箭葉淫羊藿與近緣種天平山淫羊藿花粉形態(tài)對比研究

黃華 賴華清 蔣勇 李仁清 李風(fēng)琴 劉勇 徐艷琴

摘 要：該研究采用掃描電子顯微鏡（SEM，scanning electron microscope）對箭葉淫羊藿13個居群（含箭葉淫羊藿光葉變種1個居群）、天平山淫羊藿7個居群進行花粉形態(tài)和外壁紋飾的觀察及對比研究。結(jié)果表明：兩個類群的花粉均為近球形，具三孔溝，大小相近。箭葉淫羊藿的花粉大小為（18.21～21.66） μm × （19.55～23.63） μm，天平山淫羊藿的花粉大小為（18.32～21.43） μm × （19.73～23.48） μm。外壁紋飾是花粉形態(tài)的重要性狀。不同居群間花粉外壁紋飾存在較大差異，主要分為網(wǎng)紋紋飾、條網(wǎng)紋紋飾和顆粒狀紋飾三大類，繼而根據(jù)網(wǎng)脊類型和網(wǎng)眼密度分為六亞類。其中，箭葉淫羊藿的花粉形態(tài)包含了全部的三大類六亞類，天平山淫羊藿包含其中的三大類四亞類。天平山淫羊藿花粉特征為箭葉淫羊藿花粉形態(tài)變異的子集。整體而言，外壁紋飾類型隨緯度和海拔增加呈現(xiàn)出由網(wǎng)狀紋飾向條網(wǎng)狀紋飾過渡的趨勢?；ǚ壑饕螒B(tài)性狀特征均與海拔存在密切相關(guān)性。在花粉形態(tài)及外壁紋飾特征上，天平山淫羊藿在箭葉淫羊藿變異范圍之內(nèi)，與其他宏觀形態(tài)性狀變異一致?；ǚ坌螒B(tài)性狀無法將兩類群有效區(qū)分，未能提供天平山淫羊藿作為獨立種的有力支撐。這暗示花粉形態(tài)證據(jù)在厘清近緣類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系意義相對有限，但能否對該屬系統(tǒng)發(fā)育樹大支的界定提供有力證據(jù)還有待于進一步研究。

關(guān)鍵詞：居群，箭葉淫羊藿，天平山淫羊藿，花粉形態(tài)，形態(tài)變異

中圖分類號：Q944

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）09-1300-15

Abstract：Epimedium myrianthum having much in common with E. sagittatum. There are transitions in many morphological characters and even in key taxonomy features. In order to explore the taxonomic relationship between the two taxa，the pollen morphology and ornamentation of exine of 13 populations of E. sagittatum （including 1 population of E. sagittatum var. glabratum T. S. Ying） and 7 populations of E. myrianthum were observed and compared by scanning electron microscope （SEM）. The results showed that the pollen of both taxa was subspheroidal，with three-hole groove. Pollen size of E. sagittatum and E. myrianthum was （18.21-21.66） μm × （19.55-23.63） μm and （18.32-21.43） μm × （19.73-23.48） μm，respectively. The ornamentation of exine was an important character of pollen morphology. There were significant differences in ornamentation of exine among populations，which have been divided into three categories，namely reticulate，article reticulate and granular，and then divided into six subcategories according to the type of mesh ridge and mesh density. Among them，pollen morphology of E. sagittatum （including E. sagittatum var. glabratum） contained all three categories and six subcategories，and that of E. myrianthum contained three categories and four subcategories. This means that the pollen morphological variation pattern of E. myrianthum was a subset of E. sagittatum. On the whole，the variation pattern of the ornamentation of exine showed a trend，from reticulate to article reticulate，with the increase of latitude. And the main morphological characters of pollen were closely related to the elevation. As far as the pollen morphology concerned，the variation pattern of E. myrianthum was within the variation range of E. sagittatum，which was consistent with the variation patterns of other morphological characters. Pollen morphological characters could not distinguish the two taxa effectively，which failed to provide strong support for E. myrianthum as an independent species. It is suggested that the pollen morphological evidence is of relatively limited in clarifying the phylogenetic relationship among related taxa. However，further studies are still needed to provide strong evidence for the definition of large branches of phylogenetic trees of this genus.

Key words：population，E. sagittatum，E. myrianthum，pollen morphology，morphological variation

