• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    沙棘果油對過氧化氫誘導(dǎo)氧化損傷的保護(hù)作用

    2020-11-02 14:26:39鄭鵬王波王前
    廣西植物 2020年9期
    關(guān)鍵詞:抗氧化性

    鄭鵬 王波 王前

    摘 要:沙棘(Hippophae rhamnoides)是一種具有藥用價值的植物,沙棘果油具有抗氧化、抗炎癥及抗腫瘤等多種藥理作用。為了探討沙棘果油對H2O2造成氧化性損傷的細(xì)胞生長的影響及其抗氧化性,該研究選擇H2O2對RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型,通過DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除實驗檢測沙棘果油體外抗氧化能力,用[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]MTT法和流式細(xì)胞儀檢測超氧化物陰離子熒光探針(DHE)信號,分別檢測不同濃度沙棘果油對H2O2損傷細(xì)胞的存活率和超氧化物陰離子水平。結(jié)果表明:(1)在DPPH自由基清除實驗中,當(dāng)沙棘果油濃度小于4.9%時,沙棘果油的抗氧化能力大于維生素C。(2)通過MTT法發(fā)現(xiàn),濃度為3.125%的沙棘果油對H2O2損傷細(xì)胞的存活率顯著升高(P<0.01)。(3)從DHE檢測發(fā)現(xiàn),在同一檢測時間點,隨著沙棘果油濃度增加,DHE陽性細(xì)胞比例顯著下降(P<0.01);在不同檢測時間點,隨著沙棘果油濃度增加,DHE陽性細(xì)胞比例顯著升高(P<0.01)。沙棘果油對過氧化氫誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型有一定修復(fù)作用,可能與細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平受到抑制有關(guān),它具有抗氧化性損傷的潛能。

    關(guān)鍵詞:沙棘果油,抗氧化性,MTT法,DHE,過氧化氫損傷模型

    中圖分類號:Q943.2

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    文章編號:1000-3142(2020)09-1349-08

    Abstract:The sea buckthorn fruit (Hippophae rhamnoides) oil is medically claimed as having phytoantioxidant,antiinflammatory, and anticancerous properties in humans. To explore the hydrogen peroxide of the sea buckthorn fruit oil on mouse monocyte macrophages (RAW264.7 cells) oxidative damage model. By spectrophotometry,scavenging effects of sea buckthorn fruit oil on DPPH free radicals; In vitro antioxidant activity was assessed on RAW264.7 cells against hydrogen peroxide (H2O2) induced cytotoxicity. The antioxidant effect was determined by measuring the cell dye MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] reducing assay. Then the survival rate of RAW264.7 cells was determined by MTT assay,and the expression of superoxide anion was determined by flow cytometry labeling with dihydroethidium(DHE). The results were as follows:(1)Compared with the antioxidant capacity of vitamin C,when the concentration of sea buckthorn fruit oil was less than 4.9%,the antioxidant capacity of sea buckthorn fruit oil was higher than vitamin C. (2) Comparing to the H2O2 group,3.125% sea buckthorn fruit oil group had higher survival rate(P<0.01). (3) Comparing to the H2O2 group,the proportion of DHE-positive cell was significantly decreased in the same time (P<0.01) and it was negative effect with concentration of sea buckthorn fruit oil,the proportion of DHE-positive cell was significantly increased at the same concentration(P<0.01),and which was related positive effect with concentration of sea buckthorn fruit oil (P<0.01). These results support the protective effects of sea buckthorn fruit oil against hydrogen peroxide-induced toxicity in vitro with the underlying mechanisms of inhibiting oxidative stress. Taken together,these results clearly indicate that sea buckthorn fruit oil has significant potential as a natural antioxidant agent,which could be a potential source for the discovery of natrual antioxidant health product.

