岷江柏野生居群和遷地保護居群的遺傳多樣性比較

常二梅 劉建鋒 黃躍寧 李紅麗 單冰燕 江澤平 趙秀蓮*

（1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 國家林業(yè)局林木培育重點實驗室，北京 100091；3. 北京林業(yè)大學(xué)，北京 100083；4. 邯鄲市永年區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 056011；5. 中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所，北京 100091）

岷江柏（）為國家二級保護植物，主要分布在岷江流域、大渡河流域和白龍江流域，是特有的水土保持和先鋒造林樹種之一，具有很高的生態(tài)和研究價值。前期的研究表明野生岷江柏具有較高的遺傳多樣性，受人為干擾等因素造成野生居群的遺傳多樣性水平逐漸降低。四川大渡河中上游地區(qū)的岷江柏數(shù)量約占野生岷江柏數(shù)量的90%。近年，由于四川大渡河水電站的開發(fā)，造成兩岸的野生岷江柏直接被淹沒，岷江柏野生種群面積日益縮小，而野生天然林的遺傳多樣性、穩(wěn)定性高于人工林。因此，保護野生岷江柏種質(zhì)資源勢在必行。

大量研究表明遷地保護是有效保護野生物種居群延續(xù)的有效方法。遷地保護后的居群遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及居群間基因流等是遷地保護有效性的指標(biāo)。對瀕危的野生物種如黃梅秤錘樹（）、金花茶（）的遷地保護居群和其野生居群進行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)狀況對比分析，發(fā)現(xiàn)遷地保護能有效地保存這些植物的種質(zhì)資源，但是仍存在遷地保護居群較小的問題。而狹葉坡 壘（）、廣 西 火 桐（）、南方紅豆杉（var.）遷地保護居群的遺傳多樣性較低，這可能是遷地保護中收集種子的范圍小，沒有涵蓋整個居群。因此，對野生居群和遷地保護居群的遺傳多樣性評價對于瀕危植物居群保育具有重要意義。

將物種從野生狀態(tài)下移栽到某一地方后其遺傳多樣性可能會發(fā)生變化，GBS 測序技術(shù)能有效地對種質(zhì)資源居群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進行研究，如利用InDel 和SNP 位點分析寬皮柑橘（）、密花石斛（）的居群遺傳和進化。岷江柏遷地保護的地理位置與原來野生居群的地理位置不同，海拔、氣溫及濕度等生長環(huán)境差異較大。而對于遷地保護后的岷江柏居群和野生居群遺傳多樣性、居群結(jié)構(gòu)等諸多方面評價還缺乏較為系統(tǒng)的研究。因此，本文利用GBS（Genotyping-by-Sequencing）高通量測序技術(shù)和生物信息分析技術(shù)，通過對野生居群和遷地保護居群分別進行遺傳多樣性分析對比，探索這兩類居群在居群遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育等方面的關(guān)系和差異。經(jīng)過對岷江柏野生居群分布情況進行全面清查，為岷江柏野生居群的遷地保護提供技術(shù)保障和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年開始的四川大渡河上游長河壩電站建設(shè)直接影響野生岷江柏的生存環(huán)境及物種保護，2019年8月對4個地點的岷江柏居群進行采樣（具體分布地點見表1）。選取當(dāng)卡土料場移栽的不同高度（＜1.0 m、1.0～1.5 m、1.5～2.0 m、2.0～2.5 m、2.5～3.0 m）的移栽苗18 株、當(dāng)卡土料場人工播種苗4株、松崗鎮(zhèn)野生苗4株，熱足電站野生苗3株，白灣隧道野生苗4 株。采集以上33 株的當(dāng)年生葉片放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試的岷江柏居群概況Table 1 The status of populations of C.chengiana

1.2 試驗方法

利用CTAB 法提取岷江柏葉片的DNA，用OD值和質(zhì)量濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量和濃度。質(zhì)量合格的DNA 進行PCR 擴增。建立文庫并經(jīng)過純化、庫檢，Hiseq X10 PE150 上機測序。通過測序質(zhì)量評估過濾后得到測序原始數(shù)據(jù)。使用聚類軟件stacks（1.43）對合格的測序數(shù)據(jù)進行reads 聚類，設(shè)置參數(shù)為-m6-M 6-N0-i1-H，得到tags。再對tags進行overlap處理，對于沒有overlap的tags用N進行鏈接，最后用腳本制作成大小一致的假基因組進行后續(xù)分析。

