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    重組腺相關病毒基因藥物三種滴度的比較與分析

    2021-07-30 02:18:58王曉黃曉平黎玲刁勇
    華僑大學學報(自然科學版) 2021年4期
    關鍵詞:衣殼滴度基因組

    王曉, 黃曉平, 黎玲, 刁勇

    (1. 華僑大學 醫(yī)學院, 福建 泉州 362021;2. 泉州師范學院 化工與材料學院, 福建 泉州 362000)

    重組腺相關病毒(rAAV)是一種無包膜的單鏈DNA病毒,因自身復制缺陷、基因組結構簡單、免疫原性小等優(yōu)點,被認為是目前最安全的基因治療載體之一[1-2].近年來,rAAV載體作為基因治療載體已在遺傳性疾病、癌癥、干細胞和神經退行性疾病等研究中取得了顯著的治療效果[3-6].目前,世界范圍內有100余項以rAAV為載體的基因藥物已完成或正在進行臨床研究[7].2017年12月,治療遺傳性視網膜病變的基因藥物Luxturna上市[8],這給基因治療帶來了美好前景.然而,規(guī)模化制備和質量控制等因素制約了rAAV在臨床上的應用,尤其是缺少準確、可靠的rAAV滴度定量標準方法,這使不同實驗室的rAAV劑量由于缺少參比標準而無法進行歸一化處理.

    rAAV滴度分為衣殼滴度、基因組滴度、轉導滴度和感染滴度等.目前,臨床劑量通?;趓AAV 載體的基因組滴度,準確地定量載體是藥物獲得最大療效和最小毒性的前提條件[9],也是不同工藝和不同廠家產品橫向比較的依據[10-11].實時熒光定量聚合酶鏈反應(Q-PCR)是常用的rAAV基因組滴度測定法,但傳統(tǒng)的Q-PCR具有適用范圍窄、易產生系統(tǒng)性誤差和易受雜質干擾等缺點[11-12];采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定衣殼滴度的價格昂貴,且無法區(qū)分空心病毒;轉導滴度受轉基因和細胞的限制,不具有普適性;感染滴度測定需要腺病毒輔助,再提取細胞DNA,通過Q-PCR測定病毒基因組拷貝數,測定過程繁瑣,尚未廣泛得到應用.腺相關病毒參比標準事務委員會推薦ELISA,Q-PCR,半數組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)等方法一起使用,作為rAAV 檢定的測量方法[13].由于TCID50的測量過程繁瑣、費時費力,故采用轉導方法代替TCID50.基于此,本文采用ELISA,Q-PCR和轉導方法對實驗室制備的rAAV進行定量.

    1 材料與方法

    1.1 質粒與細胞株

    質粒pCMV-ITR-GFP,pH22,pdf6為實驗室保存;細胞株293T購自美國模式菌種收藏中心(ATCC).

    1.2 主要試劑

    Real-time PCR試劑盒(美國Thermo Fisher公司);AAV2 Titration ELISA試劑盒(德國PROGEN Biotechnik公司);RNase(北京市莊盟生物科技公司);氯化銫(德國Sigma公司);Benzonase(德國Merk公司);聚乙烯亞胺(Polyethylenimine,PEI,美國Polysciences公司);DMEM,1640培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Gibco公司).

    1.3 rAAV的制備

    參照實驗室建立的制備rAAV方法,當293T細胞密度為85%時,進行三質粒共轉染,質粒與PEI按照質量比為1∶3進行混合,靜置后加入293T細胞中;72 h后收獲病毒,進行氯化銫梯度離心分離、透析和濃縮,制備rAAV,共制備3批rAAV,后續(xù)實驗每批重復3次.

    1.4 ELISA測定rAAV衣殼滴度

    采用AAV2 Titration ELISA試劑盒對rAAV進行定量.首先,將試劑盒中的標準品稀釋至107~109P·mL-1范圍內,以標準樣品濃度的對數值(lgCs)為橫坐標,以其光密度的對數值(lgD)為縱坐標,繪制rAAV標準曲線(圖1).然后,將rAAV2原液進行稀釋,按照說明書進行操作,酶標儀讀取光密度D450,通過標準曲線計算rAAV2衣殼滴度.

    圖1 rAAV標準曲線

    1.5 Q-PCR測定rAAV基因組滴度

    以GFPF5′-GAGCGCACCATCTTCTTCAA-3′;GFPR5′-TCCTTGAAGTCGATGCCCTT-3′為引物,以SYB-R Green為染料,反應體系為25 μL,反應條件為94 ℃變性20 s,60 ℃退火延伸40 s,40個反應循環(huán).

