微量生色底物法測定肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中抗Xa因子效價

李想　馬宏達　吳瓊

[摘要] 目的 建立肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中抗Xa因子效價的測定方法。 方法 對肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏進行破乳處理后，采用微量生色底物法、生物檢定統(tǒng)計法，測定乳膏中抗Xa因子的效價。 結(jié)果 建立了肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中肝素鈉抗Xa因子的測定方法，抗Xa因子在0.0250～0.1020 IU/mL范圍內(nèi)與吸光度（A）值線性關(guān)系良好（r=0.996）；低、中、高濃度的平均回收率為99.5%，RSD為1.92%（n=9）?？筙a因子和抗Ⅱa因子的效價比值在0.9～1.1范圍內(nèi)。 結(jié)論 該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中抗Xa因子效價的測定，有效控制該制劑的質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 微量生色底物法；肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏；抗Xa因子；效價

[中圖分類號] R961 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（a）-0030-03

[Abstract] Objective To establish a method for determination of anti-FXa potency in heparin sodium and inositol nicotinate cream. Methods The emulsion was broken. The anti-FXa potency was determined by micro-chromogenic substrate method and biological test statistics method. Results The determination method was established for anti-FXa potency in heparin sodium and inositol nicotinate cream. The linear range of anti-FXa was during 0.0250-0.1020 IU/mL （r=0.996）. The average recovery in three levels was 99.5% （RSD=1.92%， n=9）. The ratio of potency was during 0.9-1.1 for anti-FXa and anti-FⅡa. Conclusion The method is accurate and reproduceable. It can be used for the determination of anti-FXa potency in order to control the quality of heparin sodium and inositol nicotinate cream.

[Key words] Micro-chromogenic substrate method； Heparin sodium and inositol nicotinate cream； Anti-FXa； Potency

凍傷是指機體長時間暴露于寒冷環(huán)境，導(dǎo)致全身或局部體溫下降而產(chǎn)生的損傷[1-2]。輕度凍傷，主要損傷皮膚、肌肉[3]，重度凍傷損傷肌肉和骨，甚至導(dǎo)致殘廢、危及生命[4-5]。沈陽軍區(qū)總醫(yī)院研制的肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏，防治凍傷效果顯著。該制劑由肝素鈉和肌醇煙酸酯組成[6]，通過擴張血管、改善微循環(huán)，使局部血流通暢，以消除凍傷部位紅腫、疼痛等癥狀。肝素鈉為硫酸氨基葡聚糖的鈉鹽，屬于多糖類物質(zhì)[7-8]，肝素鈉與抗凝血酶Ⅲ結(jié)合，對凝血因子Ⅱa和Xa等具有抑制作用[9]，是臨床應(yīng)用最廣泛的抗凝藥物之一[10-11]。準(zhǔn)確測定肝素鈉抗Xa因子效價、測定抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效價比，既保證了有效性，又提高了安全性。在此前的研究中，課題組建立了乳膏中抗Ⅱa因子的效價測定方法[12]。本文采用微量生色底物法，測定抗Xa因子效價，方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可有效控制制劑質(zhì)量，更好地服務(wù)于臨床。

1 材料與方法

1.1 儀器

120D型電子分析天平（北京島津公司）；電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特公司）；ELX800型酶標(biāo)儀（BIO-TEX instruments，INC）；生物檢定統(tǒng)計程序BS2000（中國食品藥品檢定研究院編制）。

1.2 試藥

肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏（沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，規(guī)格：20 g：8000 IU；批號：20141113、20150108、20150109）；肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品（USP，9.5 mg-2144 IU）；抗凝血酶Ⅲ（Chromogenix，10 IU/瓶）；發(fā)色底物S-2765（Chromogenix，25 mg）；Xa因子（Chromogenix，71 nkat/支）；三羥甲基氨基甲烷、聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸二鈉均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)品溶液（S）：精密稱取肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品適量，加滅菌注射用水制成1 IU/mL的溶液，再加緩沖液稀釋成濃度為0.0350、0.0500、0.0714、0.1020 IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，相鄰劑量組的濃度比值為1∶0.7。

供試品溶液（T）：取乳膏約2 g，精密稱定后加70%乙醇30 mL，置水浴上溶解，超聲30 min，放冷后移至200 mL量瓶中，加0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻后置4℃冰箱過夜，取出濾過，取續(xù)濾液50 mL，置水浴上蒸發(fā)至無乙醇臭，移至50 mL量瓶中，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，配制與標(biāo)準(zhǔn)品溶液相當(dāng)?shù)?個系列濃度溶液。

