含量測定結合HPLC指紋圖譜用于香加皮質(zhì)量評價

李瑞雪　吳飛　張繼全

[摘要] 目的 建立總皂苷含量測定方法和HPLC指紋圖譜分析方法，對不同產(chǎn)地香加皮藥材進行質(zhì)量評價。 方法 采用紫外可見分光光度法，以杠柳苷C（PSA）為對照品，建立香加皮藥材中總皂苷的含量測定方法；同時建立香加皮藥材HPLC指紋圖譜。對12批不同產(chǎn)地的香加皮中總皂苷進行含量測定，建立指紋圖譜，計算相似度，采用SPSS軟件對兩類數(shù)據(jù)進行聚類分析。 結果 以5%香草醛-冰醋酸顯色體系，檢測波長為480 nm，12批藥材中總皂苷含量在170～250 mg/g之間，差異較大；采用Capcell Pak C18色譜柱，流動相乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脫，檢測波長263 nm，香加皮藥材指紋圖譜共標定25個共有峰，除1批樣品外，其余樣品相似度均在0.9以上。對皂苷含量及相似度數(shù)據(jù)進行聚類分析，結果顯示，12批香加皮主要分為兩類，高含量組和低含量組。 結論 建立的含量測定結合指紋圖譜分析方法可以更好地用于香加皮的質(zhì)量評價。

[關鍵詞] 香加皮；紫外分光光度法；HPLC指紋圖譜；質(zhì)量評價

[中圖分類號] R961 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（a）-0033-05

[Abstract] Objective To set up a simple and accurate method for the determination and evaluatation of Cortex Periplocae by UV-visible sepctrophotomery and HPLC fingerprint. Methods Determine the contents of 12 batches of Cortex Periplocae with periploside C （PSA） as the reference substance by UV-visible sepctrophotomery， meanwhile establish HPLC fingerprint and calculate the similarity. All data was analyzed by the SPSS statistical software. Results Determine the contents of 12 batches of Cortex Periplocae by 5% vanillin-glacial acetic acid with the detection wavelength at 480 nm. There was a significant difference in contents that ranged from 170 to 250 mg/g. HPLC analysis was performed on a Capcell Pak C18 column with the detection wavelength at 263 nm. The mobile phase was water containing 0.2% formic acid and acetonitrile in the gradient mode. 25 pesks were selected as the common peaks and the similarities were above 0.9 besides batch 7. Based on the results of quantification and fingerprint analysis， the results indicated that the 12 batches cortex periplocae divided into 2 classes： high and low content. Conclusion The established HPLC fingerprint and quantitative analysis methods can be used efficiently in the quality control of Cortex Periplocae.

[Key words] Cortex Periplocae； UV sepctrophotomery； HPLC fingerprint； Quality assessment

香加皮（Cortex Periplocae）為蘿摩科植物杠柳（Periploca sepium Bunge）的根皮，又被稱為北五加皮、杠柳皮或者香五加皮。最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，《中國藥典》也均有收載，其功能祛風濕、強筋骨，用于心悸氣短、下肢水腫、風寒濕痹、腰膝酸軟[2]。

市場上香加皮與南五加皮混用情況比較嚴重，給臨床用藥帶來困擾[3-4]?！吨袊幍洹?015年版中以4-甲氧基水楊醛作為藥材的含量控制指標[5]，也不能滿足當前以C21甾體苷類成分為目標[6-8]的一些新藥開發(fā)研究需求。分別采用紫外分光光度法[9-14]和指紋圖譜方法[15-21]用于評價藥材的技術應用甚廣，而指紋圖譜結合定量分析[22-25]更能綜合評價藥材質(zhì)量。本研究建立紫外分光光度法測定總皂苷含量結合高效液相色譜指紋圖譜分析方法用于評價不同產(chǎn)地香加皮藥材的質(zhì)量，為香加皮藥材的規(guī)范種植和新藥開發(fā)提供技術手段。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1800型紫外分光光度計（島津儀器有限公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Capcell pak C18色譜柱[4.6 mm×250 mm，5 μm，資生堂（中國）投資有限公司]；TE-214S型分析天平（0.1 mg，賽多利斯科學儀器有限公司），XP-205型分析天平（0.01 mg，梅特勒托利多儀器有限公司），SK5200H超聲清洗儀（上?？茖С晝x器有限公司），KA-1000型離心機（上海安亭科學儀器廠），HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司），Milli-Q型超純水制備儀（密理博中國有限公司）。endprint