    Key words:

    sea buckthorn fruit oil,oxidation resistance,MTT,DHE,hydrogen peroxide damage model

    人體在代謝過程中會產(chǎn)生活性氧自由基(ROS),包括超氧陰離子(O-2) 、羥自由基(·OH)、過氧化氫

    (H2O2) 和脂質(zhì)過氧化物的中間產(chǎn)物(Chauhan et al.,1997)。在正常的生理情況下,線粒體需要消耗約2% 的氧產(chǎn)生的ROS,由呼吸鏈底物端釋放出電子還原氧分子單電子,產(chǎn)生ROS的前體

    O-2和H2O2。在很多疾病以及衰老時,體內(nèi)氧自由基會產(chǎn)生異常積累。過量的ROS會導(dǎo)致細(xì)胞損傷或細(xì)胞凋亡。ROS的活潑性和氧化反應(yīng)能力都很強,能通過氧化作用攻擊細(xì)胞的生物大分子物質(zhì)( 核酸、蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)) 。當(dāng)人體處于亞健康狀態(tài)時,自由基異常累積會引發(fā)疾病。近年來,天然抗氧化劑因其安全、高效、能滿足亞健康人群日常保健需求的特點而受到廣泛關(guān)注。

    沙棘(Hippophae rhamnoides)是一種具有藥用價值的植物,為多年生落葉灌木或小喬木,適應(yīng)性強,能顯著改善生態(tài)環(huán)境(丁健等,2016)。沙棘果油是從沙棘的果肉中提取的油液,是沙棘的精華,食用安全性高(林黎等,2018)。目前,沙棘對調(diào)節(jié)血脂(邊慶榮等,1999)、促進(jìn)微循環(huán)(吳英等,2000)、抗炎、調(diào)節(jié)免疫(車錫平等,2000)以及抗癌(李忌等,2008)等方面的研究已有報道。我們前期研究發(fā)現(xiàn),沙棘果油對酒精引起小鼠骨髓細(xì)胞微核率和肝臟損傷有一定改善作用(王波,2019)。劉鳳云(2005)研究發(fā)現(xiàn),沙棘果油中含有棕櫚油酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸和不飽和脂肪酸,這些都是人體不能自身合成的脂肪酸,此外還含有維生素C、維生素E和胡蘿卜素等多種生物活性物質(zhì)。魏安琪(2018)研究發(fā)現(xiàn),黃酮類化合物、多酚類化合物、維生素類、多肽類、多糖類物質(zhì)等均可作為天然抗氧化劑使用。趙二勞等(2017)研究發(fā)現(xiàn),沙棘果油在體外具有抗氧化性,但此研究僅利用DPPH自由基清除實驗和Fenton實驗在體外檢測了沙棘果油的抗氧化活性,而其在體內(nèi)的抗氧化效果仍不清楚。然而,目前對日??蓴z入食品中的天然抗氧化成分含量的研究較少,尤其是在低濃度下的抗氧化能力研究更為缺乏,沙棘果油作為常用的保健品,有必要在細(xì)胞水平上對其抗氧化能力進(jìn)行深入研究。

    ROS具有性質(zhì)活潑和反應(yīng)性強的特點,既易還原又易氧化,但其本身并不穩(wěn)定。對其檢測的手段有以下幾種:電子自旋共振法(ESR)、高效液相色譜法、氣相色譜法、化學(xué)發(fā)光法、熒光分析法、分光光度法以及電化學(xué)方法。但是,這些檢測手段能夠直接測定的方法卻相當(dāng)有限,因此迫切需要開發(fā)直接測定ROS或其他自由基的檢測方法(呂惠萍等,2015)。

    本研究通過H2O2氧化刺激RAW264.7細(xì)胞建立氧化損傷的細(xì)胞模型,并對沙棘果油進(jìn)行干預(yù),先通過細(xì)胞存活率等指標(biāo)的檢測,再通過熒光探針(DHE)檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平,檢測DHE陽性細(xì)胞比例,間接反映體內(nèi)ROS水平,從多角度探討沙棘果油對氧化損傷的治療,以期為人們正確認(rèn)識沙棘果油的保健功能特性以及沙棘果油產(chǎn)品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1樣品和試劑 樣品:RAW264.7細(xì)胞(小鼠單核巨噬細(xì)胞),由中國科學(xué)院上海分院細(xì)胞庫提供。試劑:細(xì)胞培養(yǎng)試劑和消耗材料購于Gibco公司;胰蛋白酶、過氧化氫、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;沙棘果油購于山西五臺山沙棘制品有限公司;培養(yǎng)基購于Hyclone公司;96孔板購于Corning公司;超氧化物陰離子熒光探針(dihydroethidium,DHE)購于碧云天生物技術(shù)研究所;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.1.2 設(shè)備 二氧化碳孵育箱(HERE cell150)購于Thermo 公司;酶標(biāo)儀 (AD340)購于Beckmann公司;流式細(xì)胞儀(accurl C6)購于BD公司。