淫羊藿為小檗科（Berberidaceae）多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)且特有的重要藥用植物，具有補腎陽、強筋骨和祛風(fēng)濕等功效（國家藥典委員會，2015），在改善心血管疾病、提高免疫力、防癌抗癌和抗抑郁等方面具有突出功效（Zhao et al.，2018; Choi et al.，2019）。淫羊藿屬（Epimedium L.）全世界約68種，我國共發(fā)表58種，經(jīng)修訂后為46種，約85%的類群特有分布于中國（Xu et al.，2019; 徐艷琴等，2020）。淫羊藿屬是分類上十分特殊和復(fù)雜的屬，超過一半的物種為國外研究者根據(jù)少量栽培個體發(fā)表，1990年—1999年間，新種數(shù)量迅速增加，共發(fā)表26種且全部來自中國。由于短時間內(nèi)物種數(shù)量的迅速增加，缺乏足夠形態(tài)調(diào)查，加之種間雜交可育導(dǎo)致物種之間關(guān)系錯綜復(fù)雜，該屬形成了大量復(fù)合種（species complex/species aggregate）（徐艷琴等，2014a）。其中，箭葉淫羊藿復(fù)合體（E. sagittatum species complex）為淫羊藿屬最復(fù)雜的關(guān)注點之一，至少有10個類群與箭葉淫羊藿（E. sagittatum）關(guān)系密切（徐艷琴等，2014a）。徐艷琴等（2014b）對箭葉淫羊藿復(fù)合體的分類問題進行初步梳理，將氈毛淫羊藿（E. coactum）、龍頭虎氈毛淫羊藿（E. coactum var. longtouhum）、裂葉淫羊藿（E. lobophyllum）、多花淫羊藿（E. multiflorum）、靖州淫羊藿（E. jingzhouense）、劍河淫羊藿（E. myrianthum var. jianaheense）處理為天平山淫羊藿（E. myrianthum）異名，貴州淫羊藿（E. sagittatum var. guizhouense）作為箭葉淫羊藿（E. sagittatum）異名，普定淫羊藿（E. pudingense）降為箭葉淫羊藿光葉變種（E. sagittatum var. glabratum），箭葉淫羊藿復(fù)合體的分類最終追溯到箭葉淫羊藿和天平山淫羊藿的關(guān)系。

箭葉淫羊藿是淫羊藿屬分布范圍較廣的物種，也是形態(tài)變異最大、藥用歷史最悠久的物種，其分類學(xué)問題對淫羊藿屬系統(tǒng)發(fā)育重建以及分類學(xué)研究具有重要意義（Stearn，2002; 郭寶林和肖培根，2003;徐艷琴，2008;徐艷琴等，2013，2014b）。此外，箭葉淫羊藿在歷版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱藥典）均有收錄（國家藥典委員會，2015），而天平山淫羊藿為非藥典種，明確二者之間的分類關(guān)系對物種的準(zhǔn)確鑒定、藥用資源利用、藥材質(zhì)量和藥效保障具有重要意義。不同學(xué)者從植物形態(tài)、遺傳多樣性、葉背非腺毛性狀、化學(xué)活性成分和化學(xué)型等不同角度對箭葉淫羊藿進行分類學(xué)研究，結(jié)果顯示其種內(nèi)居群和個體間均呈現(xiàn)出豐富的變異（梁瓊等，2013;徐艷琴等，2013;許瑛等，2015a，b）。

從20世紀(jì)90年代開始，陸續(xù)有學(xué)者對淫羊藿屬植物花粉形態(tài)進行研究，如王悅云等（2015）對淫羊藿屬31個物種花粉形態(tài)研究表明，本屬植物的花粉大小和形狀，尤其是外壁紋飾（網(wǎng)紋紋飾，條網(wǎng)紋紋飾和條紋狀紋飾），可作為植物分類和藥材鑒定的重要依據(jù)。但不同學(xué)者對箭葉淫羊藿花粉形態(tài)描述差異較大。余旭升和劉啟宏（1991）描述的箭葉淫羊藿花粉粒徑較大，為（29.7～32.6） μm × （32.4～37.5） μm，外壁具網(wǎng)狀雕紋。梁海銳和閻文玫（1991）描述箭葉淫羊藿花粉大?。?5～30） μm × （28.7～31.9） μm，外壁紋飾為條網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼不規(guī)則。郭寶林等（1998）以及何順志和郭寶林（1997）描述箭葉淫羊藿花粉大小為20.5 μm × （22.1～25.2） μm，外壁網(wǎng)狀紋飾。三個產(chǎn)地間的箭葉淫羊藿花粉形態(tài)差異較大，花粉形態(tài)為長球形到近球形變化，外壁紋飾存在網(wǎng)脊形態(tài)和網(wǎng)眼密度的差異。王悅云等（2015）描述箭葉淫羊藿花粉大?。?8.2～21.8） μm × （39.1～42.7） μm，外壁紋飾為網(wǎng)紋紋飾，網(wǎng)眼類圓形。

