血清miR-29b、miR-126 與老年糖尿病視網(wǎng)膜病變的相關性分析

戴林雄 何 斐 泮瑛瑛 張 偉 應 巧

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是導致患者失明的主要原因[1]。我國DR 的患病率為24.7%～37.5%，其具體發(fā)病機制至今尚未完全清楚，給患者身心健康和生活質量帶來嚴重影響[2]。尋找DR 致盲相關標志物對DR 診治具有重要意義。微小核糖核酸（miRNA）作為一種高度保守的短小RNA，在細胞增殖、凋亡，腫瘤發(fā)生、免疫反應及血管新生等多種生物學行為中有重要作用[3-4]。本研究擬檢測老年DR 患者血清miR-29b、miR-126 水平，探討血清miR-29b、miR-126 水平異常與老年DR 發(fā)病及進展的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取浙江省臺州市立醫(yī)院2017 年5 月—2019 年11 月收治的老年DR 患者126 例作為研究對象。依據(jù)2002 年國際糖尿病性視網(wǎng)膜病變分期標準[5]對DR 患者分期，將單純2 型糖尿病患者納入DM 組（42 例），非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變作為NPDR 組（40 例），增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)镻DR 組（44 例），同時，選取40 名年齡≥60 歲的老年體檢者作為對照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過（批準編號：倫審-2017-0039）。受試者均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標準 納入標準：（1）糖尿病患者均符合《中國2 型糖尿病防治指南（2017 年版）》中2 型糖尿病的診斷標準[6]；（2）經(jīng)裂隙燈顯微鏡、間接檢眼鏡和眼底血管造影檢查確診為DR；（3）年齡≥60 歲。排除標準：（1）患有微血管異常者；（2）臨床資料不詳細；（3）惡性腫瘤及其他眼內疾病者。

1.3 試劑及儀器 Trizol 總RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen 公司，批號15596018）；逆轉錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒（生工生物工程上海股份有限公司，批號B532435-0020、B532461-0001）；紫外分光光度計（美國HACH 公司，型號：DR6000 型）；熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司，型號：7500 型）；血糖儀（德國羅氏診斷有限公司，型號：Accu-Chek Active）。

1.4 指標測定 （1）測靜息狀態(tài)下右臂肱動脈收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）；（2）早晨空腹抽取受試者外周靜脈血15mL，測定糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等指標；（3）另抽取兩管5mL 靜脈血于EDTA 抗凝管中，離心后分離血清備檢。利用Trizol 總RNA 提取試劑盒提取血清總RNA，紫外分光光度計檢查樣品RNA 濃度，取A260/A280≥1.80 樣品完成后續(xù)實驗。將總RNA 逆轉錄成cDNA（按Qiagenmi Script Reverse Transcripition Kie 說明書進行）。取逆轉錄產(chǎn)物為模板，利用定量PCR 試劑盒以及miR-29b 和miR-126與管家基因U6 為內參的特異性引物進行實時定量PCR 檢查（miRNA-29b 上游引物5'-UAGCAUCACAGAAAUAUUGGC-3'，miRNA-29b 下游引物5'-CAAUAUUUCUGUGCUGCUAUU-3'；miRNA-126 上游引物5'-UGAGAACUGUAUUCCAUGGGUU-3'，miRNA-126 下游引物5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGUGUU-3'；U6 上游引物5'-GCCAAGGCTGTGGGCAAGGTAT-3'，U6 下游引物5'-TCTCCAGGCGGCACGCAGAATG-3'。以上引物由上海豐壽實業(yè)有限公司合成），所有反應均設置3 個復孔，反應條件為95℃15min、94℃ 15s、58℃ 30s、70℃ 30s，30 個循環(huán)。采用實時定量PCR 儀進行檢測，以U6 為內參照，使用2-ΔΔCT 法計算miRNA-29b 和miRNA-126 相對表達量。（4）使用血糖儀測量患者空腹血糖（FBG）及餐后2h 血糖（2hPG）。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（） 表示，采用單因素方差分析比較不同組血清miR-29b、miR-126、FBG、2hPG、HbA1c，多重比較采用LSD-t 檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗的采用率和構成比描述；采用二分類Logistic 逐步回歸分析探討老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的影響因素，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四組研究對象一般資料比較 四組研究對象的性別、年齡及BMI 比較均無明顯差異（P＞0.05），NPDR 組和PDR 組糖尿病病程明顯大于DM 組，PDR 組糖尿病病程明顯大于NPDR 組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組研究對象一般資料比較（）

表1 各組研究對象一般資料比較（）

注：對照組為老年體檢者；DM 組為單純2 型糖尿病患者；NPDR 組為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；PDR 組為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；BMI 為體質指數(shù)；“-”為無比項數(shù)據(jù)；與DM 組比較，aP＜0.05；與NPDR 組比較，bP＜0.05

2.2 四組生化指標比較 四組血清miR-29b 和miR-126 水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），其中PDR 組血清miR-29b 水平明顯高于對照組、DM組及NPDR 組（P 均＜0.01），miR-126 水平明顯低于對照組、DM 組及NPDR 組（P 均＜0.01）；NPDR 組血清miR-29b 明顯高于DM 組和對照組（P＜0.05），miR-126 明顯低于DM 組和對照組（P＜0.05）；NPDR組及PDR 組SBP、DBP 明顯高于對照組（P＜0.05），NPDR 組、PDR 組及DM 組FBG、2hPG、HbA1c、TG、TC、HDL-C 水平明顯高于對照組（P＜0.05），PDR 組FBG、2hPG、HbA1c、TG 水平明顯高于DM 組（P＜0.05）。見表2。