    1.2 方法

    1.2.1 DPPH自由基清除實驗 以維生素C這個天然的抗氧化劑作為陽性對照,采用DPPH法評估沙棘果油體外的抗氧化活性,為沙棘果油體內(nèi)抗氧化能力的檢測提供濃度依據(jù)。

    取6%沙棘果油(無水乙醇溶解)為樣品,設(shè)置維生素C(標(biāo)準(zhǔn)溶液,6%,超純水溶解)為陽性對照。沙棘果油與維生素C各設(shè)置6個濃度梯度,即6%、3%、1.5%、0.75%、0.375%、0.1875%。取96孔板,每個濃度梯度設(shè)置8個復(fù)孔,每個孔先加入100 μL樣品溶液后加入DPPH(0.24%乙醇溶液)。設(shè)置空白對照(100 μL樣品溶液+100 μL無水乙醇)、陰性對照(100 μL無水乙醇+100 μL DPPH工作液)。避光常溫下放置20 min,通過紫外-可見分光光度法測定在517 nm吸光度,取平均值。根據(jù)公式計算每個濃度的DPPH清除率,做折線圖。

    計算公式:清除率(%)=[(1-(A樣品-A空白)/A對照)]× 100 %。

    1.2.2 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞置于含有10%FBS、1%P/S的1640培養(yǎng)基以及在溫度37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育,取對數(shù)生長期細(xì)胞用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個待用。

    1.2.3 MTT溶液的配制 用生理鹽水溶解1 g的MTT固體,定容,配制成5 mg·mL-1,在無菌環(huán)境下過0.22 μm濾膜除菌分裝,盡量避光,存放于-4 ℃的冰箱下備用。

    1.2.4 H2O2氧化損傷模型建立 將培養(yǎng)基重懸細(xì)胞接種于96孔板中(每板細(xì)胞數(shù)量約1×106個)。每孔加200 μL培養(yǎng)基,搖勻,過夜培養(yǎng)。第二天,吸出每孔廢液,通過1.2的DPPH實驗可以發(fā)現(xiàn),沙棘果油在濃度5%以下均有較好的抗氧化性。分別加入濃度為5.000%、2.500%、1.250%、0.625%、0.313%、0.156%的H2O2培養(yǎng)基。每組有一個空白對照。24 h后加入每孔200 μL的MTT(5 mg·mL-1)培養(yǎng)基。放置4 h(37 ℃,5% CO2)后每孔加入150 μL DMSO。用搖床搖10 min(37 ℃)后使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測吸光度,得出適于實驗的H2O2濃度后使用不會明顯影響細(xì)胞生長的沙棘果油濃度進(jìn)行MTT實驗。

    3 討論與結(jié)論

    本研究首次利用H2O2氧化損傷細(xì)胞模型檢測天然低劑量的沙棘果油的抗氧化性。通過體外DPPH法發(fā)現(xiàn),沙棘果油的濃度在5%以下具有較好的抗氧化性,說明沙棘果油在使用時濃度并非越高越好。通過MTT法我們發(fā)現(xiàn),沙棘果油在一定濃度范圍內(nèi)提高了受氧化損傷細(xì)胞的存活率。在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗證了沙棘果油具有較好的抗氧化性(曹韋等,2016)。即使在日常攝入量較少的情況下也能夠發(fā)揮抗氧化功效,有利于進(jìn)一步闡明常見天然抗氧化劑在人體內(nèi)的活性機制與藥用價值,對于預(yù)防自由基誘發(fā)的疾病,保護(hù)人體健康具有積極意義。