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版，藥典委員會），SPSS軟件（22.0版）。

1.2 試劑

杠柳苷C（PSA）、杠柳苷K（PSK）、杠柳苷R（WJ53）、杠柳苷E（WJ521）、杠柳苷D（PSD）、杠柳苷Q（WJ33）、杠柳苷（WJ32）對照品（批號均為20160316，由中國科學院上海藥物研究所提供，純度分別為98.16%、98.49%、98.09%、99.04%、98.13%、98.77%、95.86%）；香草醛（批號：20150611，國藥集團化學試劑有限公司）；甲醇、乙醇、甲酸、冰醋酸、高氯酸（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆麴s水（自制）。

1.3 藥材

12批香加皮藥材飲片購于飲片公司，經(jīng)中國科學院上海藥物研究所趙維民研究員鑒定，12批藥材均為蘿摩科植物杠柳的干燥根皮。藥材詳細信息見表1。

2 方法與結果

2.1 紫外分光光度法測定總皂苷

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取PSA對照品適量于25 mL量瓶中，加甲醇溶解制得濃度為1.0256 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取香加皮藥材最細粉1.0 g，加入75%乙醇25 mL，超聲30 min（53 kHz），將提取液離心（5000 r/min，10 min）取上清作為供試品溶液。

2.1.3 測定方法 精密移取供試品溶液于具塞試管中，揮干溶劑，精密加入0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.6 mL高氯酸，搖勻，密塞，90℃水浴保溫50 min，冰水浴10 min，加冰醋酸至10 mL，搖勻，以空白試劑為對照，480 nm下測定吸光度。

2.1.4 方法學考察 以PSA含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=4.73267X+0.1156，r=0.9995，表明PSA在0.05128～0.41024 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。精密度試驗中，吸光度RSD為0.022%，表明儀器精密度良好。重復性試驗中，藥材總皂苷的平均含量為148.73 mg/g，RSD=2.5%，表明方法重復性良好。穩(wěn)定性試驗中，120 min內(nèi)RSD=1.2%，說明對照品溶液在顯色后2 h內(nèi)基本穩(wěn)定。加樣回收率試驗中，平均回收率為99.22%，RSD=1.7%，回收率合格。

2.1.5 樣品含量測定 取12批藥材按“2.1.2”制備供試品溶液，按“2.1.3”方法測定總皂苷含量，結果見表2。試驗結果表明，不同產(chǎn)地的香加皮中山西、甘肅和河南的香加皮總皂苷含量幾乎都是>200 mg/g，而四川、河北、安徽的香加皮總皂苷含量都不足200 mg/g。

2.2 HPLC指紋圖譜研究

2.2.1 液相條件 色譜柱：Capcell pak C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.2%甲酸（B），梯度洗脫（0～45 min：10%A→33%A；45～45.01 min：33%A→56%A；45.01～55 min：56%A→80%A；55～65 min：80%A→92%A；65～70 min：92%A→100%A；70～72 min：100%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：263 nm；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取PSK、WJ53、WJ521、PSD、WJ33、WJ32和PSA對照品適量于25 mL量瓶中，加甲醇超聲（53 kHz）溶解并定容，搖勻，制得對照品單標溶液。各取1 mL于10 mL容量瓶，加甲醇定容，搖勻，得對照品混標溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取香加皮藥材最細粉2 g，加入75%乙醇25 mL，超聲（53 kHz）1 h，將提取液離心（5000 r/min，10 min）取上清作為供試品溶液。

