23種中草藥體外抗菌活性篩選

奠佐紅 左國營 吳玉霞 張鐵煥

摘 要：為研究23種中草藥的80%乙醇提取物對(duì)4種臨床常見致病菌的體外抗菌活性，該研究用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈直徑，微量肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal/fungicidal concentration，MBC/MFC）。結(jié)果表明：滇龍膽草、金絲梅、溪黃草等16種提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC/MBC值在0.19～3.12 mg·mL-1之間，有很強(qiáng)的抑菌活性。頭花蓼、淡竹葉、半枝蓮等14種提取物對(duì)銅綠假單胞菌的MIC/MBC值在1.56～6.25 mg·mL-1之間，有較強(qiáng)的抑菌活性。除槐角外，其余提取物對(duì)大腸埃希菌的MIC/MBC值均在3.12～12.5 mg·mL-1之間，有較強(qiáng)的抑菌活性。黃藤、藿香提取物對(duì)白色念珠菌的MIC/MFC值在0.78～6.25 mg·mL-1之間，有較強(qiáng)的抑菌活性;滇龍膽草、金絲梅、水楊梅、苦參、胡椒、趕黃草、蓽菝、淡竹葉提取物對(duì)白色念珠菌的MIC/MFC值在6.25～12.5 mg·mL-1之間，也具有一定抑菌活性。因此，所選中草藥的抑菌效果均較好，大部分均具有廣譜抗菌活性。其中，藿香、黃藤的提取物對(duì)白色念珠菌抑菌活性較強(qiáng)，金絲梅、水楊梅、仙鶴草、苦參、趕黃草、溪黃草的提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性很強(qiáng)，這幾種中草藥可為進(jìn)一步追蹤其活性單體化合物和作用機(jī)制提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：中草藥提取物，金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，大腸埃希菌，白色念珠菌，體外抗菌

中圖分類號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3142（2020）09-1357-11

Abstract：In this study，we selected 80% ethanol extract from 23 Chinese herbal medicine extracts to resist the activity of four common pathogens in vitro. The diameter of the zone of inhibition was determined by agar diffusion method，and the minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal/fungicidal concentration （MBC/MFC） were determined by micro-broth culture. The results were as follows：MIC/MBC values of 16 kinds of extracts Gentiana rigescens，Hypericum patulum and Rabdosia serra were 0.19 to 3.12 mg·mL-1，which had? very strong antibacterial activities to Staphylococcus accreus. The MIC/MBC values of 14 kinds of extracts Polygonum capitatum，Lophatherum gracile and Scutellaria barbata were 1.56 to 6.25 mg·mL-1，which had good antibacterial activities to Pseudomonas aeruginosa. In addition to the Sophora japonica extract，the MIC/MBC values of other extracts were 3.12 to 12.5 mg·mL-1，which had good antibacterial activities to Escherichia coli. The MIC/MFC values of Agastache rugosa and Daemonorops margaritae extracts were 0.78 to 6.25 mg·mL-1，which had strong antibacterial activities to Candida albicans; The MIC/MFC value of Gentiana rigescens，Hypericum patulum，Geumja ponicum，Sophora flavescens，Piper nigrum，Penthorum chinense，Piper longum and Lophatherum gracile extracts were 6.25 to 12.5 mg·mL-1，which also had certain antibacterial activities to Candida albicans. Therefore，these selected Chinese herbal medicines had good antibacterial effects，and most of them had broad-spectrum antibacterial activities，but Agastache rugosa and Daemonorops margaritae，which had strong antibacterial activity for Candida albicans，and other Chinese herbal medicines had strong antibacterial activity for Staphylococcus aureus，such as Hypericum patulum，Geumja ponicum，Agrimonia pilosa，Sophora flavescens，Penthorum chinense，Rabdosia serra. Above several kinds of Chinese herbal medicines can provide some reference for further reachering of its active monomer compounds and mechanism of action.

1.2.2 測(cè)定耐藥菌株的耐藥譜 藥敏試驗(yàn)用K-B紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer法），藥敏結(jié)果判定參照CLSI（Clinical Laboratory Standards Institute）2017版（CLSI：M02-A12，2017）。

1.2.3 藥液和菌液制備 藥液：精確稱取中草藥提取物50 mg于 EP管中，加10% DMSO作助溶劑溶解，用無菌生理鹽水配成濃度為50 mg·mL-1的藥液。菌液：將細(xì)菌、真菌菌種分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。細(xì)菌用0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁芘涑蓾舛?.5×108 CFU·mL-1，真菌用細(xì)胞計(jì)數(shù)板配成濃度1.0×106 CFU·mL-1，用于菌株藥敏測(cè)試和瓊脂擴(kuò)散法測(cè)抑菌圈。將細(xì)菌稀釋300倍成濃度5×105 CFU·mL-1，真菌稀釋100倍成濃度1.0×104 CFU·mL-1，用于MIC/MB（F）C的測(cè)定。