    H2O2是一種重要的活性氧,大量存在會造成細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的增多(范東艷等,2018)。超氧陰離子自由基(O2-·)是細(xì)胞內(nèi)氧氣發(fā)生單電子還原反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)產(chǎn)物(張雯等,2017)。本研究中,沙棘果油提高了H2O2氧化損傷細(xì)胞存活率的結(jié)果提示,沙棘果油可能降低了胞內(nèi)過量O2-·的產(chǎn)生。Dickinson et al.(2011)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)機體產(chǎn)生過量O2-·后,可以激活細(xì)胞的自噬或凋亡信號通路,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,最終引發(fā)多種疾病。DHE是最常用的檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平的熒光探針。通過流式細(xì)胞儀靈敏地監(jiān)測O2-·陽性細(xì)胞的比例,結(jié)果進(jìn)一步驗證了沙棘果油減少了O2-·陽性細(xì)胞的數(shù)量,這可能是沙棘果油對氧化損傷細(xì)胞保護(hù)的作用途徑之一。實驗發(fā)現(xiàn),沙棘果油在使用6 h內(nèi)效果較好,但隨著時間的延長,O2-·陽性細(xì)胞的比例有所增加,可見沙棘果油對氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)能力減弱,提示沙棘果油可能需要少量多次使用才能達(dá)到較好的效果。這為日常沙棘果油的使用量及使用次數(shù)提供了一定的理論指導(dǎo)(張雯等,2017)。除了O2-·以外,沙棘果油是否還參與其他通路抑制氧化應(yīng)激過程還需要進(jìn)一步研究。沙棘果油的成分較為復(fù)雜,盡管我們知道沙棘果油中含有維生素類,但沙棘果油降低超氧陰離子自由基的功效具體是哪個成分仍需進(jìn)一步驗證。本研究結(jié)果為沙棘果油在細(xì)胞水平上的抗氧化研究以及進(jìn)一步開發(fā)沙棘果油提供了理論依據(jù)。

    參考文獻(xiàn):

    BIAN RQ,JIANG DS,MA XT,et al.,1999. Study on the effect of sea buckthorn oil on blood lipid regulation in rats [J]. Carcinoge,Teratoge & Mutage,11(6):330.? [邊慶榮,蔣東升,馬曉彤,等,1999. 沙棘油對大鼠血脂調(diào)節(jié)作用的研究 [J]. 癌變、畸變、突變,11(6):330.]

    CAO W,CHEN XP,LIU N,et al.,2016. The protective effect of gastrodin on primary cortical neurons in rats injured by hydrogen peroxide [J]. Asia-Pacific Trad Med,12(24):17-20.? [曹韋,陳小鵬,劉娜,等,2016. 天麻素對過氧化氫損傷大鼠原代皮層神經(jīng)元保護(hù)作用研究 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,12(24):17-20.]

    CHAUHAN D,PANDEY P,OGATA A,et al.,1997. Cytochrome c-dependent andindependent induction of apoptosis in multiple myeloma cells [J]. J Biol Chem,272(48):29995-29997.

    CHE XP,XU W,HUO HR,et al.,2000. Experimental study on anti-inflammatory effect of sea? buckthorn fruit oil and its influence on immune function [J]. Seabuckthorn Hippophae,13(4):28-32.? [車錫平,徐威,霍海如,等,2000. 沙棘果油的抗炎作用和對免疫功能影響的實驗研究 [J]. 沙棘,13(4):28-32.]

    DICKINSON BC,CHANG CJ,2011. Chemistry and biology of reactive oxygen species in signaling or stress responses [J]. NatChem Biol,7(8):504-511. doi:10.1038/nchembio. 607.

    DING J,GUAN Y,RUAN CJ,et al.,2016. Optimization by orthogonal array design of sea buckthorn fruit oil extraction and determination of fatty acid composition [J]. Food Sci,37(2): 13-18.? [丁健,關(guān)瑩,阮成江,等,2016. 沙棘果油提取工藝的正交試驗優(yōu)化及其脂肪酸組分測定 [J].食品科學(xué),37(2):13-18.]

    FAN DY,BAMA DJ,PAN YY,et al.,2018. Study on the induction of keratinocytes apoptosis by inhibiting oxidative stress in crude suga extract from alpine shrub [J]. Tibetan Med,39(3):19-21.? [范東艷,白瑪多吉,潘永越,等,2018. 高山灌木蘇嘎純提取液抑制H2O2誘導(dǎo)的角朊細(xì)胞凋亡的研究 [J]. 西藏醫(yī)藥,39(3):19-21.]

    LI J,WANG XX,ZHENG RL,2008. Effects of sea buckthorn extract on cancer cell DNA,protein synthesis and cAMP content in plasma in vivo [J]. Seabuckthorn Hippophae,21(1): 8-10.? [李忌,王肖萱,鄭榮梁,2008. 沙棘提取物對癌細(xì)胞DNA 、

    蛋白質(zhì)合成及體內(nèi)血漿中的cAMP 含量的影響 [J]. 沙棘,21(1):8-10.]

