藏藥十五味龍膽花丸的體外抑菌活性研究

賀平　朱曉莉　劉航　李捷

【摘 要】 目的：觀察藏藥十五味龍膽花丸的體外抑菌活性，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用瓊脂平板打孔法研究十五味龍膽花丸對(duì)3種標(biāo)準(zhǔn)菌株（金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922、沙門(mén)菌CMCC50319）及12株臨床菌株的抑菌作用，并檢測(cè)小鼠含藥血清對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。結(jié)果：十五味龍膽花丸對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的體外抑菌作用，但對(duì)革蘭陰性菌抑菌作用較弱。對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度介于6.25～12.5mg/ml。結(jié)論：十五味龍膽花丸對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌有一定的體外抑菌作用。

【關(guān)鍵詞】 十五味龍膽花丸；金黃色葡萄球菌；大腸桿菌；抑菌

【中圖分類(lèi)號(hào)】R29 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）01-0003-03

Abstract：Objective To investigate the antibacterial activity of Tibetan medicine Shiwuweilongdanhua pills in vitro and provide theoretical basis for clinical application. Methods M-H agar-punching method was adopted to research the antibacterial activity of Shiwuweilongdanhua pills on three standard strains （Staphylococcus aureus ATCC25923， Escherichia coli ATCC25922， Salmonella CMCC50319） and 12 clinical isolates； and the antibacterial effect of mice serum on Staphylococcus aureus was detected.Result Shiwuweilongdanhua pills had obvious antibacterial effect on Staphylococcus aureus in vitro， but weak inhibition on Gram-negative bacteria. The minimal inhibitory concentrations to Staphylococcus aureus were between 6.25mg/ml and 12.5mg/ml.Conclusion Shiwuweilongdanhua pills had significant antimicrobial effect on multidrug-resistant Staphylococcus aureus in vitro， which indicated potential prospects in clinical application.

Keywords：Shiwuweilongdanhua pills； Staphylococcus aureus； Escherichia Coli； Antibacterial activity

藏藥生境獨(dú)特，藥理功效強(qiáng)，引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。十五味龍膽花丸系藏醫(yī)經(jīng)典方劑，始載于藏醫(yī)巨著《四部醫(yī)典》，藏文名“幫間久埃”，為棕灰色水丸，氣微香，味甘、辛、苦。主要由白花龍膽、檀香、訶子（去核）、余甘子、石灰華、廣棗、丁香、肉豆蔻、沉香、巴夏嘎、無(wú)莖芥、甘草、毛訶子、木香、寬筋藤等15味藥材組成。具有清熱利肺、止咳化痰、平喘的功效[1]。目前，十五味龍膽花丸的研究主要集中在成分檢測(cè)[2-6]及臨床療效觀察，并用于治療支氣管炎[7]、咳嗽哮喘[8]、咽炎[9]等，尚未見(jiàn)藥理研究的文獻(xiàn)報(bào)道。研究旨在探討十五味龍膽花丸消炎抗菌作用原理，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 十五味龍膽花丸（西藏民族學(xué)院附屬醫(yī)院，每10丸0.3 g）。青霉素、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片（康泰生物有限公司）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為雌性昆明小鼠（NO.61001700000554，SPF級(jí)），體重（20±2）g由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌ATCC25923 （Staphylococcus aureus）、大腸桿菌ATCC25922 （Escherichia coli）、沙門(mén)菌CMCC50319（Salmonella）均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；耐藥性金黃色葡萄球菌5株、銅綠假單胞菌2株、耐藥性肺炎克雷伯菌2株、耐藥性大腸桿菌3株，由咸陽(yáng)市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科提供，菌株信息見(jiàn)表1。

1.3 儀器 Dade AutoScan-4半自動(dòng)化細(xì)菌鑒定系統(tǒng)；BHC-1300ⅡA/B2型超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)）；Eppendorf 微量移液器； PH140A型干燥/培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；DENVER T-214電子天平；GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱和YXQ-LS-75S立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；ZH-2型渦旋混合器；游標(biāo)卡尺。

