腸道病毒EV-D68 的研究進(jìn)展

黃 浩

（梧州市疾病預(yù)防控制中心傳染病科，廣西梧州 543002）

腸道病毒D68（EV-D68）是腸道病毒屬的一種。腸道病毒屬包括人腸道病毒A、B、C、D 和人鼻病毒A、B、C，按不同的基因型可進(jìn)一步分類。與大多數(shù)耐酸并在胃腸道繁殖的腸道病毒不同，EV-D68 對(duì)酸敏感，其物理生化特性與其他腸道病毒差異較大，反而與人類鼻病毒（Human rhinovirus）較為相似，感染后主要引起呼吸道疾病，少數(shù)病例可表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)疾病和急性弛緩性脊髓炎（Acute flaccid myelitis，AFM），嚴(yán)重情況下甚至可以導(dǎo)致感染者死亡[1]。目前，EV-D68 還沒有針對(duì)性的疫苗和特效藥物。本文就EV-D68 在流行特點(diǎn)、病毒結(jié)構(gòu)、致病機(jī)理方面的研究進(jìn)行綜述，為更好地預(yù)防和控制EV-D68 相關(guān)疾病及疫苗的研制提供理論依據(jù)。

1 流行情況

1962 年EV-D68 病毒毒株首次在美國加州分離。20 世紀(jì)60 年代觀察到的、相關(guān)記錄表明：EV-D68 與散發(fā)的呼吸道疾病病例有關(guān)。美國在1970 年和2005年僅報(bào)告了26 例，1970-2013 年間在歐洲、非洲和東南亞共報(bào)告了699 例。2014 年夏末出現(xiàn)EV-D68 導(dǎo)致兒童嚴(yán)重呼吸道感染的疫情爆發(fā)，美國報(bào)告了1153 例嚴(yán)重呼吸道感染和107 例AFM。加拿大近700 例，包括8 例AFP 和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾??；智利有2 例；歐洲為408 例；中國、泰國報(bào)告25 例AFM 病例。2014 年后該病毒雖仍在世界范圍內(nèi)廣泛流行，卻未再出現(xiàn)如2014年般大規(guī)模的疫情。對(duì)疾病認(rèn)知增加及診斷方法提高、部分Clade B 毒株VP1 蛋白的特異性氨基酸改變和基因重組，被認(rèn)為是爆發(fā)的可能原因[2-3]。

大多數(shù)EV-D68 感染的病例報(bào)道來自兒童，而血清學(xué)調(diào)查顯示感染涉及所有年齡組，血清陽性率在50～59 歲的人群最高[4]。流行季節(jié)處于或晚于典型的腸道病毒季節(jié)（夏秋）[5]。北半球檢測高峰出現(xiàn)在8～10 月，持續(xù)到冬季。南半球的新西蘭6 月（冬季）為發(fā)病高峰。南非為4～7 月（秋冬）。泰國則在夏季和雨季（5-10 月），菲律賓主要在旱季，部分病例出現(xiàn)在雨季[6-9]。

EV-D68 至今出現(xiàn)多個(gè)亞型和分支，包括原型株（Fermon 株）和4 個(gè)分支（Clade A、B、C 和D）。Clade A、B、C 在美洲、歐洲和亞洲普遍存在且引起共循環(huán)，但Clade C 是最不常見的亞型。美國2014 年疫情和近年流行株為Clade A1、B1、B4、B5。2014 年的歐洲，如意大利和荷蘭，流行株為Clade A1、D、B1 和B2。加拿大是Clade B2。在泰國、日本等亞洲國家，報(bào)告為Clade B 和C。中國則為Clade A2（2016 年以來被重新分類為分支D）和B2[10-11]。中國自2006 年開始發(fā)生基因群替換，2011 年8 月以Clade A 為主，其他株僅零星分布。Clade B 于2011 年10 月出現(xiàn)，并與Clade A 共同流行至2013 年11 月。在2014 年，優(yōu)勢(shì)株由Clade A 向Clade B[12]轉(zhuǎn)移。幸運(yùn)的是中國的基因群替換并沒有導(dǎo)致疫情爆發(fā)。