    LIN L,LIU KL,TIAN YQ,et al.,2018. Toxicological safety assessment of sea buckthorn oil [J]. J Prevent Med Inform,34(6):792-797.? [林黎,劉科亮,田玉瓊,等,2018. 沙棘果油的安全性毒理學(xué)評價 [J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志,34(6):792-797.]

    LIU FY,2005. Pharmacological research of sea buckthorn [J]. Bull Biol,40(2):13-15.? [劉鳳云,2005. 沙棘油的藥理研究

    [J]. 生物學(xué)通報,40(2):13-15.]

    L HP,ZHU Q,2015. General situation of research on oxidative damage and genetic toxicity detection [J]. J Anhui Agric Sci,43(14):7-9.? [呂惠萍,朱琪,2015. 氧化損傷與遺傳毒性的檢測研究概況 [J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),43(14): 7-9.]

    WANG B,2019. Effect of sea buckthorn fruit oil on alcohol-induced micronucleus rate and liver damage in mouse bone marrow cells [J]. Shaanxi J Agric Sci,65(5):39-41.? [王波,2019. 沙棘果油對酒精引起小鼠骨髓細(xì)胞微核率和肝臟損傷的影響 [J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),65(5):39-41.]

    WEI AQ,2018. Study on inhibition mechanism of natural antioxidants on nitrogen/oxygen free radical damage [D]. Beijing:Beijing University of Technology:3.? [魏安琪,2018. 天然抗氧化劑對氮/氧自由基損傷抑制機制的研究 [D]. 北京:北京工業(yè)大學(xué):3.]

    WU Y,WANG BW,LIU QJ,et al.,2000. Effect of sea buckthorn oil on microcirculation [J]. Pharmacol Clin Chin Mat Med,16(6):18-19.? [吳英,王秉文,劉秋娟,等,

    2000. 沙棘油對微循環(huán)的影響 [J].中藥藥理與臨床,16(6):18-19.]

    ZHANG W,ZHANG J,LI P,et al.,2017. Recent advances in fluorescent probes for imaging of superoxide anion radical [J]. Chin J Anal Chem,45(12):1838-1844.? [張雯,張嬌,李平,等,2017.熒光/化學(xué)發(fā)光探針成像檢測超氧陰離子自由基的研究進(jìn)展 [J]. 分析化學(xué),45(12):1838-1844.]

    ZHAO EL,XU F,YIN AP,et al.,2017. Fatty acid compositions and antioxidant activities of sea buckthorn pulp oil and sea buckthorn seed oil [J]. Chin Oils Fats,42 (2):120-123.? [趙二勞,徐芬,尹愛萍,等,2017. 沙棘果油與沙棘籽油脂肪酸組成及其抗氧化活性 [J]. 中國油脂,42(2):120-123.]

    (責(zé)任編輯 蔣巧媛)