“居群”概念在分類學(xué)上至關(guān)重要，前期研究往往將少量樣本代表一個物種，忽略了“居群”概念，無法獲知種內(nèi)居群間和個體間的差異。取樣局限性導(dǎo)致對種間和種內(nèi)變異范圍和變異樣式缺乏全面整體的把握，對性狀的分類學(xué)價值難以正確判斷，對“專屬性”判斷易存在偏差（徐艷琴等，2013，2014b;Xu et al.，2019），且導(dǎo)致不同學(xué)者研究結(jié)果很不一致。因此，本研究以“居群”為單位，對箭葉淫羊藿及其近緣種天平山淫羊藿展開系統(tǒng)的花粉形態(tài)研究，從花粉形態(tài)學(xué)角度為其分類關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料于花期嚴(yán)格按照居群采樣，每個居群采集19～30株個體，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)徐艷琴教授鑒定，并于江西中醫(yī)藥大學(xué)進行同質(zhì)園栽培。共采集20個居群，其中箭葉淫羊藿13個居群（含箭葉淫羊藿光葉變種1個居群），天平山淫羊藿7個居群。居群覆蓋物種主要分布區(qū)，包括湖南、湖北、貴州、江西、安徽、廣東和廣西等7?。▍^(qū)）。居群采集位置、代號、經(jīng)緯度和海拔高度等信息見表1?；ǚ塾^測于2019年花期（3月—4月）取自同質(zhì)園栽培植株。每個居群隨機選取5～6株個體，采集10～20朵雄蕊成熟的花，浸泡于FAA溶液（38%甲醛5 mL，冰醋酸5 mL，70%酒精90 mL）中，避光保存，備用。

1.2 方法

取少量花粉使用50%～90%濃度的乙醇梯度洗脫，干燥后用牙簽挑取少量花粉，均勻粘在樣品臺的導(dǎo)電膠紙上，置于FEI型Quanta 250場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡（SEM）下進行觀察，工作電壓為5 kV。在不同倍數(shù)下選取清晰且具有代表性的視野進行觀測，于800倍視野下觀察花粉整體效果并隨機選取20?；ǚ蹨y量其極軸長（polar axis）和赤道軸長（equator axis），10 000倍視野下觀察花粉的極面和赤道面，24 000倍視野下觀察花粉外壁紋飾特征，并測量網(wǎng)眼直徑（mesh diameter）和網(wǎng)脊寬度（mesh ridge width）。不同視野均拍照保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

計算極軸長與赤道軸長的比值（P/E，Polar axis/equator axis），網(wǎng)眼直徑與網(wǎng)脊寬度比值（D/W，Diameter/width）。用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析，統(tǒng)計各居群花粉形態(tài)性狀的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，將三種花粉外壁紋飾（網(wǎng)紋紋飾、條網(wǎng)紋紋飾、顆粒狀紋飾）分別賦值為1、2、3，對花粉外壁紋飾和主要地理生態(tài)因子（經(jīng)度、緯度與海拔）進行相關(guān)性分析。用MVSP3.0軟件對花粉外壁類型及形態(tài)量化性狀進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化及聚類分析。用DPS9.01軟件進行灰色關(guān)聯(lián)度分析，花粉形態(tài)特征作為母因素，生態(tài)因子作為子因素。用Photoshop軟件編輯圖片。為保證研究的系統(tǒng)性和可比性，本研究花粉形態(tài)特征的描述術(shù)語及類型劃分參考梁海銳和閻文玫（1991）、郭寶林等（1998）和王悅云等（2015）對淫羊藿屬植物花粉形態(tài)的研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿花粉形態(tài)比較 （圖5）

2.1.1花粉大小 箭葉淫羊藿和天平山淫羊藿花粉均為單粒，近球形，具三裂孔溝。兩種淫羊藿花粉大小差異不大，箭葉淫羊藿花粉粒大小為 （18.21～21.66） μm × （19.55～23.63） μm，P/E為1.06～1.08，天平山淫羊藿花粉粒大小為（18.32～21.43） μm × （19.73～23.48） μm，P/E為1.07～1.09。

2.1.2 花粉外壁紋飾 根據(jù)花粉外壁紋飾可以分為三大類：網(wǎng)狀紋飾（Ⅰ）、條網(wǎng)狀紋飾（Ⅱ）和顆粒狀突起紋飾（Ⅲ）。

第Ⅰ類為網(wǎng)紋紋飾。根據(jù)網(wǎng)脊和網(wǎng)眼密度，該類型進而分為三個亞類：Ⅰ-1類，網(wǎng)紋紋飾，網(wǎng)脊平滑，無網(wǎng)眼或具稀疏網(wǎng)眼，此類型包括箭葉淫羊藿JXNF和HNJY居群，天平山淫羊藿GXLZ、GZSS和GZLC居群;Ⅰ-2類，網(wǎng)紋紋飾，網(wǎng)脊具瘤狀突起，具網(wǎng)眼，此類型包括箭葉淫羊藿HNJS居群和天平山淫羊藿HNSZ居群;Ⅰ-3類，網(wǎng)紋紋飾，網(wǎng)脊平滑，網(wǎng)眼多，此類型包括箭葉淫羊藿HNJH、HNLY和GDRY居群，其中GDRY和HNLY兩個居群花粉外壁紋飾均出現(xiàn)局部不規(guī)則條網(wǎng)狀紋飾。