1.3 生物信息學(xué)分析

對于鑒定到的SNP 和InDel 用Annovar 軟件進行注釋。根據(jù)得到的SNP 信息，計算樣品間距離，對樣品進行居群主成分分析（PCA 分析）、聚類分析、構(gòu)建分子進化樹，從而推斷出居群間的親緣關(guān)系遠近。

利用POPGENE version 1.32 軟件分別計算觀察樣本的雜合度（）、期望雜合度（）、基因多樣性指數(shù)（）、多態(tài)信息含量（）、Shannon 信息指數(shù)（）、固定指數(shù)F（Fixed index）、核苷酸多樣性（）、遺傳分化指數(shù)（）及基因流（）。使用treebest 軟件，通過鄰接法（neighbor-joining methods）構(gòu)建進化樹。使用Admixture軟件進行居群結(jié)構(gòu)分析。居群結(jié)構(gòu)分析圖注：以每種顏色代表一個居群，用每個豎線塊代表一個樣本；每個豎線塊的寬度代表在祖先居群中的比例。居群結(jié)構(gòu)交叉驗證分析圖注，找到最合適的值。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量

將18 株岷江柏移栽個體、4 株播種個體及11株野生岷江柏個體進行GBS 測序，共獲得Clean Data 118 321 514 728 bp，Q平均值為96.81%，Q平均值（測序堿基質(zhì)量值，即測序時錯誤識別的概率是0.1%、正確率為99.9%的堿基比例）為91.23%，GC 含量為35.22%，岷江柏居群過濾后的SNP 位點有1 259 610個。

2.2 岷江柏遷地保護和野生居群的遺傳聚類

根據(jù)岷江柏居群測序過濾后的1 259 610 個SNP 位點進行分析，構(gòu)建遷地保護居群和野生居群個體的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（見圖1），從圖1 的可以看出，共分5 個分支，第1 分支包括高度為2.0～2.5 m、2.5～3.0 m 的當(dāng)卡土料場移栽地的岷江柏個體；第2 分支包括高度為2.5～3.0 m 的當(dāng)卡土料場移栽地岷江柏個體、苗圃地的播種種植的岷江柏個體、熱足電站野生岷江柏個體；第3 分支包括高度為1.0～1.5 m、1.5～2.0 m 的卡土料場移栽的岷江柏個體，第4 分支包括高度小于1.0 m 當(dāng)卡土料場移栽的岷江柏個體、苗圃地播種種植的岷江柏個體、白灣隧道野生的岷江柏個體聚在一起；尤其是第5分支包括當(dāng)卡土料場移栽種植的岷江柏個體、熱足電站野生的岷江柏個體、白灣隧道野生的岷江柏個體、松崗鎮(zhèn)野生的岷江柏個體，表明移栽的岷江柏個體和野生的岷江柏個體之間有較近的親緣關(guān)系。

圖1 泯江柏個體系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Individual phylogenetic tree of C.chengiana

2.3 岷江柏遷地保護和野生居群的主成分分析

居群主成分分析能反應(yīng)出岷江柏個體之間的親緣關(guān)系（見圖2）。PC1、PC2 的貢獻率分別為3.77%和3.65%，累計貢獻7.42%。PC2、PC3 的貢獻率分別為3.65% 和3.46%，累計貢獻7.11%。PC1、PC2、PC3 共同解釋了10.88%的總變異。貢獻率低說明33個岷江柏個體沒有被分開。不同地點間的個體在PCA 圖上的分布分散，但沒有明顯的分群現(xiàn)象，這也表明所有個體之間親緣關(guān)系較近。與岷江柏個體系統(tǒng)發(fā)育進化樹的結(jié)果相似，表明移栽的岷江柏個體沒有產(chǎn)生遺傳變異，表明這些岷江柏個體可能是來自同一個居群。

