犬細(xì)小病毒抗體效價(jià)監(jiān)測(cè)與疫苗免疫效果分析

秦海斌 溫 海 賀星亮 陳 楊 張匯東

近幾年，伴隨著犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV) 毒力、宿主嗜性(犬、貓)等生物學(xué)特性的變化，免疫犬感染不同亞型病毒的報(bào)告屢見(jiàn)不鮮，尤其在規(guī)模化犬場(chǎng)內(nèi)，CPV的感染比例仍居高不下，一段時(shí)期內(nèi)甚至?xí)霈F(xiàn)急劇增高的趨勢(shì)，為調(diào)查這些異常的流行病學(xué)狀況，我們?cè)诒镜貐^(qū)多個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)隨機(jī)選擇了514頭犬進(jìn)行了抗體效價(jià)監(jiān)測(cè)，并結(jié)合其免疫日齡、疫苗種類等因素，從血清學(xué)角度分析了首免時(shí)間、疫苗品質(zhì)對(duì)免疫效果的影響，并對(duì)本地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的細(xì)小病毒免疫狀況進(jìn)行了綜合分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

一、材料和方法

（一）主要材料

血凝抗原為犬細(xì)小病毒CPV-GN株，由公安部南京警犬研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、致弱、保存；F81細(xì)胞株，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所，用于病毒株的傳代和培養(yǎng)；犬血清采集自南京地區(qū)多個(gè)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)，供血犬至少用進(jìn)口疫苗免疫過(guò)兩次，當(dāng)年秋季免疫后采血分離，分裝保存于-20℃；豬紅細(xì)胞，采自6月齡健康長(zhǎng)白豬，在阿氏液(Alsever’s)中4℃保存，實(shí)驗(yàn)前以20倍量的0.2mol/L PBS洗滌3次，1000r/min離心10min后取紅細(xì)胞配成1%懸液備用。

（二）試驗(yàn)方法

血凝/血凝抑制試驗(yàn):參照國(guó)標(biāo)GB/T14926.53-2001與GB/T14926.54-2001進(jìn)行。CPV-GN株病毒經(jīng)F81細(xì)胞株培養(yǎng)培養(yǎng)4天后收獲病毒，反復(fù)凍融3次后3000r/min離心30min去除細(xì)胞碎片，然后10000r/min離心30min，取上清液作為血凝抗原，血凝效價(jià)(HA)為29。犬血清在試驗(yàn)前，以57℃恒溫震蕩30min滅活補(bǔ)體，然后用高嶺土處理血清去除非特異性凝集素。

為比較初免日齡對(duì)和不同商品化疫苗的免疫效果，隨機(jī)選擇24頭仔犬，分4組每組6頭，分別在35日齡、40日齡、45日齡、50日齡進(jìn)行首次免疫，在28日后加強(qiáng)免疫一次，分別記錄第0、7、14、21、28、35、42天時(shí)的抗體效價(jià)，評(píng)價(jià)不同首免日齡的免疫效果。

選擇目前使用比較廣泛的商品化疫苗：W五聯(lián)（Ⅰ組）、IN二聯(lián)（Ⅱ組）、IN四聯(lián)（Ⅲ組）、H四聯(lián)苗（Ⅳ組）進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，隨機(jī)挑選16頭仔犬分為四組，于45日齡進(jìn)行首免，14天加強(qiáng)免疫，并自首免后的0、7、14、21、28、35、42天進(jìn)行血清效價(jià)檢測(cè)，評(píng)價(jià)不同品牌疫苗的免疫效果。

在秋季免疫之后，隨機(jī)選擇不同犬場(chǎng)不同品種和年齡的犬共計(jì)514頭，采集靜脈血并分離血清， HA/HI試驗(yàn)測(cè)定效價(jià)，總體評(píng)價(jià)犬群的免疫效果。

二、結(jié)果

（一）首免日齡的選擇

不同時(shí)間測(cè)定的血清效價(jià)數(shù)據(jù)以x±SE表示，用SPASS軟件進(jìn)行Duncan’s方差分析和多重比較，顯著水平為P＜0.05。以45日齡首免作為參照組，在接種前D0，其他3組與參照組（45d）差異不顯著；D7天，50日齡免疫組效價(jià)顯著高于前兩組，與對(duì)照組（45d）無(wú)差異；D14天，前3組效價(jià)差異不明顯，但高于50日齡首免組；D21、D28,四組數(shù)據(jù)差異不明顯；D35天，參照組（45d）效價(jià)顯著高于其他組，其他組無(wú)差異；D42天，50日齡與參照組（45d）差異不顯著，但是明顯高于前兩組。綜合上述數(shù)據(jù)可以看出，以45日齡和50日齡作為首免時(shí)間，不同時(shí)期的效價(jià)明顯高于30和40日齡首免組，且50日齡組在加強(qiáng)免疫后效價(jià)高于參考組（45d），可作為最佳的首次免疫時(shí)間。

