金黃色葡萄球菌在蔬菜中生長(zhǎng)狀況分析

劉曉慧　郭鳳柳　賈月梅等

摘要： 菠菜是生活中常見的蔬菜，但金黃色葡萄球菌對(duì)其污染嚴(yán)重，可引起危及生命的敗血癥及嚴(yán)重的轉(zhuǎn)移性感染，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒素更是穩(wěn)定性極高，對(duì)人體健康造成了危害；因此，為了保證人們的食物安全，須從源頭上控制金黃色葡萄球菌對(duì)菠菜的污染。參照國(guó)際上風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的經(jīng)驗(yàn)，采用蒙特卡洛法建立了菠菜中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型：在10 ℃時(shí)建立了Linear模型，15、20、25 ℃條件下建立了Gompertz 模型，并且對(duì)其二級(jí)模型也進(jìn)行了分析。研究中還從危害特征描述和暴露評(píng)估等方面客觀地對(duì)菠菜中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行了分析，以期為控制金黃色葡萄球菌對(duì)人體的危害提供科學(xué)的理論及預(yù)測(cè)方法。

關(guān)鍵詞： 菠菜；金黃色葡萄球菌；生長(zhǎng)狀況分析

中圖分類號(hào)： TS201 3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）08-0304-04

隨著食品貿(mào)易的日益全球化，食源性疾病和食品污染是一個(gè)巨大的、不斷擴(kuò)大的世界性公共衛(wèi)生問題。金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，SA）廣泛分布于自然界，是引起食品污染和細(xì)菌性食物中毒中極為重要的細(xì)菌之一，是導(dǎo)致食物污染和中毒的重要致病菌，也是造成人和動(dòng)物感染的主要病原菌之一 [1]。葡萄球菌腸毒素（Staphyloccocus aureus entertoxine，SE）導(dǎo)致的中毒現(xiàn)象已成為世界性的食品衛(wèi)生問題。由此引起的食物中毒在美國(guó)占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，在加拿大占45%，而在我國(guó)占50% [2-3]。2013年于潔報(bào)道了一起在山東地區(qū)由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件 [4]。近十年來(lái)國(guó)外發(fā)達(dá)國(guó)家利用其檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)建立嚴(yán)格的技術(shù)壁壘，其中包含各類微生物的限量指標(biāo)。而我國(guó)菠菜產(chǎn)品具有品種齊全、質(zhì)量好、價(jià)格較低的優(yōu)勢(shì)，每年速凍菠菜出口到日本2萬(wàn)t以上，還部分出口到俄羅斯、歐盟等國(guó)家和地區(qū)，加工出口前景廣闊。菠菜的生產(chǎn)過程包括菠菜種植、原料選擇、運(yùn)輸、貯藏、工廠加工等環(huán)節(jié)，每個(gè)環(huán)節(jié)都可能受到金黃色葡萄球菌的污染。應(yīng)用食品安全微生物風(fēng)險(xiǎn)分析手段對(duì)菠菜生產(chǎn)加工過程中感染金黃色葡萄球菌進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析，將有利于更好地對(duì)菠菜進(jìn)行安全管理。本研究應(yīng)用食品安全微生物風(fēng)險(xiǎn)分析手段對(duì)菠菜中金黃色葡萄球菌從危害識(shí)別、流行病例、暴露評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別等方面進(jìn)行分析，為菠菜中的金黃色葡萄球菌風(fēng)險(xiǎn)管理提供依據(jù)。