陰性樣品溶液：按處方量制備不含肝素鈉的乳膏，按“供試品溶液”配制方法制成陰性樣品溶液。

三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液（pH 8.4）：即空白溶液（B），取三羥甲基氨基甲烷6.06 g，氯化鈉10.23 g，乙二胺四乙酸二鈉2.80 g，聚乙二醇6000 1.0 g，加蒸餾水800 mL使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.4，用蒸餾水稀釋至1000 mL。endprint

抗凝血酶溶液：精密稱取抗凝血酶Ⅲ適量，加三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液溶解制成1 IU/mL的抗凝血酶Ⅲ溶液。

Xa因子溶液：精密稱取Xa因子適量，加三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液溶解并稀釋制成0.4 IU/mL（7.1nkat）的溶液。

發(fā)色底物溶液（S-2765）：精密稱取發(fā)色底物適量，加蒸餾水溶解使成0.001 mol/L的溶液。

終止液：取25 mL冰醋酸加水至50 mL，制成50%（v/v）醋酸溶液。

1.3.2 抗Xa因子效價的測定 效價測定前，進行空白調(diào)節(jié)：以空白溶液（B）代替供試品溶液測定抗Xa因子效價，調(diào)整Xa因子溶液的濃度，使空白溶液在405 nm波長處的吸光度（A）值在0.8～1.0范圍內(nèi)。

分別取5 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液（S）、供試品溶液（T）及空白溶液（B），按濃度梯度順次加入到96孔板中（B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2），加入20 μL三羥甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000緩沖液，再加入25 μL的抗凝血酶Ⅲ溶液，混勻，37℃保溫2 min。每孔各加Xa因子溶液50 μL，混勻，37℃保溫2 min，再加入發(fā)色底物溶液（S-2765）50 μL，混勻，37℃保溫2 min，最后各孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)。在405 nm波長處測定各孔的A值。應(yīng)用生物檢定統(tǒng)計程序BS2000、按生物檢定統(tǒng)計法中的量反應(yīng)平行線原理4×4法，計算效價及實驗誤差。平均可信限率（FL%）不得>10%。

2 方法學(xué)考察

2.1 專屬性考察

取相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液及空白溶液，于405 nm波長處測定A值。結(jié)果表明，陰性樣品溶液與空白溶液的A值無顯著差異，不干擾供試品測定，專屬性良好。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取1 IU/mL的肝素鈉對照品溶液，加緩沖液稀釋成濃度為0.0250、0.0350、0.0500、0.0714、0.1020 IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取25 μL加入至96孔板中，其他按“1.3.2”測得A值，以A值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（C）對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=-0.6361LogC-0.2614，r = 0.996。結(jié)果表明，樣品濃度在0.0250～0.1020 IU/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 回收率試驗

精密稱取處方量80%、100%、120%的肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品各3份，按處方制備乳膏，按“1.3.1”制備供試品溶液，依法測定效價，計算回收率。平均回收率為99.5%，RSD為1.92%（n=9）。

2.4 精密度試驗

取效價為0.05 IU/mL對照品溶液，測定在405 nm波長處的A值，同時測定6份，計算得RSD為1.75%（n=6），精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗

取同批次樣品6份，按“1.3.2”測定效價。結(jié)果表明，肝素鈉抗Xa因子活性均值為407 IU/g，RSD為1.82%（n=6），重復(fù)性良好。

2.6 樣品抗Xa因子效價測定

取3批肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏樣品，制備供試品溶液，按“1.3.2”測定效價，并計算抗Xa因子與抗Ⅱa因子效價的比值，結(jié)果見表1。

3 討論

傳統(tǒng)的肝素鈉效價測定方法是血液凝固法，雖然能間接反映抗凝活性，但是專屬性不強[13-15]。據(jù)文獻報道[16]，應(yīng)用體積排阻色譜法測定抗Xa因子的活性，準(zhǔn)確性和精密度高，但色譜柱成本高，且不適于乳膏劑。《中國藥典》2015年版收載的肝素鈉效價測定方法[17]，由2010年版的血液凝固法的修訂為生色底物法[18]，但未明確試劑加入量等反應(yīng)條件。本研究采用微量生色底物法，在96孔板上加酶反應(yīng)試劑，用酶標(biāo)儀測定抗Xa因子效價。微量生色底物法較血液凝固法減少了人為因素，提高了專屬性、準(zhǔn)確性和精密度；較生色底物法減少了酶反應(yīng)試劑的用量，節(jié)約成本，可同時測定多個樣本，顯著提高了實驗效率。

抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效價比與肝素鈉誘發(fā)的潛在出血和血小板減少癥等有關(guān)[9]?！吨袊幍洹?015年版要求兩者的效價比應(yīng)為0.9～1.1[17]。本研究測定肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中抗Xa因子和抗Ⅱa因子的效價比，均在限定范圍內(nèi)，可用于肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏的質(zhì)量控制。

在實驗操作的過程中，微量酶反應(yīng)需注意以下幾點[19-20]。保證微量移液器的平行操作，以免影響精密度；嚴(yán)格控制酶反應(yīng)時間及溫度，保證試劑活性，使反應(yīng)完全；因終止液具有揮發(fā)性，為保證各孔的反應(yīng)同步，應(yīng)盡量加快操作速度。

[參考文獻]

[1] 薛寶升，王楊，孫海峰.凍傷診療研究進展[J].創(chuàng)傷與危急重病醫(yī)學(xué)，2014，2（2）：65-68.

[2] 焦明克，樓林，胡劼，等.普通凍傷與高原凍傷血液微循環(huán)恢復(fù)的差異[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2017，42（1）：66-69.

[3] 韓晉，周旭，袁海龍.復(fù)方靈芝乳膏對兔耳輕（Ⅱ）度凍傷治療作用的初步研究[J].中國藥學(xué)雜志，2012，47（9）：689-692.

[4] 王寧，曹軍英，張筠.凍傷或低溫條件對機體的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2010，4（7）：1035-1037.

[5] 章桂香.1例凍傷患者高壓氧治療的護理體會[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（22）：250.

[6] 崔亞玲，馬宏達，胡北，等.雙波長紫外分光光度法測定肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中肌醇煙酸酯的含量[J].中國藥師，2015，18（9）：1596-1598.endprint

[7] 張媛，納濤，吳彥霖，等.達肝素鈉和肝素鈉對小鼠毒性的比較[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2016，30（11）：1172-1175.

[8] 宋玉娟，范慧紅.肝素鈉相對分子質(zhì)量對照品國際協(xié)作標(biāo)定Ⅰ[J].中國藥學(xué)雜志，2014，49（22）：2023-2026.

[9] 桑青，崔慧斐，姬勝利.肝素類抗凝藥物優(yōu)化設(shè)計研究進展[J].中國生化藥物雜志，2012，33（2）：188-191.

[10] 劉志榮，張曉梅，傅龍梅.普通肝素與低分子肝素鈣在血液透析抗凝中的療效觀察[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2010，7（3）：82-85.

[11] 黃偉，滕海英，毛媛媛.肝素鈉持續(xù)泵入治療急性腦梗死的療效及超敏C反應(yīng)蛋白的變化[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志，2017，20（6）：12-15.

[12] 劉艷芳，馬宏達，顏鳴，等.微量生色底物法測定復(fù)方肝素鈉乳膏抗Ⅱa因子活性[J].中國藥師，2016，19（6）：1071-1073.

[13] 吳超權(quán)，周智，覃君良，等.肝素生物測定法（血漿法）方法學(xué)改進研究[J].中國藥事，2015，29（10）：1062-1065.

[14] 舒翔，韓麗，曾武捷，等.綿羊血漿法檢測肝素鈉效價的影響因素及改進方法的研究[J].中國生化藥物雜志，2015， 35（4）：176-180.

[15] 王碧松，王志斌，高陽，等.血凝儀-APTT法測定肝素的效價[J].藥物分析雜志，2012，32（7）：1154-1157.

[16] 張倩倩，康經(jīng)武.體積排阻色譜法測定低分子量肝素抗凝血因子Xa的活性[J].色譜，2013，31（7）：684-690.

[17] 國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：517-519.

[18] 李京，王悅，范慧紅.首批肝素抗Ⅱa因子效價測定用國家標(biāo)準(zhǔn)品協(xié)作標(biāo)定[J].中國生化藥物雜志，2016，10（36）：9-14.

[19] 蔭少民.低分子量肝素鈣注射液抗Xa因子的效價測定[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2010，17（7）：16-17.

[20] 謝繼青，梁愛君，于燕莉，等.生色底物法測定低分子肝素鈉注射液效價[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2003，19（3）：221-223.

（收稿日期：2017-04-25 本文編輯：李亞聰）endprint