2.2.4 方法學考察 供試品溶液按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，各色譜峰相對保留時間的RSD均<0.1%；各色譜峰相對峰面積的RSD均在3%之內(nèi)，表明儀器的精密度較好。6份樣品中各色譜峰相對保留時間的RSD均<0.4%；相對峰面積的RSD均在2.9%之內(nèi)，表明重復性較好。供試品24 h內(nèi)各色譜峰相對保留時間的RSD均<0.5%；相對峰面積的RSD均在2.9%之內(nèi)，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.2.5 不同產(chǎn)地香加皮HPLC指紋圖譜采集和共有峰的標定 取12批藥材制備供試品溶液并測定，記錄HPLC色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”軟件對香加皮指紋圖譜進行數(shù)據(jù)處理，確定共有峰25個，建立藥材標準指紋圖譜和標準指紋圖譜，見圖1～2。

2.2.6 共有峰的指認 取對照品混標溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件，得出對照品的保留時間分別與色譜圖上的峰19、峰20、峰21、峰22、峰23、峰24、峰25保留時間一致，由此初步確定峰19為PSK，峰20為WJ53，峰21為WJ521，峰22為PSD，峰23為WJ33，峰24為WJ32，峰25為PSA。

2.2.7 相加皮藥材相似度評價 采用指紋圖譜相似度軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》計算。香加皮藥材HPLC指紋圖譜相似度計算結果見表3。12批香加皮除S7以外，相似度均在0.9以上，說明從指紋圖譜角度看，不同產(chǎn)地的香加皮藥材質(zhì)量有差異也有共性。

2.3 指紋圖譜結合總皂苷含量的系統(tǒng)聚類分析

以12批藥材中總皂苷含量中最大值作為基準對12批藥材中總皂苷含量進行歸一化處理，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行系統(tǒng)聚類分析，得到聚類樹狀圖3。結果顯示，除第7批相似度較低外，其余11批香加皮樣品被分為兩類，主要為高含量組和低含量組。高含量組包括產(chǎn)地為河南、山西、甘肅的香加皮藥材，低含量組包括山西、甘肅、河北、四川、安徽的香加皮藥材，而山西和甘肅的香加皮藥材含量不一。表明基于總皂苷含量及相似度的綜合評價可用于香加皮藥材的質(zhì)量評價及比較。endprint

3 討論

紫外測總皂苷實驗前期對顯色劑種類、比例、用量和顯色反應溫度、時間分別進行了考察比較，確定了最佳顯色條件。并對供試品制備中提取溶劑、溶劑體積和提取時間進行考察，確定最佳提取條件。

指紋圖譜實驗前期分別比較不同溶劑對相加皮藥材的提取效果，結果75%乙醇的供試品峰數(shù)目較多且峰形較好，含量較均勻；考察了超聲、回流兩種提取方式，其中超聲提取色譜信息更完整；考察了多種流動相系統(tǒng)，結果乙腈-0.2%甲酸流動相系統(tǒng)，基線最為平穩(wěn)，峰形較好。

紫外測總皂苷含量結合HPLC指紋圖譜分析評價法可在一定程度上表征不同產(chǎn)地來源不同批次的藥材在皂苷含量方面的差異，基于兩者的綜合信息，可以為香加皮的產(chǎn)地選擇、臨床應用及質(zhì)量快速評價提供參考。在此基礎上，若能將藥效、毒性與物質(zhì)基礎結合起來，深入開展研究，則更有利于闡明中藥作用制劑，完善香加皮的質(zhì)量評價體系，為用藥安全提供進一步保障。

[參考文獻]

[1] 神農(nóng)本草經(jīng)：卷一上經(jīng)[M].哈爾濱：哈爾濱出版社，1999.

[2] 張輝云，賀清華，童珊珊，等.香加皮活性成分及其藥理作用研究進展[J].藥學進展，2013，37（9）：449-453.

[3] 顧蘅，張毅.香加皮的鑒別方法及其臨床毒性研究[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2015，34（4）：110-111.

[4] 林世和，吳建國，余南才.五加皮和香加皮的鑒別[J].光明中醫(yī)，2010，25（12）：2330-2332.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：257-258.