1 危害識(shí)別

1992—2010年對(duì)13個(gè)監(jiān)測(cè)地區(qū)食源性疾病暴發(fā)上報(bào)資料進(jìn)行回顧性分析，結(jié)果這十幾年間共上報(bào)9 692起食源性疾病暴發(fā)事件，涉及的患者人數(shù)達(dá)268 536人。微生物引起的食源性疾病暴發(fā)事件數(shù)和患者數(shù)最多，分別占41 5%和58 8%。微生物事件中，以副溶血性弧菌為主，其他依次為沙門氏菌、變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及其毒素。按事件發(fā)生數(shù)統(tǒng)計(jì)，家庭是食源性疾病暴發(fā)起數(shù)和死亡人數(shù)最多的地方，而集體食堂是患者數(shù)最多的地方，其中引起金黃色葡萄球菌中毒的事件尤其多，這可能與中國(guó)人的飲食習(xí)慣有關(guān)，人們?cè)诩依镉貌偷臅r(shí)間多，而在集體食堂發(fā)生一次中毒事件就會(huì)牽扯到很多人。在金黃色葡萄球菌中毒事件中，由于新鮮果蔬營(yíng)養(yǎng)成分豐富，富于微生物生長(zhǎng)，而人們?cè)谑秤眠^程中沒有洗干凈直接食用或者烹飪不完全都會(huì)受到金黃色葡萄球菌及其毒素的危害，甚至發(fā)生中毒。

金黃色葡萄球菌（S aureus）廣泛存在于自然界、空氣、水和土壤中，是革蘭氏陽(yáng)性球菌中的典型代表。金黃色葡萄球菌在普通培養(yǎng)基上就能生長(zhǎng)良好，平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑0 5～1 0 mm，顯微鏡下排列成葡萄串狀。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。在20%CO2環(huán)境中，有利于毒素產(chǎn)生。其最低生長(zhǎng)溫度為7 ℃，最適生長(zhǎng)溫度為35～37 ℃，最高生長(zhǎng)溫度為50 ℃，產(chǎn)毒溫度為10～48 ℃，最適為40～45 ℃，最適生長(zhǎng)pH值為7 4～7 6。在攝入生長(zhǎng)有S aureus 的食物1～6 h后會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、不同程度的腹部痛性痙攣和腹瀉的癥狀 [5]。S aureus產(chǎn)生的腸毒素還可以引起腸胃炎，因此S aureus被列為世界上引起腸胃炎的禍?zhǔn)字?[6]。

2 危害特征描述

金黃色葡萄球菌是在人類化膿感染中常見的病原菌，有30%～50%的菌株可以產(chǎn)生腸毒素和外毒素，可引起化膿感染、腸炎、肺炎、心包炎，甚至膿毒癥、敗血癥。如果腸毒素進(jìn)入人體，可引起急性胃腸炎等，而且使人體對(duì)腸毒素更敏感。金黃色葡萄球菌的致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶。

金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生問題，我國(guó)每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。例如，2004年河北省石家莊市某大學(xué)發(fā)生一起食物中毒事件，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床診斷和病原學(xué)鑒定，證實(shí)為一起由金黃色葡萄球菌和變形桿菌引起的食物中毒事件；2005年4月浙江省寧波市某校學(xué)生在學(xué)校小賣部就餐，發(fā)生一起食物中毒事件，共4名學(xué)生發(fā)生食物中毒，經(jīng)證實(shí)為一起產(chǎn)A型腸毒素金黃色葡萄球菌引起的食物中毒事件；2009年9月廣西柳州地區(qū)民族高中部分師生及周邊居民50多人發(fā)生食物中毒事件，“罪魁禍?zhǔn)住币呀?jīng)確定，致病菌為金黃色葡萄球菌；2011年5月8日寧夏永寧縣一場(chǎng)婚宴上數(shù)十名群眾先后出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀，疑似食物中毒，經(jīng)鑒定引起這次中毒事件的為紐波特沙門氏菌和金黃色葡萄球菌；2012年3月江蘇省江陰市某中學(xué)食堂發(fā)生一起240人細(xì)菌性食物中毒事件，經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查分析和實(shí)驗(yàn)室病原菌檢驗(yàn)，并結(jié)合患者臨床癥狀，證實(shí)這是一起由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒事件；2013年9月26日江蘇省蘇州市食品安全辦公室對(duì)市區(qū)市場(chǎng)蔬菜、肉及制品、乳制品、蛋及蛋制品、大米、水果、水產(chǎn)品、熟食鹵菜等33大類進(jìn)行抽檢，在盒飯、熟食鹵菜中檢出金黃色葡萄球菌。