2 進(jìn)化

EV-D68 自原型株以來經(jīng)歷了重大的遺傳變化。主要變異區(qū)域包括VP1 衣殼蛋白、5’UTR 和一些非結(jié)構(gòu)蛋白。VP1 在抗原性中起主要作用，是受體結(jié)合位點(diǎn)。VP1 序列的變異可能是EV-D68 發(fā)生流行病學(xué)轉(zhuǎn)移的原因之一。非結(jié)構(gòu)蛋白2C 和3Dpol 也是常見的變異位點(diǎn)，是病毒復(fù)制的關(guān)鍵決定因素。部分分支毒株與原型株在核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）和開放閱讀框（ORF）之間的5’UTR 出現(xiàn)空間壓縮的差異，可能與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）活性增加有關(guān)[13-14]。包括脊髓灰質(zhì)炎病毒在內(nèi)的其他腸道病毒中，5’UTR 是被公認(rèn)的毒性決定因素，其變異可能有助于增強(qiáng)毒性[15]。荷蘭發(fā)現(xiàn)2010 年EVD68 循環(huán)增加與VP1 基因序列多態(tài)性增加相一致[16]。2012-2014 年美國在AFM 病例分離的Clade B1 株在整個(gè)ORF 中包含6 個(gè)多態(tài)性，其中5 個(gè)與脊髓灰質(zhì)炎病毒和EV-D70 序列同義[17]。另外2014 年美國與AFM 有關(guān)的Clade B1 株發(fā)現(xiàn)與其他嗜神經(jīng)腸道病毒共有的12 個(gè)多態(tài)性主要集中在5’UTR，其次是2C、VP1 和3D[18]。Clade B3 與B1 具有共同祖先。Clade B3 的多態(tài)性分布在整個(gè)ORF 中，以VP1 最常見。但與嗜神經(jīng)的Clade B1 序列相似的多個(gè)位點(diǎn)并不存在。而美國和歐洲2016 年和2018 年的疫情中以Clade B3 為主導(dǎo)，包括AFM 病例[19-20]，2018 年美國分離株都是Clade B3[21]。這些單核苷酸突變通常被認(rèn)為是病毒復(fù)制過程中的隨機(jī)事件。此外還觀察到如5’UTR間隔區(qū)缺失，至少有一次亞支之間的重組等更大的突變事件發(fā)生，因此病毒進(jìn)化與AFM 發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)仍有待進(jìn)一步研究。

3 血清流行病學(xué)

2015年中國（不包含港澳臺(tái)地區(qū)）的一項(xiàng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)前婦女及新生兒EV-D68 中和抗體陽性率為100%，6個(gè)月至1 歲的嬰兒中和抗體滴度均低于1∶64。分析認(rèn)為產(chǎn)前婦女可將EV-D68 抗體傳遞給新生兒。2017年中國臺(tái)灣省的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1 歲以下嬰兒的EV-D68 血清陽性率為32%，1 歲兒童為18%，2 歲～15 歲陽性率由43%升至98%，16～49 歲的成人為100%[22]。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：1 歲以下嬰兒血清中和抗體滴度與年齡呈負(fù)相關(guān)，1～15 歲兒童則與年齡呈正相關(guān)，11～15 歲兒童滴度最高。此外，嬰兒0～8 月的血清陽性率和抗體滴度逐漸下降。8 月后抗體滴度緩慢增加，中和抗體陽性率則進(jìn)一步下降，提示嬰兒在8 個(gè)月左右可因來自母體的抗體的保護(hù)力下降而出現(xiàn)早期感染。中國內(nèi)地、芬蘭、英國、荷蘭、美國等地的研究有相似的結(jié)果，血清陽性率在不同國家之間沒有很大差異[5，23]。日本發(fā)現(xiàn)血清中和抗體滴度在疫情期間上升，但疫情后的一年內(nèi)下降[24]。因此，可能EV-D68 已在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，但僅報(bào)道了有限數(shù)量的嚴(yán)重病例。