第Ⅱ類為條網(wǎng)紋紋飾。該類型根據(jù)紋飾方向和網(wǎng)眼密度進而分為兩個亞類：Ⅱ-1類，方向不規(guī)則條網(wǎng)紋紋飾，網(wǎng)脊平滑，網(wǎng)眼較少或無，包括箭葉淫羊藿AHHS和HNZJ居群、箭葉淫羊藿光葉變種JXSL居群、天平山淫羊藿GZZY和GZKY居群;Ⅱ-2類，方向規(guī)則條網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)脊平滑，網(wǎng)眼較多，包括箭葉淫羊藿HBLT、JXWN和JXWY居群。其中：JXWN居群1/3的花粉外壁紋飾為條網(wǎng)紋紋飾，2/3的花粉其外壁紋飾以條網(wǎng)紋紋飾為主，局部呈現(xiàn)網(wǎng)狀紋飾;JXWY居群花粉外壁紋飾為條網(wǎng)狀紋飾，局部呈現(xiàn)網(wǎng)狀紋飾。

第Ⅲ類為顆粒狀紋飾?；ǚ弁獗诰哳w粒狀突起紋飾，無網(wǎng)眼，包括箭葉淫羊藿HBHF居群和天平山淫羊藿HBTP居群。

由以上結(jié)果可知，箭葉淫羊藿和天平山淫羊藿兩類群的花粉形態(tài)均存在較豐富的變異，均包含了三類外壁紋飾。但是，箭葉淫羊藿出現(xiàn)了所有六亞類類型，天平山淫羊藿則包含其中四亞類。因此，天平山淫羊藿的花粉形態(tài)性狀為箭葉淫羊藿花粉形態(tài)變異的子集。

2.2 箭葉淫羊藿不同居群的花粉形態(tài) （圖1，圖2，圖3）

2.2.1 網(wǎng)紋紋飾 （Ⅰ類）

2.2.1.1 網(wǎng)紋紋飾-網(wǎng)脊平滑，網(wǎng)眼無或稀疏（Ⅰ-1類） JXNF花粉粒大?。?8.51～19.32） μm × （19.82～20.72） μm，近球形或近扁球形，兩極平坦，極面觀呈三裂，近三角圓形，赤道面呈近圓形。溝膜具稀疏顆粒狀突起，突起頂端圓鈍，溝較寬?；ǚ弁獗诎纪共黄?，網(wǎng)紋紋飾，網(wǎng)脊凸起且光滑，無網(wǎng)眼，近兩極與溝邊處網(wǎng)紋模糊。HNJY 花粉粒大小（20.50～21.64） μm × （21.88～23.50） μm，近球形，兩極平坦，極面觀三裂，圓形，赤道面呈近圓形。溝膜具瘤狀突起，分布均勻?；ǚ弁獗诎纪共黄剑W(wǎng)紋紋飾，網(wǎng)紋較模糊，無網(wǎng)眼，網(wǎng)脊表面無突起。

2.2.1.2 網(wǎng)紋紋飾-網(wǎng)脊具瘤狀突起，網(wǎng)眼較多（Ⅰ-2類） HNJS 花粉粒大?。?0.00～20.54） μm × （20.97～21.72） μm，近球形，極面觀圓形，具三溝，中間較寬。溝膜褶皺，具顆粒狀突起。外壁具清晰網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)脊上表面不平，具瘤狀突起，網(wǎng)眼密集，類圓形，分布均勻，近兩極網(wǎng)眼變小，網(wǎng)脊寬度與網(wǎng)眼直徑相近。

2.2.1.3 網(wǎng)紋紋飾-網(wǎng)脊平滑，網(wǎng)眼較多（Ⅰ-3類） HNJH 花粉粒大?。?1.69～22.64） μm × （23.09～24.07） μm，近球形，極面觀三裂圓形，極面觀較大，赤道面呈橢圓形。溝較寬，溝膜具顆粒狀突起，分布均勻，顆粒頂端圓鈍?；ǚ弁獗诰W(wǎng)狀紋飾，近赤道軸具大小不一的網(wǎng)眼。但靠近兩極和溝邊無網(wǎng)眼，外壁部分區(qū)域也出現(xiàn)模糊無網(wǎng)眼的紋飾。HNLY 花粉粒大?。?9.97～20.66） μm × （20.73～21.47） μm，近球形，極面觀三裂圓形，赤道面兩極平坦。溝膜具顆粒狀突起，頂端圓鈍，分布均勻?；ǚ弁獗诰W(wǎng)狀紋飾局部呈條網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋清晰，近赤道軸網(wǎng)眼較大，不規(guī)則均勻分布，偶可通過網(wǎng)眼看見柱狀層。近兩極與兩溝邊處網(wǎng)眼較小。

GDRY 花粉粒大?。?8.79～19.98） μm × （20.83～22.23） μm，近球形，極面觀三裂圓形，溝膜具較大顆粒狀突起?；ǚ弁獗诰W(wǎng)狀紋飾局部呈不規(guī)則條網(wǎng)狀紋飾，具大小不一形狀不規(guī)則的網(wǎng)眼。需特別說明的是，GDRY和HNLY兩個居群出現(xiàn)了花粉紋飾的變異，主要為網(wǎng)狀紋飾但局部呈現(xiàn)不規(guī)則條網(wǎng)狀紋飾。根據(jù)外壁紋飾整體情況，將其仍劃分到網(wǎng)紋紋飾類型下。