    猜你喜歡
    抗氧化性
    茶多酚的抗氧化性及其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用
    湖南飼料(2021年3期)2021-07-28 07:06:06
    米胚多糖的組成及抗氧化性研究
    超聲輔助纖維素酶法提取玉米皮總多酚及其抗氧化性研究
    茶籽多糖抗氧化性及其對DNA氧化損傷的保護(hù)作用
    β-胡蘿卜素微乳液的體外抗氧化性初探
    中國果菜(2016年9期)2016-03-01 01:28:39
    藜麥葉片多酚最佳提取工藝及其抗氧化性研究
    耐鹽紫甘薯花色苷組分分析和抗氧化性研究
    涂膜結(jié)合冷藏對鮮切甘薯抗氧化性的影響
    玉米須總黃酮的抗氧化性研究
    綠咖啡豆提取物的抗氧化性研究
    一级毛片我不卡| 黄色 视频免费看| av在线播放精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品一国产av| 久久精品国产a三级三级三级| 女性被躁到高潮视频| 国产成人aa在线观看| 成人二区视频| 日韩电影二区| 美女高潮到喷水免费观看| 最近中文字幕2019免费版| 男女免费视频国产| 男人操女人黄网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 夫妻午夜视频| 好男人视频免费观看在线| 在现免费观看毛片| 久久久久久人妻| 美女中出高潮动态图| 亚洲精品一二三| 老司机影院毛片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日本vs欧美在线观看视频| av网站在线播放免费| 欧美另类一区| 亚洲综合精品二区| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产一区有黄有色的免费视频| 午夜福利一区二区在线看| 欧美在线黄色| 90打野战视频偷拍视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品免费大片| 精品少妇内射三级| 免费黄色在线免费观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 人妻一区二区av| 国产福利在线免费观看视频| 最新中文字幕久久久久| 一边亲一边摸免费视频| 午夜激情久久久久久久| 国产精品女同一区二区软件| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| av电影中文网址| 三级国产精品片| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲人成77777在线视频| 欧美精品一区二区大全| 国产成人免费观看mmmm| 天堂8中文在线网| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 波野结衣二区三区在线| 一级,二级,三级黄色视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 大码成人一级视频| 久久青草综合色| 欧美人与性动交α欧美软件| 一二三四在线观看免费中文在| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲综合色惰| 亚洲精品av麻豆狂野| 女性被躁到高潮视频| 午夜精品国产一区二区电影| 黄片小视频在线播放| 免费观看av网站的网址| 久久久久久伊人网av| 丰满迷人的少妇在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲av电影在线进入| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产视频首页在线观看| 午夜91福利影院| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久这里有精品视频免费| 午夜福利在线免费观看网站| 边亲边吃奶的免费视频| 一边亲一边摸免费视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 老熟女久久久| 看十八女毛片水多多多| 观看av在线不卡| 国产成人免费无遮挡视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 男女午夜视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 免费在线观看黄色视频的| 9色porny在线观看| 国产亚洲一区二区精品| 91成人精品电影| 国产在线视频一区二区| 亚洲av国产av综合av卡| av一本久久久久| 五月天丁香电影| 久久精品国产a三级三级三级| 夫妻性生交免费视频一级片| 日本wwww免费看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 人妻一区二区av| 青草久久国产| 久久久久久久久免费视频了| 少妇 在线观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲成国产人片在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产日韩欧美视频二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 男女无遮挡免费网站观看| a级毛片在线看网站| av免费在线看不卡| 好男人视频免费观看在线| 高清在线视频一区二区三区| videosex国产| 69精品国产乱码久久久| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 黄色 视频免费看| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲四区av| 国产野战对白在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av男天堂| 咕卡用的链子| 波多野结衣av一区二区av| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美人与性动交α欧美软件| 丝袜喷水一区| 天堂中文最新版在线下载| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 丝袜美足系列| 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品国产露脸久久av麻豆| 精品国产一区二区久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 三上悠亚av全集在线观看| 国产毛片在线视频| 亚洲精品视频女| 亚洲综合色网址| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品一区三区| 在线观看www视频免费| 久热这里只有精品99| 免费观看在线日韩| 午夜福利,免费看| 国产av精品麻豆| 久久久久久伊人网av| 一级毛片我不卡| 一区二区三区激情视频| 五月开心婷婷网| 日韩伦理黄色片| 91在线精品国自产拍蜜月| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲国产日韩一区二区| 久久久久久伊人网av| 色播在线永久视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 宅男免费午夜| 香蕉国产在线看| 久久午夜综合久久蜜桃| 热re99久久精品国产66热6| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 老司机影院毛片| 久久这里只有精品19| av在线播放精品| 久热久热在线精品观看| 99re6热这里在线精品视频| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产 精品1| 成年动漫av网址| 在线看a的网站| 日韩三级伦理在线观看| 欧美日韩精品网址| 少妇被粗大的猛进出69影院| 永久免费av网站大全| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 一级毛片我不卡| 秋霞在线观看毛片| 国产成人精品福利久久| 国产麻豆69| 嫩草影院入口| 久久精品国产a三级三级三级| 看十八女毛片水多多多| 一本色道久久久久久精品综合| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产av码专区亚洲av| 日日撸夜夜添| 久久久久精品性色| 国产毛片在线视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 女人精品久久久久毛片| av卡一久久| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美日韩综合久久久久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| 春色校园在线视频观看| 亚洲三级黄色毛片| 国产成人精品久久二区二区91 | 国产在线一区二区三区精| 十八禁网站网址无遮挡| 精品福利永久在线观看| www.