（二）疫苗種類的選擇

不同時(shí)間測(cè)定的血清效價(jià)數(shù)據(jù)以x±SE表示，用SPASS軟件進(jìn)行Duncan’s方差分析和多重比較，顯著水平為P＜0.05。首免后7天（D7）進(jìn)行第一次效價(jià)測(cè)定，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組效價(jià)升高但無(wú)顯著差異，Ⅲ組效價(jià)顯著低于其他組；D14天，Ⅱ、Ⅳ組效價(jià)顯著高于Ⅰ、Ⅲ組；D21天，加強(qiáng)免疫后Ⅰ、Ⅱ組抗體效價(jià)降低，Ⅲ、Ⅳ組效價(jià)升高；D28天，Ⅱ組效價(jià)顯著高于Ⅲ組，與Ⅰ、Ⅳ組差異不顯著；D35天，前三組效價(jià)無(wú)差異，第Ⅳ組效價(jià)明顯高于前三組；D42天，Ⅱ、Ⅳ組效價(jià)顯著高于Ⅰ、Ⅲ組。綜合上述不同時(shí)間的效價(jià)測(cè)定結(jié)果，可見(jiàn)Ⅱ組的免疫效果略優(yōu)于其他小組；另外，無(wú)論選用那種疫苗，在經(jīng)過(guò)二次加強(qiáng)免疫之后，抗體均能升高到保護(hù)效價(jià)之上，說(shuō)明目前商品化疫苗的質(zhì)量?jī)?yōu)良。

表1 幼犬不同首免日齡對(duì)CPV抗體效價(jià)（log2）的測(cè)量結(jié)果

表2 幼犬不同種類疫苗對(duì)CPV抗體效價(jià)（log2）的影響

（三）抗體監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)

HA/HI結(jié)果顯示，514份樣本中，效價(jià)為27的樣本有2個(gè)，效價(jià)為28的樣本57個(gè),效價(jià)為29的79個(gè),效價(jià)為210的70個(gè)，效價(jià)為211的63個(gè)，效價(jià)為212的116個(gè)，效價(jià)為213的87個(gè)，效價(jià)為214的31個(gè)，效價(jià)為215的9個(gè)。最低效價(jià)27，最高效價(jià)215，加權(quán)感染CPV、首免后仔犬在免疫后窗口期內(nèi)發(fā)生CPV感染、個(gè)別二次免疫后的成年犬感染，排除疫苗質(zhì)量的因素，這與幼犬的母源抗體水平、疫苗首免后抗體的產(chǎn)生時(shí)間、加強(qiáng)免疫后抗體維持時(shí)間三個(gè)方面密切相關(guān)，因此，我們著重調(diào)查了疫苗的首免時(shí)間、疫苗種類對(duì)免疫效果的影響，并通過(guò)檢測(cè)514份血清的效價(jià)，總體評(píng)價(jià)了疫苗的免疫效果。數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)有商品化疫苗均能夠刺激犬體產(chǎn)生良好的體液免疫反應(yīng)；與現(xiàn)在常用的在45日齡首次免疫相比，在50日齡進(jìn)行首次免疫效果更佳，證明幼犬體內(nèi)母源抗體維持時(shí)間較長(zhǎng)，在45日齡時(shí)母源抗體仍能對(duì)初次免疫產(chǎn)生一定影響，從初次免疫前的幼犬進(jìn)行的抗體效價(jià)檢測(cè)數(shù)據(jù)也可以得出相同的結(jié)論。另外， CPV感染只在HI低于1:80時(shí)發(fā)生，抗體高于1:160時(shí)犬有可能出現(xiàn)隱性帶毒而不表現(xiàn)明顯臨床癥狀；當(dāng)效價(jià)高于1:640時(shí)能夠達(dá)到完全保護(hù)。本次對(duì)成年犬抗體平均效價(jià)為211.2。

表3 不同效價(jià)時(shí)的犬的數(shù)量

三、討論

過(guò)去30年，世界范圍內(nèi)的細(xì)小病毒雖然處于不斷進(jìn)化之中，但其衣殼蛋白的主要抗原位點(diǎn)并未發(fā)生很大的變化。理論上講，不論哪種新毒株，現(xiàn)有的疫苗均可提供良好的保護(hù)力，而且不需要每年重復(fù)接種，數(shù)年后是否需要重復(fù)接種，則依賴于血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果。但另一方面，疫苗免疫后的犬再次感染不同亞型病毒的病例也時(shí)有出現(xiàn)，歐洲以新型病毒株制造的疫苗已經(jīng)獲得許可，這說(shuō)明無(wú)論在生產(chǎn)實(shí)踐還是在科學(xué)研究中，疫苗的保護(hù)效果并非高枕無(wú)憂，不斷進(jìn)化的新型病毒必須依賴研發(fā)新的商品化疫苗進(jìn)行防控。

我們對(duì)南京地區(qū)進(jìn)行CPV血清學(xué)調(diào)查，是基于目前疫病防控中出現(xiàn)的一些異常狀況，例如未免疫幼犬整窩普查結(jié)果顯示，效價(jià)低于1:80的樣本數(shù)為零，低于1:160的樣本數(shù)為2，低于1:640的樣本數(shù)合計(jì)為138例，整體免疫合格率為100%，但仍有26.8%（138/514）的犬處于完全保護(hù)的抗體水平之下，存在一定的感染風(fēng)險(xiǎn)，尤其是新的亞型病毒出現(xiàn)之后，不同亞型病毒的交叉保護(hù)能力已經(jīng)發(fā)生了變化，感染風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)逐漸增加。

另外，一種疫苗的保護(hù)力不可能達(dá)到100%的理想狀態(tài)，群體中個(gè)體免疫力差、免疫系統(tǒng)異常及其他免疫抑制因素都是存在的，這些因素均會(huì)造成一定比例的犬處于感染風(fēng)險(xiǎn)之中，通過(guò)合理的免疫程序、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、適時(shí)監(jiān)測(cè)抗體效價(jià)等方式對(duì)于提高犬群的整體免疫防控效果具有很好的作用。