2.2.2 條網(wǎng)紋紋飾 （Ⅱ類）

2.2.2.1條網(wǎng)紋紋飾-網(wǎng)眼少或無，不規(guī)則條網(wǎng)紋（Ⅱ-1類） AHHS花粉粒大小（20.67～21.49） μm × （21.53～22.64） μm，近球形，極面觀三裂圓形，赤道面橢圓形。溝膜密布均勻顆粒狀突起，頂端圓鈍。花粉外壁條網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋方向不規(guī)則，網(wǎng)紋清晰，方向不規(guī)則，條狀網(wǎng)脊突起，兩極與兩溝邊條網(wǎng)狀紋飾模糊，外壁偶見極少數(shù)不均勻小網(wǎng)眼。HNZJ 花粉粒大?。?0.52～21.66） μm × （22.33～23.76） μm，極面觀三裂圓形，溝膜具密集瘤狀突起?；ǚ弁獗跒闂l網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋方向不規(guī)則，無網(wǎng)眼或近赤道軸處具極稀疏網(wǎng)眼。JXSL花粉粒大?。?0.39～21.26） μm × （21.92～23.04） μm，近球形，極面觀三裂圓形，赤道面兩極漸窄。溝較窄，溝膜具顆粒狀突起，頂端圓鈍，分布均勻?；ǚ弁獗跅l網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋清晰，網(wǎng)脊平滑，赤道軸稀疏網(wǎng)眼，分布不均勻，近兩極與兩溝邊無網(wǎng)眼。

2.2.2.2 條網(wǎng)紋紋飾-網(wǎng)眼多 （Ⅱ-2類）HBLT 花粉粒大?。?8.22～19.27） μm × （19.55～20.56）μm，近球形或長球形，極面觀圓形，赤道面兩端漸窄，中間較寬。溝膜顆粒密集，分布均勻，顆粒頂端圓鈍。外壁紋飾條網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋沿極軸方向延伸，網(wǎng)脊平滑密集。網(wǎng)眼較小，不規(guī)則，網(wǎng)脊寬度大于網(wǎng)眼直徑，近赤道軸網(wǎng)眼多，近溝與兩極部位外壁網(wǎng)眼變小、變少。JXWN 花粉粒大?。?8.69～19.93） μm × （20.01～21.10） μm，近球形，極面觀三裂圓形，兩極平坦。溝較窄，溝膜具顆粒狀突起，頂端圓鈍?；ǚ弁獗跅l網(wǎng)狀紋飾或網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋清晰，方向不規(guī)則，網(wǎng)眼密集，分布均勻，近兩極或溝邊網(wǎng)眼變小。部分花粉粒近赤道軸無網(wǎng)眼，在近兩溝具稀疏網(wǎng)眼。JXWY花粉粒大?。?0.51～21.14） μm × （22.27～22.90） μm，近球形，極面觀三裂圓形，兩極平坦。溝較窄，溝膜具顆粒狀突起，頂端圓鈍。花粉外壁條網(wǎng)狀紋飾，局部網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋清晰，近赤道軸具大小不一、形狀不規(guī)則網(wǎng)眼，近兩極或溝邊無網(wǎng)眼。

需特別說明的是，JXWN和JXWY兩個居群出現(xiàn)了花粉紋飾的變異，JXWN居群1/3的花粉外壁紋飾為條網(wǎng)紋紋飾，2/3的花粉其外壁紋飾以條網(wǎng)紋紋飾為主，局部呈現(xiàn)網(wǎng)狀紋飾。JXWY居群花粉外壁紋飾為條網(wǎng)狀紋飾，局部呈現(xiàn)網(wǎng)狀紋飾。

2.2.3 顆粒狀突起 （Ⅲ類） HBHF 花粉粒大?。?9.77～20.81） μm × （21.14～22.28） μm，近球形，極面觀三裂圓形，赤道面呈近圓形。溝膜具不規(guī)則顆粒狀突起?；ǚ弁獗诎纪共黄?，密布瘤狀小突起，兩極具極稀疏網(wǎng)眼，部分近赤道軸具極少數(shù)幾個網(wǎng)眼，網(wǎng)眼極小，網(wǎng)脊光滑。

2.3 天平山淫羊藿花粉形態(tài) （圖3，圖4）

2.3.1 網(wǎng)紋紋飾（Ⅰ類）

2.3.1.1 網(wǎng)紋紋飾-網(wǎng)眼少或無 （Ⅰ-1類） GXLZ 花粉粒大?。?9.99～20.46） μm × （22.30～23.34） μm，近球形，極面觀三裂圓形，赤道面兩極漸窄。溝較窄，近兩極漸尖或極尖，溝膜具密集不規(guī)則顆粒狀突起，頂端圓鈍，分布均勻?；ǚ弁獗诰W(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋清晰，具極稀疏小網(wǎng)眼。GZSS 花粉粒大?。?8.32～18.98） μm × （19.73～20.27） μm，近球形，極面觀三裂圓形，赤道面兩極漸窄。溝較窄，近兩

