營養(yǎng)肉湯中不同因素影響下金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)模型的構(gòu)建

李金春等

摘 要：采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，研究不同溫度、pH值和水分活度對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)規(guī)律的影響，并構(gòu)建金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的一級(jí)生長(zhǎng)模型和最大比生長(zhǎng)速率、延滯期的二級(jí)生長(zhǎng)模型，其中一級(jí)模型通過Baranyi模型來擬合；二級(jí)模型包括單因素二級(jí)模型和多因素二級(jí)模型，分別通過B?lehrádek平方根模型和二次多項(xiàng)式回歸模型來擬合。結(jié)果表明：金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速率隨著溫度、pH值和水分活度的增加而增加，而延滯期隨著溫度、pH值和水分活度的增加而降低，并且溫度與pH值，溫度與水分活度以及pH值與水分活度之間存在明顯的交互作用。一級(jí)Baranyi模型、二級(jí)平方根模型以及多項(xiàng)式回歸模型擬合性較好（R2>0.85）。通過數(shù)學(xué)檢驗(yàn)參數(shù)精確因子（Af）、偏差因子（Bf）、均方根誤差（RMSE）對(duì)模型進(jìn)行數(shù)學(xué)檢驗(yàn)，表明構(gòu)建的一級(jí)、二級(jí)模型適用性、可靠性和擬合性均在可接受范圍內(nèi)，在建模設(shè)定的范圍內(nèi)能預(yù)測(cè)金黃色葡萄球菌建模范圍內(nèi)的延滯期和最大比生長(zhǎng)速率。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；營養(yǎng)肉湯；預(yù)測(cè)微生物學(xué)；生長(zhǎng)模型

Abstract： Effects of temperature， pH， and water activity （aw） on the growth of Staphylococcus aureus in nutrient broth medium were studied， respectively， and the first-order kinetics models of bacterial count （CFU） and the second-order kinetics models of maximum specific growth rate （μmax） and lag time were built subsequently. Results showed that increasing temperature， pH and aw could increase the μmax but decrease the value of lag time. Colony-forming units （CFU） of S. aureus were modeled as a function of T， pH and aw， which revealed a good relationship as evaluated by the Baranyi model. The single-variable second-order models were evaluated by B?lehrádek square-root-type model with correlation coefficients more than 0.85. The multi-variable second-order models， namely polynomial logistic regression equations， were fitted using a stepwise method with correlation coefficient more than 0.85. Then， the goodness of fit of the established models was evaluated by accuracy factor （Af）， bias factor （Bf） and root mean square error （RMSE）. It was found that their applicability， reliability and goodness of fit were within acceptable ranges. The first-order and second-order models provide a useful and accurate approach to predicting the growth of S. aureus within certain limits.

Key words： Staphylococcus aureus； nutrient broth medium； predictive microbiology； growth model

中圖分類號(hào)：TS251.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2015）03-0005-06

doi： 10.7506/rlyj1001-8123-201503002

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是一種革蘭氏染色陽性球型細(xì)菌，隸屬于葡萄球菌屬，除了常引起皮膚的化膿性炎癥外，其產(chǎn)生的腸毒素可導(dǎo)致食物中毒，是近年來危害食品安全的食源性致病菌[1]。近年來，國內(nèi)外關(guān)于致病菌的生長(zhǎng)模型、致死模型均有大量報(bào)道，致病菌主要包括沙門氏菌[2-3]、單增李斯特菌[4-6]、大腸桿菌O157∶H7[7-9]、金黃色葡萄球菌等[10-11]，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的研究多集中于單一因素的一級(jí)和二級(jí)生長(zhǎng)模型，多因素生長(zhǎng)模型研究的相對(duì)較少[12-14]。利用傳統(tǒng)微生物方法對(duì)食品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。通過微生物預(yù)測(cè)技術(shù)對(duì)食品中的致病菌建立不同條件下的模型，然后根據(jù)模型對(duì)致病菌的生長(zhǎng)和死亡規(guī)律進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，可提高效率、節(jié)約人力物力。預(yù)測(cè)微生物學(xué)[15-16]是一門運(yùn)用數(shù)學(xué)模型來描述和預(yù)測(cè)給定條件下食品中微生物生長(zhǎng)、衰亡規(guī)律的新興技術(shù)，目前已在食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和食品安全控制領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