    1.6 轉導滴度的測定

    制備293T細胞懸液密度為1×105個·mL-1,按照100 μL·孔-1接種至96孔板,待細胞貼壁后加入rAAV;取10 μL病毒原液,按10倍進行梯度稀釋,取10 μL稀釋后的rAAV加入96孔板中;4 h后,更換為新鮮培養(yǎng)液并添加丁酸鈉;24 h后,觀察熒光表達情況,在最高稀釋梯度的孔中計算綠色熒光細胞數目,可得rAAV的轉導滴度.

    2 結果與分析

    2.1 rAAV衣殼滴度

    rAAV標準曲線的回歸方程為y=0.915x-8.032,相關系數R2=0.998,根據標準曲線計算3批包裝、純化的rAAV的衣殼滴度,結果如表1所示.表1中:SD為標準差.由表1計算可知:3批rAAV平均衣殼滴度為3.65×1013P·mL-1;不同批次制備得到的rAAV產量相差2倍左右,這是因為rAAV在制備過程中受到細胞狀態(tài)、數目、轉染條件和純化工藝等的影響.

    表1 不同批次的rAAV衣殼滴度

    2.2 rAAV基因組滴度

    以質粒pAMG-EGFP為標準品,繪制Q-PCR擴增曲線和標準曲線,如圖2所示.圖2中:ΔRn為產物的熒光值;C為循環(huán)次數;Ct為擴增過程中,擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時,熒光值對應的PCR循環(huán)次數;R2=0.998.依據標準曲線計算3批rAAV基因組滴度,結果如表2所示.由表2計算可知:3批rAAV平均基因組滴度為8.67×1011GC·mL-1.ELISA方法測得的rAAV不僅包括實心病毒、空心病毒,還包括不完整病毒.因此,ELISA測定的衣殼滴度一般比基因組滴度大,衣殼滴度與基因組的比值P/GC能體現(xiàn)rAAV在包裝和純化過程中的工藝優(yōu)劣.腺相關病毒參比標準事務委員會推出AAV2標準品的P/GC為28,而實驗室制備的3批rAAV的P/GC分別為42.16,40.33,42.61(平均值為41.70),與AAV2標準品的P/GC較為接近.

    (a) Q-PCR擴增曲線 (b) Q-PCR標準曲線

    表2 不同批次的rAAV基因組滴度

    2.3 rAAV轉導滴度

    以感染復數(MOI)為250∶1,500∶1,1 000∶1分別轉導Hela細胞,其熒光表達情況,如圖3所示.由圖3可知:隨著MOI增大,表達綠色熒光的細胞數目增多.rAAV經過稀釋后轉導293T細胞,觀察表達GFP細胞數目,統(tǒng)計分析得到rAAV轉導滴度,如表3所示.由表3計算可知:3批rAAV平均轉導滴度為9.85×109TU·mL-1.基因組滴度與轉導滴度的比值GC/TU可反映rAAV的轉染、親嗜和表達能力的優(yōu)劣,GC/TU越小,則能力越強.腺相關病毒參比標準事務委員會推出AAV2標準品的GC/TU為64.4,實驗室制備的3批rAAV的GC/TU分別為88.45,88.58,87.58(平均值為88.20),與AAV2標準品的GC/TU較為接近.

    (a) MOI=250∶1 (b) MOI=500∶1 (c) MOI=1 000∶1

    表3 不同批次的rAAV轉導滴度

    3 討論

    目前,多數實驗室對rAAV滴度定量采用Q-PCR方法,但Q-PCR只能測定rAAV包裹的基因組,無法測定空殼rAAV,而空殼rAAV不僅不會表達轉基因,反而會引起免疫反應[14-20].文中利用ELISA,Q-PCR和轉導方法,分別測定rAAV的衣殼滴度、基因組滴度和轉導滴度,并計算其P/GC平均值為41.70,GC/TU平均值為88.20,這與AAV2標準品的P/GC,GC/TU較為接近[21],表明制備的rAAV質量與標準品相當.

    rAAV基因藥物的臨床研究已充分證實其具有有效性和安全性,但臨床試驗仍發(fā)現(xiàn)rAAV衣殼蛋白會引起嚴重的細胞免疫毒性.建立完整的rAAV基因藥物的質量控制體系,降低免疫反應,需要保證rAAV轉基因藥效的同時盡量減少劑量[16],這要求rAAV的純度高、空殼少、親嗜性高.單一的基因組滴度或轉導滴度無法反映rAAV的質量標準,因此,在rAAV質量標準建立時,需要測定rAAV的衣殼滴度、基因組滴度和轉導滴度,文中研究為rAAV質量標準的建立提供了一種新的思路.

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