極漸尖或極尖，溝膜具密集不規(guī)則顆粒狀突起?；ǚ弁獗诰W(wǎng)狀紋飾，局部具稀疏大小不一形態(tài)不規(guī)則的網(wǎng)眼。部分花粉粒外壁網(wǎng)紋模糊，無網(wǎng)眼。GZLC 花粉粒大?。?9.08～19.97） μm × （20.80～21.63） μm，近球形，極面觀三裂圓形。溝較寬，溝膜具顆粒狀突起?；ǚ弁獗诰W(wǎng)狀紋飾，部分花粉粒網(wǎng)紋模糊。無網(wǎng)眼或近赤道軸具稀疏不規(guī)則網(wǎng)眼。

2.3.1.2 網(wǎng)紋紋飾-網(wǎng)眼較多，網(wǎng)脊具瘤狀突起（Ⅰ-2類）HNSZ 花粉粒大?。?9.10～20.60） μm × （20.90～21.64） μm，近球形，極面觀三裂圓形。

溝膜具顆粒狀突起。花粉外壁網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋清晰，網(wǎng)脊上具密集瘤狀突起，赤道軸具大小不一、近圓形的網(wǎng)眼。

2.3.2 條網(wǎng)紋紋飾 （Ⅱ類）

條網(wǎng)紋紋飾-網(wǎng)眼少或無 （Ⅱ-1類） GZZY 花粉粒大?。?9.46～20.90） μm × （21.10～22.09） μm，近球形，極面觀三裂圓形，赤道面近兩極漸窄。溝膜具顆粒狀突起?；ǚ弁獗诜较虿灰?guī)則條網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)紋清晰，近赤道軸具極稀疏不均勻小網(wǎng)眼。GZKY 花粉粒大?。?0.35～21.43） μm × （22.41～23.48） μm，近球形，極面觀三裂圓形，赤道面兩極漸窄。溝較窄，近兩極漸尖或極尖，溝膜具密集不規(guī)則顆粒狀突起?；ǚ弁獗诰卟灰?guī)則條網(wǎng)狀紋飾，近兩極與溝邊網(wǎng)紋模糊，偶見具極稀疏小網(wǎng)眼。

2.3.3顆粒狀突起 （Ⅲ類） HBTP 花粉粒大?。?0.27～21.06） μm × （21.10～21.81） μm，近球形，極面觀三裂圓形。溝較窄，近兩極漸尖，溝膜具密集不規(guī)則顆粒狀突起。花粉外壁具密集顆粒狀突起，赤道軸具極稀疏不均勻小網(wǎng)眼。

2.4 花粉形態(tài)特征與生態(tài)因子相關(guān)性

2.4.1 花粉外壁紋飾與生態(tài)因子的相關(guān)性分析 從各居群的地理分布及其花粉外壁紋飾特征來看，兩者呈現(xiàn)一定規(guī)律（圖5）。網(wǎng)狀紋飾（Ⅰ型）主要分布于廣東和廣西的北部，貴州、江西和湖南三省南部，如GZLZ、HNJY、HNJH、GZLC、GZSS和JXNF居群。條網(wǎng)狀紋飾（Ⅱ型）主要分布于貴州、湖南和江西三省的中部，安徽省南部及鄰近的湖北省區(qū)域，如GZKY、GZZY、HNZJ、JXSL、AHHS和HBLT居群。顆粒狀紋飾（Ⅲ型）的HBHF和HBTP兩個居群分布于湖北西部。從整體來看，花粉外壁紋飾呈現(xiàn)隨緯度逐漸過渡的趨勢。與海拔、經(jīng)度及緯度的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，緯度與花粉外壁紋飾類型顯著相關(guān)（P=0.006），隨著緯度升高，花粉外壁紋飾從Ⅰ型（網(wǎng)狀紋飾）過渡到Ⅱ型（條網(wǎng)狀紋飾）型和Ⅲ型（顆粒狀紋飾）。花粉外壁紋飾類型與海拔呈顯著相關(guān)（P=0.046），與經(jīng)度不存在顯著相關(guān)性（P=0.829）。

2.4.2 花粉形態(tài)特征與生態(tài)因子的灰色關(guān)聯(lián)度分析 對不同居群淫羊藿花粉形態(tài)特征性狀與生態(tài)因子灰色關(guān)聯(lián)度分析結(jié)果表明，不同生態(tài)因子對花粉形態(tài)性狀的影響各不同（表3）。其中，對赤道軸長、網(wǎng)孔直徑、網(wǎng)眼直徑/網(wǎng)脊寬度和花粉外壁紋飾影響程度均為海拔>北緯>東經(jīng)，對極軸長和極軸長/赤道軸長影響程度為海拔>東經(jīng)>北緯，對網(wǎng)脊寬度影響程度為東經(jīng)>海拔>北緯。