Whiting等[17]將模型劃分3 個(gè)層次，一級(jí)模型描述的是微生物的生物量隨著時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系，可得到延滯期、最大比生長(zhǎng)速率以及最大菌落數(shù)，主要包括Baranyi、Logistic、Modified-Gompertz等模型[18]；二級(jí)模型描述的是一級(jí)模型中各參數(shù)（如最大比生長(zhǎng)速率、延滯期等）與條件因素（如溫度、pH值、水分活度等）之間的函數(shù)關(guān)系，上世紀(jì)八九十年代由B?lehrádek開創(chuàng)、Ratkowsky等改進(jìn)的平方根模型在擬合不同溫度或pH值下微生物的生長(zhǎng)參數(shù)（最大比生長(zhǎng)速率和遲滯期）是其中的典型代表[19]。三級(jí)模型是以數(shù)學(xué)模型和參數(shù)數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)編寫的計(jì)算機(jī)程序或軟件，主要包括PMP、FSP、ComBase等。

本實(shí)驗(yàn)通過研究營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌在pH值、水分活度（aw）和溫度（T）3個(gè)因素影響下的生長(zhǎng)規(guī)律，建立金黃色葡萄球菌菌落數(shù)的一級(jí)生長(zhǎng)模型和最大比生長(zhǎng)速率（μmax）、延滯期（Lag）的單因素、多因素二級(jí)生長(zhǎng)模型，通過模型可以獲得金黃色葡萄球菌在建模范圍內(nèi)的μmax和Lag，從而預(yù)測(cè)其生長(zhǎng)情況，為完善致病微生物預(yù)測(cè)技術(shù)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 27217），由北京市食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)三站提供。菌種采用磁珠法在―80 ℃低溫保藏。

營養(yǎng)肉湯（NB）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、平板

計(jì)數(shù)瓊脂（PCA） 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；乳酸、氯化鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；菌種保藏試劑盒 友康恒業(yè)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BT224S型分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；F1-45 Toyo型恒溫培養(yǎng)箱 東洋化學(xué)產(chǎn)業(yè)有限公司；GI54DWS型全自動(dòng)高壓滅菌器 美國致微（廈門）儀器有限公司；ESCO型二級(jí)生物安全柜 上海

金鵬分析儀器有限公司；FSP-625型勻漿機(jī) 日本Nihonseiki Kaisha公司；PHT-810型pH測(cè)量?jī)x 廣州市毅佰科學(xué)儀器有限公司；Labmaster型水分活度儀 瑞士Novasina公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化、接種與計(jì)數(shù)

菌種活化：將菌種接種到10 mL TSB增菌液中進(jìn)行活化，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，活化至對(duì)數(shù)初期

（約105 CFU/mL）。擴(kuò)大培養(yǎng)：按0.5%的比例將活化好的菌種接種到100 mL TSB增菌液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，30 ℃靜態(tài)過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期（約109 CFU/mL），制得菌種原液。按照GB4789.10—2010《食品微生物檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[20]進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。均做3 個(gè)平行，重復(fù)2 次。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