1.2.4 瓊脂打孔法測(cè)定抑菌圈 用直徑6 mm的無菌打孔器將瓊脂平板每塊打孔5個(gè)備用，用無菌棉簽蘸取濃度為1.5×108 CFU·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上，濃度為1.0×106 CFU·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)真菌菌液均勻涂布于沙氏瓊脂培養(yǎng)基上，每孔加入濃度為50 mg·mL-1的藥液100 μL，藥液不得溢出。將瓊脂平板置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用卡尺測(cè)量抑菌圈，平行3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。根據(jù)藥理學(xué)方法判定：抑菌圈直徑d<10 mm為細(xì)菌對(duì)藥物表現(xiàn)耐藥和無抑菌作用;d=10 mm為輕度敏感;11 mm≤d≤15 mm為中度敏感;d≥16 mm為高度敏感。

1.2.5 MIC和MBC/MFC的測(cè)定 MIC的測(cè)定：按照CLSI2017版指南進(jìn)行（CLSI：M07-A10，2017），采用微量肉湯倍比稀釋法。MBC/MFC的測(cè)定：確定MIC后，將MIC孔前3～5孔的液體培養(yǎng)基用無菌接種環(huán)接種于瓊脂平板培養(yǎng)基上（細(xì)菌用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，真菌用沙氏瓊脂培養(yǎng)基），置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。采用活菌計(jì)數(shù)法檢查瓊脂平板上的菌落數(shù)，平均數(shù)小于5個(gè)的藥物濃度則為該藥物的MBC/MFC，平行實(shí)驗(yàn)3次，取平均值（胡歡等，2018）。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥菌株耐藥譜測(cè)定結(jié)果

主要藥敏測(cè)試結(jié)果如表1，表2，表3所示。

2.2 抑菌圈的測(cè)定結(jié)果

抑菌圈測(cè)試結(jié)果如表4所示，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)SA，仙鶴草、頭花蓼、溪黃草、藿香、趕黃草提取物抑菌圈直徑大于16 mm，表現(xiàn)為高度敏感，槐角、滇龍膽草、金絲梅、馬鞭草、何首烏、水楊梅、苦參、蘿芙木提取物抑菌圈直徑11 mm≤d≤15 mm，表現(xiàn)為中度敏感; 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)EC和PA，滇龍膽草、 金絲梅、 何首烏、水楊梅、仙鶴草、苦參、趕黃草、淡竹葉、藿香、半枝蓮提取物抑菌圈直徑11 mm≤d≤15 mm，為中度敏感;對(duì)標(biāo)準(zhǔn)CA，藿香、金絲梅、淡竹葉、黃藤提取物抑菌圈直徑11 mm≤d≤15 mm，表現(xiàn)為中度敏感;其余中草藥提取物表現(xiàn)為輕度敏感，耐藥或無抑菌作用。

2.3 MIC、MB（F）C的測(cè)定結(jié)果

空白對(duì)照組無菌生長，證明實(shí)驗(yàn)無污染，操作規(guī)范，陰性對(duì)照組（DMSO 10% + 培養(yǎng)液）對(duì)菌無抑制作用，數(shù)據(jù)可靠。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)SA和MRSA，如表5，表6所示，滇龍膽草、金絲梅、馬鞭草、何首烏、水楊梅、仙鶴草、苦參、藿香、頭花蓼、趕黃草、溪黃草、半枝蓮、啤酒花、淡竹葉、響鈴草、密蒙花16種提取物的MIC/MBC值在0.19～3.12 mg·mL-1之間，有很強(qiáng)的抑菌活性;蘿芙木、槐角、黃藤、金蓮花、胡椒、鉤藤、蓽菝7種提取物的MIC/MBC值在6.25～12.5 mg·mL-1之間，有一定抑菌活性。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)PA和耐藥PA，如表5，表7所示，蘿芙木、滇龍膽草、黃藤、金絲梅、馬鞭草、何首烏、水楊梅、響鈴草、仙鶴草、苦參、藿香、頭花蓼、淡竹葉、半枝蓮14種提取物的MIC/MBC值在1.56～6.25 mg·mL-1之間，有較強(qiáng)的抑菌活性;除蓽菝提取物的MIC/MBC值在12.5 mg·mL-1時(shí)無抑菌活性，其余提取物的MIC/MBC值在6.25～12.5 mg·mL-1之間，有一定抑菌活性。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)EC，如表5所示，除槐角提取物外，其余提取物的MIC/MBC值均在3.12～12.5 mg·mL-1之間，有較強(qiáng)抑菌活性。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)CA和耐藥CA，如表5，表8所示，黃藤、藿香提取物的MIC/MFC值在0.78～6.25 mg·mL-1之間，有較強(qiáng)的抑菌活性;滇龍膽草、金絲梅、水楊梅、苦參、胡椒、趕黃草、蓽菝、淡竹葉提取物的MIC/MFC值在6.25～12.5 mg·mL-1之間，有一定抑菌活性。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，仙鶴草、金絲梅等大部分提取物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株都有一定抑菌活性。其中，滇龍膽草、黃藤、金絲梅、水楊梅、苦參、藿香、胡椒、趕黃草、蓽菝、淡竹葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌都有抑菌作用，顯示出廣譜抑菌活性。 實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)槐角、金蓮花等提取物在SA、EC、PA的抑菌圈測(cè)試中顯示無明顯抑菌圈，但在測(cè)試MIC/MBC時(shí)卻顯示有一定的抑菌活性，MIC/MBC值主要集中在6.25～12.5 mg·mL-1，原因可能是在抑菌圈測(cè)試時(shí)菌液是涂布在瓊脂表面，藥液是加在瓊脂孔中，以孔為中心向周圍擴(kuò)散，但藥液始終只與菌液的底面層接觸，并且藥液中各成分的性質(zhì)不同，可能導(dǎo)致各成分在瓊脂中的擴(kuò)散距離不同，這就可能影響各成分與菌液接觸的底面積范圍，從而影響抑菌圈的大小，所以，抑菌圈不明顯不足已證明無抑菌活性;而在測(cè)試MIC/MBC時(shí)藥液與菌液都加在肉湯中混合均勻，使得藥液中各成分都能更全面的與菌液接觸，則各成分的抑菌作用就可能更充分地發(fā)揮出來。在測(cè)定金黃色葡萄球菌MIC/MBC值時(shí)，發(fā)現(xiàn)啤酒花、密蒙花、溪黃草等提取物對(duì)個(gè)別MRSA菌株（如MRSA 8、23、166）的抑菌作用較標(biāo)準(zhǔn)菌株好，原因可能是雖同為金黃色葡萄球菌，但不同菌株的耐藥機(jī)制不一樣，并且耐藥機(jī)制并不是完全獨(dú)立的，可能存在多重性（阮賢妹和史道華，2015），而且中草藥的成分、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作用機(jī)制多（如：抑制菌體蛋白質(zhì)和核酸的合成;破壞菌體的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞結(jié)構(gòu);抑制菌體內(nèi)酶活性等），也可能存在多重性（樸喜航和艾紅佳，2017）。