3 暴露評(píng)估

3 1 在種植的環(huán)境下暴露

（1）菠菜種植地以及周邊環(huán)境的污染是引起菠菜種植過程中感染金黃色葡萄球菌的主要原因。環(huán)境的污染主要是指肥料和水源的污染。金黃色葡萄球菌通過污染施肥用的糞便或灌溉用水間接感染菠菜。（2）種植人員患局部化膿性感染（如疥瘡、手指化膿等）、上呼吸道感染（如鼻竇炎、化膿性肺炎、口腔疾病等）等疾病，卻不加注意衛(wèi)生，造成間接感染。（3）菠菜采摘人員在上完廁所后未洗手就去采摘菠菜、雨水將排泄物從飼養(yǎng)動(dòng)物的農(nóng)場(chǎng)沖到菠菜種植地里等均為金黃色葡萄球菌的繁殖提供了條件。

3 2 在流通過程中的暴露

菠菜在流通過程中主要通過2種渠道進(jìn)入到消費(fèi)者手中：（1）菠菜在流通過程中作為原料，從種植區(qū)運(yùn)送到蔬菜產(chǎn)品加工廠后，沒有立刻進(jìn)行加工，也沒有放入冷庫(kù)低溫冷藏，造成金黃色葡萄球菌繁殖；在工廠中的加工過程是決定菠菜產(chǎn)品質(zhì)量和安全的重要環(huán)節(jié)，工廠內(nèi)部的各環(huán)節(jié)人員健康狀況、環(huán)境衛(wèi)生情況、工藝控制、交叉污染情況等都容易造成菠菜產(chǎn)品受金黃色葡萄球菌的污染；在運(yùn)輸和銷售過程中包裝不嚴(yán)、運(yùn)輸和銷售人員自身帶菌、運(yùn)輸車輛和用具被金黃色葡萄球菌污染等均可間接污染蔬菜產(chǎn)品，產(chǎn)生腸毒素，引起食物中毒；在餐館、路邊小吃攤等環(huán)境衛(wèi)生條件差的地方就餐，廚師等接觸到菠菜的人員在烹調(diào)菠菜前，未對(duì)手和刀、砧板等用具進(jìn)行消毒并且制備食物時(shí)生熟食品未分開加工，生熟用具也未分開使用；菠菜在烹飪前清洗不干凈或者焯過菠菜的水又作為飲用或烹飪用水，造成金黃色葡萄球菌污染。（2）從種植地采摘的新鮮菠菜未進(jìn)行任何加工，直接販賣到消費(fèi)者手中。消費(fèi)者在烹飪菠菜前，手、菠菜和廚房用具未進(jìn)行消毒，菠菜在烹飪過程中加熱不完全，手又接觸餐具等造成廚房與就餐區(qū)域被金黃色葡萄球菌污染。

圖1展示了從菠菜生長(zhǎng)到最后食用可能會(huì)感染S aureu的過程：原料菠菜中的濃度→加工過程中的變化→貯藏過程中的變化→消費(fèi)的劑量→消費(fèi)時(shí)攝入的劑量。

如表1所示，通過對(duì)河北省保定市及周邊地區(qū)的菠菜種植產(chǎn)地、生產(chǎn)加工企業(yè)以及市場(chǎng)、超市等場(chǎng)所采集的325份菠菜樣品，按照國(guó)標(biāo)檢驗(yàn)方法對(duì)325份菠菜樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測(cè)，結(jié)果檢出率達(dá)16 3%；同時(shí)利用mini VIDAS檢測(cè)儀對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行腸毒素的檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性率為56 6%。 鑒于該菌的廣泛存在及傳播可以對(duì)菠菜造成污染，因此，將金黃色葡萄球菌確定為菠菜中的特征性致病菌對(duì)其進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究。

3 3 采用蒙特卡洛法建立菠菜中金黃色葡萄球菌的預(yù)測(cè)模型

稱取200 g經(jīng)致病菌檢測(cè)結(jié)果為陰性的新鮮菠菜分別置于滅菌大燒杯中，接種菌數(shù)為103～104 CFU/mL 的S aureu菌懸液5 mL，充分混合，用滅菌的紗布封口，注意所有的操作在生物安全柜中進(jìn)行。將盛有樣品的燒杯分別置于4、10、15、20、25 ℃恒溫儲(chǔ)藏，4 ℃條件下每隔24 h檢測(cè)1次S aureu的生長(zhǎng)情況；10、15、20 ℃條件下每隔12 h檢測(cè)1次，25 ℃條件下每隔6 h檢測(cè)1次，每條生長(zhǎng)曲線至少檢測(cè)10個(gè)點(diǎn)以上。每個(gè)溫度條件下的樣品均做2組平行。