金黃色葡萄球菌的最適培養(yǎng)條件為溫度37 ℃、pH6.0、aw 0.98。選擇初始pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、aw（0.91、0.93、0.95、0.97、0.99）和培養(yǎng)溫度（15、20、25、30、37 ℃）3 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各個(gè)因素對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響。其中水分活度通過NaCl溶液來調(diào)節(jié)[21]，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中aw與NaCl溶液質(zhì)量濃度符合二次函數(shù)關(guān)系：aw=―1.203x2―0.3484x+0.9872，式中：x為NaCl質(zhì)量濃度/（g/mL）；pH值通過乳酸進(jìn)行調(diào)節(jié)；根據(jù)菌種原液的濃度取適量接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，使初始接種量在103 CFU/mL左右，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，在0、4、6、8、10、12、24 h時(shí)取樣檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌落數(shù)（CFU/mL）。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)來研究pH值、aw和溫度對(duì)金黃色葡萄球菌的綜合生長(zhǎng)作用。正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。培養(yǎng)時(shí)間為24 h，在0、4、6、8、10、12、24 h時(shí)取樣檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌落數(shù)（CFU/mL）。

1.4 生長(zhǎng)模型

1.4.1 一級(jí)Baranyi生長(zhǎng)模型

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Origin 8.0軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理、一級(jí)生長(zhǎng)模型的構(gòu)建以及柱形圖繪制；用DPS 7.05軟件對(duì)二級(jí)生長(zhǎng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和模型的構(gòu)建；用PASW Statistics 18.0軟件進(jìn)行pH值、aw和溫度對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)作用的顯著性分析；通過Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)以及模型評(píng)價(jià)因子Af、Bf、RMSE和R2數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH值對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，pH值對(duì)金黃色葡萄球菌的μmax影響較大，pH值在4.0～6.0范圍內(nèi)金黃色葡萄球菌的μmax隨著pH值的增加而顯著增加（P<0.05）。而當(dāng)pH值大于6.0時(shí)，金黃色葡萄球菌的μmax趨于平穩(wěn)。Stewart等[26]研究了金黃色葡萄球菌的在不同pH值條件下的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)pH值在3.0～7.0范圍內(nèi)隨著pH值的增加，μmax先增加后趨于穩(wěn)定，與本研究相一致。金黃色葡萄球菌的Lag值隨pH值的增高而降低，隨著pH值的增高，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用減弱，從而使Lag值逐漸減小。

2.1.2 aw對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，在15g/100mL NaCl溶液中都可以生長(zhǎng)[27]。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的aw通過NaCl溶液來調(diào)節(jié)，NaCl溶液質(zhì)量濃度越高，aw越低。金黃色葡萄球菌最適生長(zhǎng)aw為0.99。由圖2可知，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中aw在0.91～0.97范圍內(nèi)，金黃色葡萄球菌μmax隨著aw的增加而顯著增加（P<0.05）；aw大于0.97時(shí)，μmax趨于穩(wěn)定。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中aw為0.91（NaCl溶液約為0.15 g/mL）時(shí)，金黃色葡萄球菌依然能夠生長(zhǎng)，說明金黃色葡萄球菌能夠在低aw條件下生長(zhǎng)。金黃色葡萄球菌的Lag值隨aw的增高而降低。

2.1.3 溫度對(duì)對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響

金黃色葡萄球菌的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃。溫度低于最適溫度時(shí)，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)受到抑制。由圖3可知，在15～37 ℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的增加金黃色葡萄球菌μmax顯著增加（P<0.05）。金黃色葡萄球菌的Lag值隨溫度的增高而降低，隨著溫度的增高，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用減弱，從而使Lag逐漸減小。

2.2 正交試驗(yàn)

由表2可知，各因素不同水平的組合下，金黃色葡萄球菌的μmax均不相同，μmax的變化范圍從0.0604 h-1到0.1957 h-1，分布比較均勻，有利于二級(jí)生長(zhǎng)模型的建立。μmax最大值出現(xiàn)在第3組試驗(yàn)，當(dāng)培養(yǎng)溫度25 ℃、aw 0.99、pH 6時(shí)，μmax為0.1957 h-1。而最小μmax值出現(xiàn)在第4組試驗(yàn)，為0.0404 h-1。金黃色葡萄球菌的Lag值在各因素不同水平的組合下分布比較均勻，亦有利于二級(jí)生長(zhǎng)模型的建立。

