酶1；FIZZ1 為抵抗素樣分子α；Ym1 為幾丁質(zhì)酶3；與siNC 組比較，aP＜0.05；與IL-4+siNC 組相比，bP＜0.05

3.3 Dectin-2 敲降抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡 通過(guò)siRNA 敲降BMDM 中Dectin-2 后，加入ox-LDL 促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞脂質(zhì)并誘導(dǎo)凋亡。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 敲降可以明顯抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。ox-LDL+siNC 組凋亡率為（30.04±0.62）%；ox-LDL+siDectin-2 組凋亡率為（12.36±1.07）%。見(jiàn)插頁(yè)圖2。

圖2 Dectin-2 敲降抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡

3.4 Dectin-2 敲降抑制STAT6 磷酸化 通過(guò)siRNA敲降BMDM 中Dectin-2 后，利用IL-4（20ng/mL）分別刺激0、5、30、60min 檢測(cè)巨噬細(xì)胞STAT6 磷酸化水平，WB 檢測(cè)結(jié)果顯示，Dectin-2 敲降明顯抑制STAT6 磷酸化激活。見(jiàn)圖3。

4 討論

動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中巨噬細(xì)胞的極化及其對(duì)脂質(zhì)的吞噬是導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成及動(dòng)脈斑塊不穩(wěn)定的重要原因之一。巨噬細(xì)胞進(jìn)入斑塊后發(fā)生極化，分泌多種分泌促炎和抗炎的細(xì)胞因子，從而影響斑塊穩(wěn)定性[6]。前期研究表明，增加斑塊組織中M2 型抗炎巨噬細(xì)胞的比例，可以減輕斑塊局部的炎性反應(yīng)，增加斑塊組織的穩(wěn)定性，而M1 型促炎巨噬細(xì)胞則大量存在于不穩(wěn)定斑塊中[7]。因此解析動(dòng)粥斑塊中巨噬細(xì)胞極化的分子調(diào)控機(jī)制成為進(jìn)一步了解動(dòng)粥斑塊穩(wěn)定的關(guān)鍵。

圖3 Dectin-2 敲降抑制STAT6 磷酸化

Thiem 等[5]將造血細(xì)胞中Dectin-2 敲除后，通過(guò)骨髓置換手術(shù)到Ldlr-/-轉(zhuǎn)基因小鼠中，再通過(guò)高脂喂養(yǎng)構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 缺失后明顯減輕動(dòng)粥病灶部位炎癥反應(yīng)，Ly6C 陽(yáng)性的單核細(xì)胞明顯減少，同時(shí)LPS 刺激后，小鼠腹膜巨噬細(xì)胞明顯減少，提示Dectin-2 在調(diào)控巨噬細(xì)胞功能過(guò)程可能發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞Dectin-2 在IL-4 誘導(dǎo)后表達(dá)明顯升高，敲降Dectin-2 抑制巨噬細(xì)胞M2 型活化。同時(shí)利用誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵脂質(zhì)分子ox-LDL 刺激巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 敲降明顯抑制細(xì)胞凋亡。因此我們推測(cè)Dectin-2 在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程起到保護(hù)作用。

目前關(guān)于Dectin-2 調(diào)控其他免疫細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 通過(guò)其跨膜結(jié)構(gòu)域與包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序（ITAM）的信號(hào)傳導(dǎo)銜接子FcRγ 結(jié)合，并可以招募B 細(xì)胞內(nèi)Syk，從而激活其下游CARD9/NF-κB 途徑[5，8-11]。而M2 型巨噬細(xì)胞的活化主要依賴于STAT6 的磷酸化激活[12-13]，因此本研究探究了Dectin-2 對(duì)STAT6 活化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dectin-2 敲降能夠明顯抑制IL-4 刺激誘導(dǎo)的STAT6 磷酸化，從而抑制M2 極化標(biāo)志物的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)在炎癥因子IL-4 刺激下，巨噬細(xì)胞Dectin-2 表達(dá)上調(diào)，敲降Dectin-2 可以抑制IL-4 誘導(dǎo)的M2 型巨噬細(xì)胞活化以及ox-LDL 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控STAT6 磷酸化水平。