圖2 岷江柏遷地保護和野生居群的主成分分析Fig.2 The analysis of principal componentsof wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

2.4 岷江柏遷地保護和野生的居群結(jié)構(gòu)

通過Structure 軟件基于開發(fā)出的1 259 610個SNP 位點，將遷地保護居群和野生居群的33 個岷江柏個體進行交叉驗證聚類。從圖3 可以看出交叉驗證錯誤率的谷值確定最優(yōu)分群數(shù)為1。值設(shè)置為1～9 進行聚類（見圖4），聚類情況及各個值對應(yīng)的交叉驗證錯誤率，值等于2～5、8～9 時，DK-a4 和RJ-d1 聚在一起，說明這兩個個體親緣關(guān)系較近，移栽居群和野生居群的遺傳多樣性差異不大。結(jié)果表明33 個岷江柏個體為一個居群，進一步說明聚類的準(zhǔn)確性，可以判斷岷江柏移栽后遺傳多樣性沒有發(fā)生改變。

圖3 岷江柏遷地保護和野生居群的不同K 值所對應(yīng)的的交叉驗證錯誤率Fig.3 The admixture validation error rate corresponding to the different K values of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

圖4 岷江柏遷地保護和野生居群的Structure聚類分析Fig.4 Structure clustering of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

2.5 岷江柏遺傳多樣性

當(dāng)卡村的遷地保護居群、松崗鎮(zhèn)野生居群、熱足電站野生居群和白灣隧道野生居群4 個居群的遺傳多樣性分析結(jié)果顯示觀測雜合度（）、期望雜合度（）、基因多樣性指數(shù)（）及Shannon 信息指數(shù)（）的平均值分別為0.243 7、0.303 1、0.308 6、0.470 7（見表2）。當(dāng)卡土料場的遷地保護居群的、、的值分別為0.300 3、0.308 9、0.464 9，均高于其他居群，說明遷地保護的岷江柏居群遺傳多樣性最高。多數(shù)位點的觀測雜合度均小于期望雜合度，這可能與居群內(nèi)存在不同程度的近交、所取樣本小等有關(guān)。值在-0.031 9～0.187 0，值在0.272 2～0.308 9，4個岷江柏居群的F_index值進行比較，當(dāng)卡土料場的遷地保護居群為0.246 5，位列第一，松崗鎮(zhèn)野生居群最低，為0.178 0。這個分析結(jié)果說明本研究中不同地理來源的岷江柏居群基因的多樣性水平較高，當(dāng)卡土料場的遷地保護居群的遺傳多樣性水平最高，熱足電站野生居群、白灣隧道野生居群遺傳多樣性水平次之，而松崗鎮(zhèn)野生居群最低。

表2 岷江柏遷地保護和野生居群間的遺傳多樣性分析Table 2 Analysis of genetic diversity of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

值是表征居群間的遺傳分化程度（見表3），對比后發(fā)現(xiàn)BW_vs_DK、BW_vs_RJ、DK_vs_RJ 的值在0～0.05，說明岷江柏居群間的遺傳分化很弱；DK_vs_SA 和BW_vs_SA 在 的值 在0.05～0.15，說明岷江柏居群間遺傳分化屬于中等水平；在5 個成對居群的值中，沒有成對居群的值大于0.25。由此可知，4 個岷江柏居群間幾乎不存在著明顯的遺傳分化。DK_vs_SA 和BW_vs_SA 的值分別為3.541 3 和2.497 0，表現(xiàn)出較高的基因交流水平。BW_vs_DK、BW_vs_RJ、DK_vs_RJ 的值分別為6.805 6、5.173 3 和10.815 9，表現(xiàn)為高度的基因交流水平，說明當(dāng)卡土料場的遷地保護居群和熱足電站野生居群的遺傳距離最近，并且可以看出岷江柏居群間的遺傳分化程度較小。

表3 岷江柏遷地保護和野生居群間的遺傳分化系數(shù)和基因流參數(shù)Table 3 Genetic diversity and genetic differentiation parameters of wild and ex-situ conservation populations of C.chengiana