三角形：箭葉淫羊藿（含光葉變種）; 正方形：天平山淫羊藿。綠色：網(wǎng)狀紋飾; 紅色：條網(wǎng)狀紋飾; 黑色：顆粒狀紋飾; 紅色為主加綠色（JXWN、JXWY）：主要為條網(wǎng)紋紋飾，局部出現(xiàn)網(wǎng)紋紋飾; 綠色為主加紅色（GDRY、HNLY）：主要為網(wǎng)紋紋飾，局部出現(xiàn)條網(wǎng)紋紋飾。實心：網(wǎng)眼少或無; 空心：網(wǎng)眼較多。下同。

triangle：Epimedium sagittatum and E. sagittatum var. glabratum; square：E. myrianthum. green：Reticulate exine; red：Article reticulate exine; black：Granular exine; red plus green （JXWN，JXWY）：Mainly article reticulate exine，with reticulate exine; green plus red （GDRY，HNLY）：Mainly reticulate exine，with article reticulate exine. solid：Few or no pollen mesh; hollow：With many pollen meshes. The same below.

從總體來看，淫羊藿花粉形態(tài)特征指標(biāo)與生態(tài)因子之間的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)（ri）為0.589 6～0.734 6，表明生態(tài)因子與淫羊藿花粉形態(tài)關(guān)系較為密切。其中，海拔與極軸長、赤道軸長、極軸長/赤道軸長、網(wǎng)眼直徑、網(wǎng)眼直徑/網(wǎng)脊寬度和花粉紋飾類型的ri均為最高，說明海拔是影響花粉主要形態(tài)性狀的主導(dǎo)因子（ri= 0.665 0～0.734 6）;東經(jīng)是影響網(wǎng)脊寬度的主導(dǎo)因子（ri= 0.638 8）。值得關(guān)注的是，北緯是影響花粉形態(tài)大小特征和花粉外壁紋飾的重要因子（ri = 0.589 6～0.712 0）。

基于以上花粉形態(tài)特征與生態(tài)因子相關(guān)性分析結(jié)果表明，兩者間存在密切相關(guān)性。就外壁紋飾及生態(tài)因子相關(guān)性而言，不同分析軟件結(jié)果存在一定差異。SPSS21.0分析結(jié)果顯示，緯度和海拔均與花粉外壁紋飾存在顯著相關(guān)性，但緯度的相關(guān)性更強。DPS9.01分析結(jié)果顯示，海拔和緯度均與花粉外壁紋飾關(guān)系密切，但海拔的關(guān)聯(lián)度更高。就整體而言，以上均說明海拔和緯度對花粉形態(tài)的影響較突出。

2.5 花粉形態(tài)聚類

聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳距離3.2處，所有居群分為五組（圖6）。由圖6可知，HNZJ花粉粒較大，單獨聚為一組;第二組包括箭葉淫羊藿HBHF，天平山淫羊藿HBTP，花粉外壁紋飾類型為顆粒狀紋飾;第三組包括箭葉淫羊藿4個居群（HNJH、JXSL、HNJY、JXWY）和天平山淫羊藿2個居群（GXLZ、GZKY），包含了網(wǎng)狀紋飾和條網(wǎng)狀紋飾類型;第四組為箭葉淫羊藿HBLT，花粉外壁紋飾為條網(wǎng)狀紋飾;第五組包括箭葉淫羊藿6個居群（JXNF、GDRY、HNJS、JXWN、HNLY和AHHS），天平山淫羊藿4個居群（HNSZ、GZSS、GZLC和GZZY），花粉外壁紋飾包括網(wǎng)紋紋飾和條網(wǎng)紋紋飾類型。

基于花粉形態(tài)數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果表明，箭葉淫羊藿與天平山淫羊藿在花粉形態(tài)特征上無明顯區(qū)分和間斷，兩類群的居群在聚類分支中混雜。3 討論與結(jié)論

3.1 箭葉淫羊藿花粉形態(tài)特征及分類啟示

箭葉淫羊藿作為淫羊藿屬植物中種內(nèi)變異范圍最大的物種，無論是在植物形態(tài)、遺傳變異，還是在化學(xué)型上都存在豐富的多樣性，可能是多型種（徐艷琴，2008;梁瓊等，2013;許瑛等，2015a）。暗示對箭葉淫羊藿的研究，樣本的選擇需非常謹(jǐn)慎（徐艷琴等，2013）。樣本要盡可能全面，在樣本數(shù)量不足的情況下，一個連續(xù)的變異式樣會呈現(xiàn)間斷的形式，種及種下類群的建立應(yīng)以天然居群為基礎(chǔ)，這是現(xiàn)代分類學(xué)的基本原則（湯彥承和向秋云，1989）。因為同一物種的居群間甚至同一居群不同個體間都可能存在一定程度變異，以居群為基礎(chǔ)的系統(tǒng)研究對全面掌握類群變異范圍和變異式樣，評估其分類價值具有重要意義（劉少雄等，2016;Liu et al.，2017; Xu et al.，2019）。但是，以往淫羊藿屬孢粉學(xué)研究往往忽略“居群”概念，以單一產(chǎn)地的少量代表整個物種，導(dǎo)致不同學(xué)者對同一物種花粉形態(tài)描述存在較大差異，且在分類上易出現(xiàn)分類過細(xì)的弊端。