4 病毒結(jié)構(gòu)

EV-D68 的衣殼由VP1、VP2、VP3 和VP4 四種不同病毒蛋白各60 個(gè)拷貝組成。VP1-VP4 構(gòu)成一個(gè)不對(duì)稱的亞單位，5 個(gè)亞單位形成五聚體，12 個(gè)五聚體組成病毒衣殼。VP1、VP2 和VP3 以偽T=3 的對(duì)稱規(guī)則構(gòu)成衣殼外表面，各自由兩個(gè)反向平行的蛋白片段構(gòu)成一個(gè)內(nèi)部疏水的β 桶狀結(jié)構(gòu)的“果凍卷”樣褶皺，其二級(jí)結(jié)構(gòu)是8 條反向平行的β 鏈[25]。VP4 在衣殼內(nèi)表面形成一個(gè)延伸的肽段，與病毒內(nèi)部的RNA 基因組相接。5 個(gè)五聚體頂點(diǎn)形成一個(gè)表面凹陷的結(jié)構(gòu)（“峽谷”），是與唾液酸等受體結(jié)合的位置[26]。峽谷北側(cè)（North rim 區(qū)）由VP1 的BC、EF 和HI 莖環(huán)形成。峽谷南側(cè)由puff區(qū)（VP1 的GH、VP2 的EF 莖環(huán)和部分VP1的C 端的殘基）、knob 區(qū)（VP3 的N 端和VP1 的C 端的部分氨基酸殘基組成）和VP2 的HI 和VP3 的HI莖環(huán)共同構(gòu)成。與其他EV 比較，EV-D68 的VP3 C 端α 螺旋結(jié)構(gòu)較短，因此，峽谷較其他EV 狹窄，無法與大分子蛋白結(jié)合。Liu[27]等發(fā)現(xiàn)酸性條件下，完整病毒顆粒出現(xiàn)VP1-VP4 旋轉(zhuǎn)，直徑約擴(kuò)展8? 膨脹形成E1 顆粒，靠近五倍軸的VP1β-桶狀體和莖環(huán)以鉸鏈方式重排，VP2 的N 端氨基酸殘基重排，二倍軸周圍產(chǎn)生了6×15? 大小的孔洞，五聚體相互連接減弱，從而導(dǎo)致VP4的內(nèi)化和VP1 N端外化，E1顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)锳顆粒（即脫殼中間體），位于峽谷底部“口袋因子”擠出導(dǎo)致病毒顆粒去穩(wěn)定化，釋放感染性遺傳物質(zhì)后轉(zhuǎn)變?yōu)榭疹w粒。

VP1 的BC 和DE 莖環(huán)在小核糖核酸病毒中是結(jié)構(gòu)上最多變的。EV-D68 VP1 有兩個(gè)無序區(qū)域，分別對(duì)應(yīng)于BC 莖環(huán)的80-86 殘基和DE 莖環(huán)的129-136 殘基，這兩個(gè)區(qū)域都接近五重軸。在HRV 上這些區(qū)域通常是中和性免疫原位點(diǎn)[28]。因此，在五重軸周圍靈活的免疫原性區(qū)域可能是逃避宿主體液免疫反應(yīng)的一種替代機(jī)制。

5 致病機(jī)理

與人類鼻病毒（HRV）物種成員相似，33 ℃曾被證明是EV-D68 的最佳生長溫度。但2014 年分離的毒株在32 ℃和37 ℃下復(fù)制效率相同[13]。這有可能導(dǎo)致新的EV-D68 毒株明顯增加了引發(fā)全身感染和神經(jīng)侵襲的傾向。

ICAM-5 對(duì)唾液酸依賴/非依賴的EV-D68 毒株都能增強(qiáng)病毒復(fù)制。在不敏感的細(xì)胞株中傳染該蛋白會(huì)導(dǎo)致EV-D68 感染[29]。α2，6 和α2，3 唾液酸受體均是EV-D68 的功能受體。由于唾液酸受體的表達(dá)在上呼吸道（α2，6 唾液酸受體為主）和下呼吸道（α2，3 唾液酸受體為主）之間存在差異。EV-D68 對(duì)α2，6 唾液酸受體的親和力強(qiáng)于α2，3 唾液酸受體[30]。因此引起的疾病仍然以上呼吸道感染為主。