熟女人妻精品国产| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 99re6热这里在线精品视频| 国产精品无大码| av在线播放精品| 欧美成人午夜免费资源| 久久国产精品大桥未久av| 精品久久久久久电影网| 亚洲国产精品成人久久小说| 在线天堂中文资源库| 亚洲国产av新网站| a级毛片黄视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 男人操女人黄网站| 热99国产精品久久久久久7| 精品人妻在线不人妻| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 在线观看国产h片| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲久久久国产精品| 99热国产这里只有精品6| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 日韩三级伦理在线观看| 99热全是精品| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 免费av中文字幕在线| 九色亚洲精品在线播放| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产成人欧美| 国产高清不卡午夜福利| 国产男女内射视频| 蜜桃国产av成人99| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲四区av| 秋霞伦理黄片| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久97久久精品| 久久精品国产亚洲av天美| 寂寞人妻少妇视频99o| 男女国产视频网站| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲一码二码三码区别大吗| 天美传媒精品一区二区| av在线app专区| 大话2 男鬼变身卡| 精品一区在线观看国产| 纯流量卡能插随身wifi吗| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产精品三级大全| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产有黄有色有爽视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 波多野结衣av一区二区av| 成人毛片a级毛片在线播放| 男女高潮啪啪啪动态图| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲精品av麻豆狂野| tube8黄色片| 亚洲精品自拍成人| 国产av国产精品国产| 丁香六月天网| 久久久亚洲精品成人影院| 国产成人av激情在线播放| 国产乱来视频区| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 日韩一本色道免费dvd| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 新久久久久国产一级毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 中文字幕av电影在线播放| 久久精品国产a三级三级三级| 午夜福利网站1000一区二区三区| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久精品国产亚洲av涩爱| 一区二区av电影网| 欧美少妇被猛烈插入视频| 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲四区av| 亚洲精品美女久久av网站| 久久人妻熟女aⅴ| 国产男人的电影天堂91| 黄色毛片三级朝国网站| 一级爰片在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品av麻豆狂野| 婷婷色av中文字幕| 黄频高清免费视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 在现免费观看毛片| 伦理电影大哥的女人| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 视频在线观看一区二区三区| videossex国产| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产成人免费观看mmmm| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品三级大全| 自线自在国产av| 精品人妻偷拍中文字幕| 99久久综合免费| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲国产av影院在线观看| 丝袜脚勾引网站| 18+在线观看网站| 熟女电影av网| 91久久精品国产一区二区三区| 九九爱精品视频在线观看| 黄频高清免费视频| 成人影院久久| 不卡av一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 色94色欧美一区二区| 色吧在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 一区二区三区激情视频| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久久久网色| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲综合色网址| 999久久久国产精品视频| 麻豆av在线久日| 在线观看免费高清a一片| 国产日韩欧美亚洲二区| 99热国产这里只有精品6| 精品一区在线观看国产| 成人国语在线视频| 不卡av一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 精品一区二区免费观看| 在线 av 中文字幕| 国产精品.久久久| 成人影院久久| 久久这里有精品视频免费| 国产成人91sexporn| 亚洲五月色婷婷综合| 老熟女久久久| 久久鲁丝午夜福利片| 日韩av免费高清视频| 一级片'在线观看视频| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品免费视频内射| 欧美精品高潮呻吟av久久| 青春草视频在线免费观看| 2022亚洲国产成人精品| 老司机亚洲免费影院| 亚洲第一青青草原| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久精品区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| 欧美精品国产亚洲| 中文字幕制服av| 中文天堂在线官网| 激情五月婷婷亚洲| 国产乱人偷精品视频| 国产欧美亚洲国产| 18在线观看网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 韩国精品一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久精品国产综合久久久| 人妻一区二区av| 黄色怎么调成土黄色| 日韩视频在线欧美| 观看av在线不卡| 999久久久国产精品视频| 电影成人av| 日本av手机在线免费观看| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 欧美成人午夜精品| 一级爰片在线观看| 成人国语在线视频| 久久青草综合色| 美女中出高潮动态图| 国产免费福利视频在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 性色avwww在线观看| 精品人妻在线不人妻| 欧美日韩成人在线一区二区| 综合色丁香网| 亚洲人成网站在线观看播放| 