參考GB 4789 10—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》 [7]的方法，采用Baird-Parker平板和3M金黃色葡萄球菌快速測(cè)試片分別對(duì)在菠菜上生長(zhǎng)一定時(shí)間的金黃色葡萄球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。并用SN/T 1869—2007《食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法PCR法》 [8]中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法代替生化鑒定試驗(yàn)中的血漿凝固酶試驗(yàn)。

利用蒙特卡洛法將測(cè)定的生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)分別擬合 Gompertz 方程、Logistic 方程、Richards方程和Linear方程建立生長(zhǎng)模型。通過對(duì)Gompertz、Logistic、Richards、Linear這4種模型的標(biāo)準(zhǔn)差s和相關(guān)系數(shù)r比較，確定最適模型；再由最適生長(zhǎng)模型計(jì)算出金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)參數(shù) [9-11]。

將模擬的4 種模型的標(biāo)準(zhǔn)差（s）和相關(guān)系數(shù)（r） 進(jìn)行比較，10 ℃時(shí)Linear模型的標(biāo)準(zhǔn)差最小、相關(guān)系數(shù)最大，擬合性也較其他3個(gè)模型好，這是因?yàn)樵诘蜏貤l件下微生物生長(zhǎng)緩慢。15、20、25 ℃條件下 Gompertz 模型的標(biāo)準(zhǔn)差最小、相關(guān)系數(shù)最大，擬合性也最好，其次是Logistic模型，而Linear模型的擬合性最差。由此說明，在溫度較低的情況下應(yīng)該選擇 Linear 模型進(jìn)行擬合。隨著溫度的升高，遲滯期（Lag）變短，最大生長(zhǎng)速率（μmax） 變大，因此加工企業(yè)可以通過這些生長(zhǎng)參數(shù)對(duì)整個(gè)加工流程的時(shí)間進(jìn)行控制，降低金黃色葡萄球菌對(duì)食品造成污染的概率。4 ℃時(shí)，金黃色葡萄球菌幾乎不生長(zhǎng)，不能進(jìn)行擬合。

Gompertz方程的數(shù)學(xué)描述為：

L（t）=A+Cexp{-exp[-B（t-M）]}。

式中：L（t）為菌數(shù)自然對(duì)數(shù)值（ln CFU/g）；A為初始菌數(shù)自然對(duì)數(shù)值（ln CFU/g）；C為細(xì)菌最大生長(zhǎng)量自然對(duì)數(shù)值（ln CFU/g）；M為細(xì)菌生長(zhǎng)率最大時(shí)對(duì)應(yīng)時(shí)間（h）；t為時(shí)間（h）；B為M時(shí)刻生長(zhǎng)率自然對(duì)數(shù)值[ln CFU/（g·h）]。

Linear方程的數(shù)學(xué)描述：

y=μmaxt 。

其中，t為時(shí)間（h）；μmax為微生物生長(zhǎng)的最大比生長(zhǎng)速率（h -1）。

通過最適生長(zhǎng)模型計(jì)算出金黃色葡萄球菌的遲滯期（M）、最大生長(zhǎng)速率（B）以及相對(duì)最大細(xì)菌濃度（A）。由表3可以看出，隨著貯藏溫度的升高，B逐漸增加，而M則逐漸減小。

對(duì)于二級(jí)模型的建立，這里采用二級(jí)響應(yīng)面方程（多項(xiàng)式[CM（25]方程），以自然對(duì)數(shù)的方式進(jìn)行結(jié)合。應(yīng)用二級(jí)響應(yīng)面方程，對(duì)一級(jí)模型中參數(shù)B和M的對(duì)數(shù)形式建立二級(jí)模型，形式如下（圖2、圖3）：

lnB=6 106+1 178x+1 780x2（r=0 999）；

lnM=2 990-4 403x+8 690x2（r=0 996）。

由圖2和圖3可以看出，隨著溫度的升高，一級(jí)模型中生長(zhǎng)速率逐漸增大，但是增長(zhǎng)的幅度慢慢減小；遲滯期M逐漸減小，證明達(dá)到最大生長(zhǎng)速率的時(shí)間逐漸縮短，降幅也逐漸變小。