部分毒株可能保留與唾液酸結(jié)合的能力，同時(shí)存在其他的黏附因子或受體結(jié)合機(jī)制[29-30]。2014 年美國疫情期間發(fā)現(xiàn)的3 個(gè)Clade B 毒株能夠不依賴唾液酸感染人，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。此外EVD68 還可以用硫酸糖胺聚糖代替唾液酸。唾液酸、硫酸糖胺聚糖和ICAM-5 可能不同程度地增強(qiáng)EV-D68 毒株的感染，但不是感染所必需的。尤其是ICAM-5，因?yàn)槿梭w呼吸道和脊髓并不表達(dá)ICAM-5。

AFM 是最受關(guān)注的EV-D68 引起的嚴(yán)重疾病之一。毒株的進(jìn)化可能影響EV-D68 的神經(jīng)嗜性：當(dāng)代毒株（包括Clade B 的三個(gè)亞支）比原始株（Fermon 株、Rhyne 株）或2012 年的Clade A 毒株更易侵染神經(jīng)元樣SH-SY5Y 細(xì)胞[12]，并且對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有更強(qiáng)的趨向性[31]。Messacar 等人[32]發(fā)現(xiàn)EV-D68 可通過鼻腔上皮嗅神經(jīng)末梢的功能受體浸染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可能與神經(jīng)系統(tǒng)疾病有潛在關(guān)聯(lián)。病毒通過周圍神經(jīng)傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)是神經(jīng)侵襲性腸道病毒疾病的一個(gè)重要而保守的機(jī)制。Hixon[31]等發(fā)現(xiàn)EV-D68 麻痹性毒株IL/14-18952 可通過遠(yuǎn)端軸突被運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元吸收，然后沿軸突微管逆行到達(dá)神經(jīng)元胞體，但不能通過軸突的順行運(yùn)輸從軸突釋放。提示逆軸突轉(zhuǎn)運(yùn)是EV-D68 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的主要機(jī)制，其他還可能間接通過順行感覺和小腦連接或病毒血癥后肌肉感染逆行進(jìn)入脊髓。在進(jìn)入神經(jīng)肌肉系統(tǒng)之前可能會(huì)經(jīng)歷鼻內(nèi)、肺、血源性感染，類似于脊髓灰質(zhì)炎病毒從口咽部經(jīng)胃腸道進(jìn)入全身感染[13]。

6 展望

長久以來，EV-D68 作為引起嚴(yán)重呼吸道感染疾病和AFM 的病原體為人所關(guān)注。目前EV-D68 在世界各地均有流行，人群的血清陽性率提示其感染率較高。但全球未建立起相應(yīng)的監(jiān)測系統(tǒng)，因而無法對(duì)其造成的衛(wèi)生負(fù)擔(dān)進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估。在沒有特效藥物和疫苗可以使用的當(dāng)前，如果腸道病毒D68 變得更加流行，易感人群中、特別是有潛在呼吸道疾病的兒童，將面臨嚴(yán)重呼吸道疾病和破壞性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)。有學(xué)者建議將EV-D68 的病原監(jiān)測納入到已經(jīng)建立且運(yùn)作良好的脊髓灰質(zhì)炎病毒監(jiān)測系統(tǒng)[28]，或是將其納入非細(xì)菌性呼吸道疾病患者的一般病毒檢測項(xiàng)目中，并建立起相應(yīng)的監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，以進(jìn)一步了解其發(fā)病突然上升的機(jī)制及其異常、嚴(yán)重、復(fù)雜的疾病表現(xiàn)。對(duì)于EV-D68 感染的相關(guān)受體及引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病、AFM 等嚴(yán)重癥狀的機(jī)理，都有待通過進(jìn)一步的研究和建立完善監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)來給出答案。