高清av免费在线| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产极品天堂在线| 2021少妇久久久久久久久久久| 成年人免费黄色播放视频| 多毛熟女@视频| 十八禁高潮呻吟视频| 久久精品亚洲av国产电影网| a级毛片黄视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产成人精品久久久久久| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久精品国产亚洲av涩爱| 夫妻午夜视频| 国产日韩欧美在线精品| 久久这里只有精品19| 中文字幕制服av| 香蕉国产在线看| 午夜福利影视在线免费观看| 成人二区视频| 亚洲人成电影观看| 久久ye,这里只有精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产一区有黄有色的免费视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 午夜福利影视在线免费观看| 黄色配什么色好看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 黄片无遮挡物在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 97在线人人人人妻| 国产一区二区在线观看av| av天堂久久9| 国产片特级美女逼逼视频| 大陆偷拍与自拍| 观看美女的网站| 精品久久久精品久久久| 久久久久国产网址| 人人妻人人澡人人看| 日本vs欧美在线观看视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产淫语在线视频| 中文天堂在线官网| 国产精品99久久99久久久不卡 | 免费少妇av软件| 国产成人精品福利久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 五月伊人婷婷丁香| 97精品久久久久久久久久精品| 免费高清在线观看日韩| 久久精品国产综合久久久| videosex国产| 亚洲情色 制服丝袜| 日韩一区二区视频免费看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 成年人午夜在线观看视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日本午夜av视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 边亲边吃奶的免费视频| 国产在视频线精品| 国产熟女欧美一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产成人av激情在线播放| 亚洲国产精品999| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲精品日本国产第一区| 国产不卡av网站在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 久久午夜综合久久蜜桃| 老女人水多毛片| 视频在线观看一区二区三区| 最近手机中文字幕大全| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲四区av| 国产在线免费精品| 亚洲精品乱久久久久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产熟女欧美一区二区| av不卡在线播放| 人体艺术视频欧美日本| 一级片'在线观看视频| 午夜福利乱码中文字幕| 国产成人精品在线电影| 高清不卡的av网站| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲精品av麻豆狂野| 岛国毛片在线播放| 国产成人精品婷婷| 午夜福利视频在线观看免费| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 自线自在国产av| 欧美激情 高清一区二区三区| 波多野结衣一区麻豆| av国产精品久久久久影院| 欧美成人午夜免费资源| 又大又黄又爽视频免费| 国产在线一区二区三区精| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲精品国产av成人精品| av在线老鸭窝| 国产极品天堂在线| 最近的中文字幕免费完整| 边亲边吃奶的免费视频| 人妻系列 视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 欧美成人午夜精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 免费黄网站久久成人精品| 国产 一区精品| 妹子高潮喷水视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 男人舔女人的私密视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 免费黄频网站在线观看国产| 国产97色在线日韩免费| 亚洲,欧美精品.| www.熟女人妻精品国产| 久久国产精品大桥未久av| 咕卡用的链子| 成人免费观看视频高清| 久久久久网色| 国产成人精品无人区| 欧美 日韩 精品 国产| 波多野结衣一区麻豆| 美女午夜性视频免费| 亚洲成国产人片在线观看| 伦精品一区二区三区| 久久青草综合色| 亚洲欧美成人精品一区二区| 看免费av毛片| 国产有黄有色有爽视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 男女免费视频国产| 三上悠亚av全集在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久狼人影院| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 免费大片黄手机在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 久久这里有精品视频免费| 午夜日韩欧美国产| 国产精品.久久久| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 超色免费av| 国产日韩欧美在线精品| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 免费观看无遮挡的男女| 考比视频在线观看| 看免费av毛片| 宅男免费午夜| 观看美女的网站| 人妻 亚洲 视频| 亚洲国产欧美在线一区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 免费观看性生交大片5| 久久婷婷青草| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品亚洲成a人片在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 在线精品无人区一区二区三| 久久青草综合色| a级毛片在线看网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品乱久久久久久| 精品国产一区二区三区四区第35| 男男h啪啪无遮挡| 国产av精品麻豆| 国产成人欧美| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品人妻在线不人妻| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲精品国产av成人精品| 国产成人精品久久久久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 成人国产av品久久久| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲视频免费观看视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲国产日韩一区二区| 久久韩国三级中文字幕| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲精品在线美女| www.精华液| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 91成人精品电影| av网站在线播放免费| 欧美日韩综合久久久久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产国语露脸激情在线看| 日日啪夜夜爽| 啦啦啦中文免费视频观看日本|