[6] Zhu YN，Zhao WM，Yang YF，et al. Periplocoside E，an effective compound from Periploca sepium Bge，inhibited T cell activation in vitro and in vivo [J]. J Pharmacol Exp Ther，2006，316（2）：662-669.

[7] Zhang J，Ni J，Chen Z，et al. Periplocoside A prevents experimental autoimmune encephalomyelitis by suppressing IL-17 production and inhibits differentiation of Th17 cells [J]. Acta Pharmacologica Sinica，2009，30（8）：1144-1152.

[8] Wang LY，Chen ZH，Zhou Y，et al. Structural revision of periplocosides and periperoxides，natural immunosuppressive agents from the genus Periploca [J]. Phytochemistry，2011，72（17）：2230-2236.

[9] 黃敏珠，王棟，尹忠臣，等.紫外分光光度法測絞股藍片中絞股藍總苷的含量[J].中國中藥雜志，2010，35（18）：2410-2411.

[10] 鄭湘娟，余淑嫻，徐曉芳，等.紫外分光光度法測定虎杖中自藜蘆醇的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（8）：1881-1882.

[11] 潘正，高運玲，蔡應繁.紫外分光光度法測定唐松草中皂苷的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（1）：40.

[12] 秦雪蓮，徐勤，鄧立東.紫外分光光度法測定加替沙星片的含量[J].西北藥學雜志，2004，19（4）：154-155.

[13] 叢媛媛，帕麗達·阿不力孜，趙文惠，等.紫外分光光度法測定紫花苜蓿黃酮的含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2006， 17（3）：363.

[14] 解生旭，徐暾海，韓冬，等.紫外可見分光光度法測定蒺藜果中呋甾總皂苷含量[J].長春中醫(yī)藥大學學報，2008， 24（5）：495-496.

[15] 芮雯，馮毅凡，石忠峰，等.不同產(chǎn)地黃芪藥材的UPLC/Q-TOF-MS指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志，2012，32（4）：607-611.

[16] 崔洋，王巧，張?zhí)m桐，等.河北道地藥材連翹的高效液相色譜指紋圖譜研究[J].中草藥，2010，41（2）：297-301.

[17] 曹建軍，梁宗鎖，楊東風，等.地黃HPLC-DAD多波長指紋圖譜的建立及其在熟地黃炮制中的應用[J].中草藥，2014，45（2）：265-270.

[18] 方玲，陳方亮，余翠琴，等.不同產(chǎn)地烏藥的HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2013，44（2）：229-231.

[19] 呂海鵬，鐘秋生，施江，等.普洱茶揮發(fā)性成分指紋圖譜研究[J].茶葉科學，2014，34（1）：71-78.

[20] 蔣莉娟，皮勝玲，方鐵錚，等.香附藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中國當代醫(yī)藥，2016，23（1）：4-7.

[21] 蔣莉娟，皮勝玲，方鐵錚，等.東風桔藥材HPLC指紋圖譜研究[J].中國當代醫(yī)藥，2016，23（2）：14-17.

[22] 何兵，劉艷，田吉，等.指紋圖譜結合一測多評模式在中藥魚腥草質(zhì)量評價中的應用研究[J].中國中藥雜志，2013， 38（16）：2682-2689.

[23] 張婷，鄭奪，王文彤，等.指紋圖譜結合一測多評模式在參芎養(yǎng)心顆粒質(zhì)量評價中的應用研究[J].中草藥，2015， 46（13）：1920-1925.

[24] 張茹萍，何昱，石森林，等.HPLC指紋圖譜結合主成分分析評價不同產(chǎn)地雷公藤藥材質(zhì)量[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2014，31（11）：1338-1344.

[25] 劉宏明，徐楠楠，聶磊.指紋圖譜分析結合多指標成分定量用于六味五靈片的質(zhì)量評價[J].中國中藥雜志，2014， 39（10）：1816-1821.

（收稿日期：2017-04-14 本文編輯：李亞聰）endprint