2.3 影響糖尿病患者視網(wǎng)膜病變單因素分析 DR患者年齡、糖尿病病程、血清miR-29b、miR-126、HbA1c、FBG 等因素具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 影響糖尿病視網(wǎng)膜病變的多因素分析 以視網(wǎng)膜病變?yōu)橐蜃兞浚o=0、有=1），以表3 中有意義的變量為自變量進行二分類Logistic 逐步回歸分析，結果顯示，年齡＜75 歲、血清miR-126≥2.43ng/μL 為老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的保護因素，糖尿病病程≥7.00 年、血清miR-29b≥8.38ng/μL、HbA1c≥6.00%、FBG≥8.15mmol/L 為老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的危險因素。見表4。

3 討論

DR 是一種具有特異性改變的眼底病變，最主要的病理特征是視網(wǎng)膜微血管出現(xiàn)功能障礙[7]。DR 是糖尿病患者的常見并發(fā)癥，占比高達40.3%[8]，目前研究認為DR 的發(fā)病是由多種因素綜合作用的結果，主要包括高血糖、代謝異常、蛋白質非酶促糖基化、血流動力學障礙、氧自由基形成、凝血機制異常及血管增生因子等因素。既往有研究顯示，視網(wǎng)膜早發(fā)性小膠質細胞活化、白細胞介素-18 mRNA 及其蛋白表達增加，表明視網(wǎng)膜病可能是由調控新生血管內皮細胞遷移與定位的基因促使[8-9]。

miRNA 不僅對哺乳動物細胞的生長、增殖、凋亡具有調節(jié)作用，同時在干細胞的分化過程中也發(fā)揮重要作用。DR 的發(fā)生發(fā)展需要細胞間的信號轉導，miRNA 也介導參與了DR 發(fā)生發(fā)展過程[10-11]。血清miR-29b 是微小RNA-29 家族（microRNA-29）成員之一，其通過miR-29 家族在酸性富含半胱氨酸分泌型蛋白、層黏連蛋白及I、Ⅳ型膠原蛋白等是DR 上起重要作用[12]。miR-126 作為miRNA 重要類型，定位于表皮生長因子樣結構域7（EGFL7）基因3′UTR 內含6、7，可影響EGFL7 對新生血管內皮細胞移動與定位的調控功能[13]。研究表明，上調miR-126 表達可促進血管新生，并可維持血管內皮細胞穩(wěn)定及完整性；亦有研究指出，miR-126 可通過降低血管內皮生長因子（VEGF）水平而影響內皮細胞功能[14-15]。

表2 各組生化指標比較（）

表2 各組生化指標比較（）

注：對照組為老年體檢者；DM 組為單純2 型糖尿病患者；NPDR 組為非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；PDR 組為增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；SBP 為收縮壓；DBP 為舒張壓；FBG 為空腹血糖；2hPG 為餐后2h 血糖；HbA1c 為糖化血紅蛋白；TG 為三酰甘油；TC 為總膽固醇；HDL-C 為高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C 為低密度脂蛋白膽固醇；miR-29b 為微小核糖核酸-29b；miR-126 為微小核糖核酸-126；1mmHg=0.133kPa；與對照組比較，aP＜0.05；與DM 組比較，bP＜0.05；與NPDR 組比較，cP＜0.05

表3 影響糖尿病患者視網(wǎng)膜病變單因素分析[n（%）]

表3 影響糖尿病患者視網(wǎng)膜病變單因素分析[n（%）]（續(xù)）

表4 老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的影響因素Logistic 回歸分析

本研究結果顯示，PDR 組血清miR-29b 水平明顯高于對照組、DM 組及NPDR 組（P＜0.01），miR-126水平明顯低于對照組、DM 組或NPDR 組（P＜0.05）；NPDR 組血清miR-29b 明顯高于DM 組和對照組（P＜0.05），miR-126 明顯低于DM 組和對照組（P＜0.05 ）；表明血清miR-29b 水平隨病情加重而升高，與DR 患者的總體生存率獨立相關，DR 患者血清miR-29b 表達水平與DR 發(fā)病、轉移和預后密切相關，也在DR 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，DR 患者血清高表達的miR-29b 可能通過促進視網(wǎng)膜血管生成而促進發(fā)病及病程進展；此外血清miR126 水平在DR 患者明顯降低，可能參與DR 發(fā)病過程，表明miR126可較好地判別糖尿病患者發(fā)生DR，可能成為早期發(fā)現(xiàn)糖尿病患者發(fā)生DR 的血液指標。多因素Logistic逐步回歸分析探討DR 患者的危險因素，結果顯示，患者年齡＜75 歲、血清miR-126≥2.43ng/μL 為老年糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的保護因素，糖尿病病程≥7.00 年，血清miR-29b≥8.38ng/μL、HbA1c≥6.00%、FBG≥8.15mmol/L 為老年患者糖尿病視網(wǎng)膜病變的危險因素，可能是因為病程越長，機體各項功能減退越嚴重，代謝能力隨之降低，易導致血管病變發(fā)生，從而對視網(wǎng)膜病變起到一定的推動作用，同時提示血清miR-29b、miR-126 與DR 發(fā)生、發(fā)展密切相關。

綜上所述，老年DR 患者血清miR-29b 水平升高，miR-126 水平降低，二者可能成為早期發(fā)現(xiàn)DR的血清生物標志物。