2.3 一級(jí)Baranyi生長(zhǎng)模型

一級(jí)模型描述的是微生物的生物量隨著時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系，在此基礎(chǔ)上可進(jìn)一步計(jì)算出遲滯期、生長(zhǎng)速率以及最大菌數(shù)，Baranyi模型是一級(jí)模型中的典型代表[28]；Baranyi模型屬于機(jī)理模型，是根據(jù)微生物的生長(zhǎng)代謝機(jī)理推導(dǎo)出的動(dòng)力學(xué)方程，該模型能夠很好處理延滯生長(zhǎng)期，能夠用來擬合完整的“S”形曲線，不僅能描述生長(zhǎng)曲線也能描述致死曲線，而且也能用于波動(dòng)的環(huán)境。pH值、aw與溫度對(duì)應(yīng)的Baranyi模型各參數(shù)如表3所示，其中決定系數(shù)R2均在0.98左右，說明Baranyi模型能夠分別擬合不同pH值、aw與溫度條件下金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)規(guī)律。

單因素-二級(jí)生長(zhǎng)模型得到的是單一因素與金黃色葡萄球菌的μmax、Lag之間的定量關(guān)系。溫度、pH值和aw與μmax、Lag之間的定量關(guān)系均符合平方根模型。擬合得到模型方程如表4所示。

2.4.2 多因素多項(xiàng)式回歸模型

多因素-二級(jí)生長(zhǎng)模型描述的是溫度、pH值以及aw

數(shù)學(xué)模型通常用Af、Bf、RMSE和決定系數(shù)（R2）4 個(gè)參數(shù)來評(píng)判擬合度的優(yōu)劣。參數(shù)Af和Bf用于衡量模型的有效性，Af值越小表明模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值越接近，模型越精確；而Bf在0.9～1.05范圍內(nèi)的模型被認(rèn)為是“好的預(yù)測(cè)模型”，在0.7～0.9或1.06～1.15范圍的被認(rèn)為“可接受的模型”，在其他范圍內(nèi)則被認(rèn)為是“不可接受的模型[29]。決定系數(shù)R2和RMSE表示模型的可靠度，R2越接近于1，RMSE越小，擬合度越高，模型越可靠。由表5可知，一級(jí)生長(zhǎng)模型：pH-Baranyi、aw-Baranyi以及T-Baranyi模型的R2均大于0.93，Bf值介于0.9～1.05之間，說明構(gòu)建的一級(jí)模型擬合度較高，模型比較可靠。由表6可知，二級(jí)生長(zhǎng)模型的R2均大于0.85，Bf值除aw-Lag平方根模型（式（11））和pH值、aw、T-Lag多項(xiàng)式回歸模型（式（15））外，其他Bf值均介于0.9～1.05之間，說明構(gòu)建的二級(jí)模型擬合度較高，模型較可靠，可用來預(yù)測(cè)營養(yǎng)肉湯中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)規(guī)律。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速率隨著溫度、pH值和水分活度的增加而增加，而延滯期隨著溫度、pH值和水分活度的增加而降低，并且溫度與pH值，溫度與水分活度以及pH值與水分活度之間存在明顯的交互作用。一級(jí)Baranyi模型、二級(jí)平方根模型以及多項(xiàng)式回歸模型擬合性較好（R2>0.85），在建模設(shè)定的范圍內(nèi)能預(yù)測(cè)金黃色葡萄球菌建模范圍內(nèi)的延滯期和最大比生長(zhǎng)速率。構(gòu)建模型選取的溫度、pH值和水分活度3 個(gè)因素與薩拉米香腸加工過程中發(fā)酵階段的一些重要環(huán)境因素和柵欄因子存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，而各個(gè)模型均能夠很好地預(yù)測(cè)金黃色葡萄球菌在營養(yǎng)肉湯中的最大比生長(zhǎng)速率和延滯期，這為評(píng)估薩拉米香腸生產(chǎn)體系風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)和制定產(chǎn)品質(zhì)量安全控制方案提供重要參考依據(jù)。

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