4 風(fēng)險(xiǎn)特征描述

菠菜含有豐富的維生素A、維生素C及礦物質(zhì)，尤其維生素A、維生素C含量是所有蔬菜類之冠，人體造血物質(zhì)鐵的含量也比其他蔬菜多，對(duì)于胃腸障礙、便秘、痛風(fēng)、皮膚病、各種神經(jīng)疾病、貧血有特殊食療效果，對(duì)解酒毒及防止齒槽膿漏現(xiàn)象亦具有食療效果。本研究采集了各種可能的食用菠菜樣品，進(jìn)行了感染S aureus的比例檢測(cè)，結(jié)果表明市場(chǎng)上還是流通著很多感染S aureus的蔬菜，下面就上述的危害識(shí)別、暴露評(píng)估等分析菠菜中S aureus的風(fēng)險(xiǎn)特征。

金黃色葡萄球菌是抵抗力最強(qiáng)的無(wú)芽胞菌之一，在環(huán)境中廣泛分布，是人類的正常菌叢成分，有時(shí)附著于皮膚，特別是寄居鼻腔，成為住院病人發(fā)生感染的顯著危險(xiǎn)因素，是常見的化膿性球菌，寄生在大多數(shù)人的皮膚上，常引起皮膚、軟組織感染，細(xì)菌可侵入淋巴管及血液，引起危及生命的敗血癥及嚴(yán)重的轉(zhuǎn)移性感染如心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎、肺炎、腦膜炎等。某些金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生毒素，引起皮疹或多系統(tǒng)功能障礙，如中毒性休克綜合征。根據(jù)上述的預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)菠菜在不同溫度環(huán)境下S aureus菌的增長(zhǎng)系數(shù)，從而估計(jì)菌量，減少食用量，達(dá)到預(yù)防S aureus菌及其毒素對(duì)身體影響的目的。金黃色葡萄球菌的易感人群主要是有創(chuàng)口的外科病人、嚴(yán)重?zé)齻颊?、新生兒、老年人、免疫缺陷者、血液病、惡性腫瘤及糖尿病患者，或患流感、麻疹伴肺部病變者；病后免疫力不強(qiáng)，可反復(fù)感染；其中31～40歲感染率最高，其次是21～30歲年齡段，而男性的感染率要高于女性。

通過HACCP風(fēng)險(xiǎn)分析研究后發(fā)現(xiàn)，若在菠菜的種植、加工、銷售和食用中監(jiān)管不嚴(yán)或處理不當(dāng)，就會(huì)導(dǎo)致感染金黃色葡萄球菌的幾率增大。直接食用的菠菜應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好的條件下貯藏，以防腸毒素形成；在氣溫高的春夏季，冷藏或通風(fēng)陰涼的地方放置菠菜也不能超過6 h，在食用前要徹底加熱。在菠菜加工過程中要定期對(duì)其生產(chǎn)加工人員進(jìn)行健康檢查，患金黃色葡萄球菌疑似癥狀的人員要調(diào)換崗位或暫時(shí)停止其工作。在整個(gè)過程中，如果不能對(duì)菠菜的質(zhì)量安全進(jìn)行控制，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素，雖然徹底蒸煮會(huì)殺滅金黃色葡萄球菌，但由于腸毒素的耐高溫性，食用后仍會(huì)發(fā)生金黃色葡萄球菌中毒的情況。此外，無(wú)論冷凍菠菜的生產(chǎn)過程如何，菠菜中S aureus的初始濃度也是引起風(fēng)險(xiǎn)的最根本因素和敏感性分析中很大的風(fēng)險(xiǎn)因素，因此從源頭上控制該菌的初始濃度是最為有效的預(yù)防措施。

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