本研究對箭葉淫羊藿12個居群及其變種1居群的花粉形態(tài)進行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)花粉性狀與宏觀形態(tài)變異相似，同樣存在廣泛變異，不同居群在其主要特征上存在較大差異。觀察到網(wǎng)狀紋飾、條網(wǎng)狀紋飾和顆粒狀紋飾三大類花粉外壁紋飾，進而根據(jù)網(wǎng)脊和網(wǎng)眼特征細(xì)分為六亞類。從花粉外壁紋飾性狀來看，本研究涵蓋了以往研究的所有變異，如梁海銳和閻文玫（1991）觀察的條網(wǎng)狀紋飾，余旭升和劉啟宏（1991）報道的網(wǎng)狀雕紋，何順志和郭寶林（1997）、王悅云等（2015）描述的網(wǎng)狀紋飾。此外，本研究還觀察到條網(wǎng)狀紋飾和顆粒狀紋飾。這證明箭葉淫羊藿研究取材全面的重要性和必要性。

王悅云等（2015）基于淫羊藿屬31種植物花粉形態(tài)的研究，認(rèn)為花粉外壁紋飾可用于植物分類的依據(jù)，并根據(jù)箭葉淫羊藿花粉外壁為網(wǎng)紋紋飾，而普定淫羊藿花粉外壁為條網(wǎng)紋紋飾，從而支持普定淫羊藿獨立成種。但從本研究結(jié)果來看，箭葉淫羊藿多個居群花粉外壁紋飾都為條網(wǎng)狀紋飾（如AHHS、HNZJ、HBLT、JXWN和JXWY），證明該性狀并非為普定淫羊藿特有的間斷性狀，因此依據(jù)花粉特征不能支持普定淫羊藿單獨成種。徐艷琴等（2014b）根據(jù)宏觀外部形態(tài)特征，將普定淫羊藿降為箭葉淫羊藿光葉變種。王悅云等（2015）描述的普定淫羊藿與本研究中箭葉淫羊藿光葉變種JXSL居群的花粉外壁形態(tài)均為條網(wǎng)狀紋飾，依據(jù)花粉形態(tài)更支持將普定淫羊藿降為箭葉淫羊藿光葉變種。

3.2 箭葉淫羊藿和天平山淫羊藿分類關(guān)系討論

箭葉淫羊藿復(fù)合體的分類問題最終追溯到箭葉淫羊藿和天平山淫羊藿之間的關(guān)系上（徐艷琴等，2014b）。本課題組基于廣泛的野外形態(tài)觀測，發(fā)現(xiàn)兩類群間多個關(guān)鍵性狀重疊，如Stearn（1998）描述天平山淫羊藿新種時指出，箭葉淫羊藿葉緣波狀，幼時綠色，而天平山淫羊藿葉緣平展，幼時帶有明顯紅色斑點。但實際兩類群多數(shù)居群幼葉均帶有數(shù)量和深淺不一紅色斑點或斑塊。此外，在花莖上葉的數(shù)量、外萼顏色、花瓣顏色和形狀等方面，兩類群均存在過渡和交集（徐艷琴等，2014b）。兩類群最主要的區(qū)別在于花序類型，是狹而直的圓錐花序（箭葉淫羊藿）還是鋪傘形圓錐花序（天平山淫羊藿），以及由此導(dǎo)致小花數(shù)量和大小上的差異（徐艷琴等，2014b）。許瑛等（2015a，b，2016）先后基于淫羊藿多苷成分淫對箭葉淫羊藿的16個居群和天平山淫羊藿的8個居群進行質(zhì)量評價，發(fā)現(xiàn)兩類群不同居群間均存在較大差異，且天平山淫羊藿三種化學(xué)型在箭葉淫羊藿化學(xué)型變異范圍內(nèi)。本研究基于花粉形態(tài)數(shù)據(jù)及聚類分析結(jié)果顯示，天平山淫羊藿與箭葉淫羊藿在花粉形態(tài)特征上無明顯區(qū)分和間斷，外壁紋飾的變異也均在箭葉淫羊藿變異范圍之內(nèi)，與其宏觀形態(tài)性狀變異趨勢一致。因此，基于孢粉學(xué)證據(jù)，天平山淫羊藿與箭葉淫羊藿不存在明顯間斷，未能提供天平山淫羊藿單獨成種的有力證據(jù)。但目前尚不能因為天平山淫羊藿的花粉形態(tài)變異在箭葉淫羊藿變異范圍內(nèi)，就否定天平山淫羊藿的物種地位。從前人對淫羊藿屬不同物種花粉形態(tài)的研究結(jié)果來看（梁海銳和閻文玫，1991;余旭升和劉啟宏，1991;何順志和郭寶林，1997;郭寶林等，1998;王悅云等，2015），本研究箭葉淫羊藿花粉外壁紋飾的變異涵蓋了多數(shù)物種的變異。因此，孢粉學(xué)證據(jù)的分類學(xué)意義在于對整屬的花粉形態(tài)特征只有進行系統(tǒng)研究，才能獲得客觀結(jié)論。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）