對不同岷江柏居群間遺傳距離的研究有助于對其遺傳多樣性的研究，也可以用來表述岷江柏居群間遺傳結(jié)構(gòu)差異。對于不同居群之間的居群遺傳多樣性可通過Pairwise統(tǒng)計來進行研究。DK_vs_SA和BW_vs_SA的值分別為0.151和0.152，說明遺傳有顯著差異，表明其遺傳距離與其他居群也較遠。從表4可看出，遷地保護的居群與熱足電站和白灣隧道野生岷江柏居群Fst值均沒有表現(xiàn)出顯著性差異，這3個居群的遺傳距離較近。

表4 各居群之間差異位點Pairwise Fst統(tǒng)計Table 4 Pairwise Fst summary statistics for all variant positions between each population

3 討論

以往研究中，GBS 技術(shù)利用開發(fā)的SNP 標(biāo)記應(yīng)用于小麥（）、砂生槐（）、沉 水 樟（）、牛樟（）等許多植物的居群遺傳分析。本研究運用GBS 技術(shù)鑒定的SNP 位點分析發(fā)現(xiàn)大部分群聚在一起的遷地保護岷江柏居群和野生岷江柏居群，沒有明顯的分群現(xiàn)象。這與廣西火桐植物園遷地保護居群和部分野生居群聚在一起的結(jié)果相似，說明遷地保護岷江柏居群和野生居群的遺傳多樣性差異不大。

保存野生岷江柏居群的遺傳多樣性是遷地保護成功的關(guān)鍵。本文中遷地保護的岷江柏居群的=0.300 3，=0.464 9，這高于四川省和甘肅省的8 個自然居群使用ISSR 方法測定的=0.226，=0.347 和AFLP 方 法 測 定 的=0.113，=0.171，這些岷江柏居群的＜，可能是岷江柏居群的近交嚴(yán)重造成的。但是在以往的研究中大部分遷地保護的居群的遺傳多樣性水平均低于野生居群，如：金花茶居群、狹葉坡壘，這可能是遷地保存的種子繁殖苗采取了同一棵母株的種子，從而降低了單位引物多態(tài)位點比率。岷江柏居群遷地保護居群遺傳多樣總體水平略高于野生居群，主要可能有兩個原因：一是移栽能較好的保存野生居群遺傳多樣性；二是在遷地保存的移栽苗來自多個自然居群，從而增加了遺傳多樣性水平。

岷江柏的4 個居群中只有BW_vs_SA 的遺傳分化程度中等。另外其他居群的＜0.05，＞4，表明這些居群間沒有遺傳分化，居群間的基因交流頻繁。四川省（=0.475，=0.553）和甘肅?。?0.4791，=0.5436）采集的8 個自然居群出現(xiàn)了明顯的遺傳分化，居群間的基因流動頻率較低。在遷地保護狹葉坡壘、廣西火桐、南方紅豆杉居群時，也存在一定程度的遺傳分化，基因流較低，這可能是自然居群中的野外幼苗成活率低，從而限制了居群間的基因交流，增加了居群間的遺傳分化。本研究的岷江柏遷地保護居群和野生居群可能范圍較近，因此遺傳上居群間沒有出現(xiàn)顯著差異。因此，在遷地保護過程中盡可能擴大遷地保護居群的規(guī)模，增大遷地保護的個體數(shù)量，以增加其遺傳多樣性水平，同時開展長期監(jiān)測和適應(yīng)性評價，提高遷地保護效率。

4 結(jié)論

利用鑒定到的1 259 610個SNP位點分析發(fā)現(xiàn)大部分遷地保護的移栽岷江柏居群和野生岷江柏居群聚在一起，沒有明顯的分群現(xiàn)象。遷地保護的移栽岷江柏居群遺傳多樣性較高，并且居群間沒有遺傳分化，居群間的基因交流頻繁。因此，為更好地保護岷江柏居群遺傳水平，遷地保護過程中應(yīng)盡可能多地從尚未進行過收集的各自然居群中采集繁殖材料，為其他野生植物的遷地保護評價提供參考。