在耐藥菌產(chǎn)生速度緊追抗生素研發(fā)速度的今天，研究者們發(fā)現(xiàn)了噬菌體、抗菌肽、益生菌、中草藥單體等對(duì)抗耐藥菌的新物質(zhì)（尹業(yè)師等，2018）。其中，中草藥單體與抗生素聯(lián)合抑菌是一種比較有效的方式，槐屬二氫黃酮G與氨芐西林聯(lián)合對(duì)抗MRSA表現(xiàn)為協(xié)同作用（Sato et al.，1995）;沒食子酸與甲氧西林、氨芐西林聯(lián)合對(duì)抗MRSA，沒食子酸通過直接與細(xì)菌細(xì)胞壁上的肽聚糖結(jié)合，干擾細(xì)胞壁的完整性，從而使抗生素對(duì)MRSA的活性增強(qiáng)（Zhao et al.，2001）;胡椒堿與慶大霉素聯(lián)合對(duì)抗MRSA表現(xiàn)為協(xié)同作用（Khameneh et al.，2015）;Psychorubrin與氯霉素聯(lián)合對(duì)抗MRSA表現(xiàn)為相加作用（Lemos et al.，2018）。雖然抗生素與中草藥單體聯(lián)合體外抑菌試驗(yàn)較聯(lián)合體內(nèi)抑菌試驗(yàn)研究多，但難在體外試驗(yàn)中復(fù)制出體內(nèi)試驗(yàn)中兩藥聯(lián)合對(duì)機(jī)體與菌體的雙重作用（樸喜航和艾紅佳，2017），而且在體外試驗(yàn)中有高度抑菌活性的中草藥在體內(nèi)試驗(yàn)中卻達(dá)不到有效血藥濃度或首過效應(yīng)明顯而使抑菌作用降低或無效（李晶等，2009），那么聯(lián)合用藥也可能存在類似的問題。所以，在抗生素與中草藥單體聯(lián)合體內(nèi)抑菌方面應(yīng)加深藥代動(dòng)力學(xué)、作用機(jī)制等方面的研究，為聯(lián)合體內(nèi)抑菌方案提供可靠的依據(jù)。

該研究中的中草藥提取物都具有一定的抑菌活性，尤其是對(duì)白色念珠菌抑菌活性較強(qiáng)的藿香、黃藤和對(duì)MRSA抑菌活性很強(qiáng)的金絲梅、水楊梅、仙鶴草、苦參、趕黃草、溪黃草這幾種中草藥提取物可進(jìn)一步追蹤分離得到尚未研究過的有抑菌作用的中草藥單體，結(jié)合體內(nèi)和體外試驗(yàn)，研究其單用和其他藥物聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果和作用機(jī)制，使具有高度抑菌活性的中草藥單體和聯(lián)合方案能真正發(fā)揮療效，并希望能縮短耐藥菌治療的療程。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）