2 方法

2.1 藥物準(zhǔn)備 準(zhǔn)確稱(chēng)量藥物，然后在100 ml純水中浸泡30 min，用文火煮沸30 min，冷卻后離心取用上清液，并用少量純水沖洗沉渣兩次，沖洗液離心后取用上清液，將三次上清液合并濃縮至1000 mg/ml，用除菌濾器過(guò)濾后放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 菌液制備 將供試菌株在37℃培養(yǎng)18～20 h，取新鮮菌落用無(wú)菌水稀釋成0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木?，然后用平板涂布法進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。

2.3 平板打孔法抑菌實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[10]用打孔器在M-H瓊脂平板上等距離打6個(gè)的孔（直徑6.5 mm），然后用無(wú)菌棉簽蘸取0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木壕鶆蛲坎加谄桨?，每個(gè)孔內(nèi)加100 μl藥液。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置600、200、60 mg/mL三個(gè)濃度水平，以卡那霉素與青霉素藥敏紙片作為對(duì)照。將平板37℃孵育24 h后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。每株菌種做三個(gè)平行，并求取抑菌圈平均值。

2.4 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 參照文獻(xiàn)[11]采用微量肉湯稀釋法測(cè)定敏感菌株MIC。取7支無(wú)菌試管，第一管加1.5 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯，其余各管均加1 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯；取0.5 ml 200mg/ml藥液加入第一管渦旋30 s，混勻后從第一管取1ml至第二管，依次倍比稀釋至第6管，最后從第6管取1 ml棄掉，藥物濃度梯度為50、25、12.5、6.25、3.12、1.56 mg/ml。用移液器依次向1～7支試管加入50 μL 0.5麥?zhǔn)媳葷岫鹊木翰⒒靹?，?管不加藥物做陽(yáng)性對(duì)照，另設(shè)無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基做陰性對(duì)照，將所有試管置于37℃孵育24 h。將試管內(nèi)培養(yǎng)液接種M-H瓊脂培養(yǎng)18～20 h，以無(wú)菌落生長(zhǎng)的試管作為該菌株的最小抑菌濃度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，并求取MIC平均值。

2.5 血清學(xué)抑菌實(shí)驗(yàn) 根據(jù)打孔法抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。按照藥物使用說(shuō)明書(shū)和計(jì)量換算表確定小鼠給藥中等劑量（0.625mg/ml）。低、中、高劑量組之間均相差3倍。經(jīng)灌胃方式給藥，連續(xù)給藥5天后分離含藥血清，然后進(jìn)行含藥血清抑菌實(shí)驗(yàn)。每株菌種做三個(gè)平行，并求取抑菌圈平均值。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌結(jié)果 由表2可知，十五味龍膽花丸對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923有顯著的體外抑菌作用，且抑菌圈直徑與藥物濃度呈正相關(guān)；對(duì)G-菌株無(wú)抑菌作用較弱，600 mg/ml藥物對(duì)大腸桿菌ATCC25922與沙門(mén)菌CMCC50319均未形成抑菌圈。

3.2 臨床菌株抑菌結(jié)果 由表3可知，十五味龍膽花丸對(duì)5株耐青霉素的金黃色葡萄球均有顯著抑菌作用，且抑菌圈直徑與藥物濃度呈正相關(guān)，但是對(duì)菌G-臨床菌株抑菌作用較弱，僅在高濃度時(shí)對(duì)銅綠假單胞菌有抑菌圈形成。

3.3 MIC測(cè)定 觀察試管中培養(yǎng)基透明度，同時(shí)轉(zhuǎn)種M-H瓊脂培養(yǎng)基觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，得出敏感菌株的最小抑菌濃度。由表4可知，金黃色葡萄球菌MIC介于6.25～12.5 mg/ml。

3.4 血清學(xué)抑菌實(shí)驗(yàn) 十五味龍膽花丸對(duì)金黃色葡萄球菌的血清藥理學(xué)抑菌實(shí)驗(yàn)表明，低、中、高劑量給藥組的小鼠含藥血清抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。所用藥物為十五味龍膽花丸藥粉與純水制備的混懸液，在高劑量組（1.875 mg/g-）灌胃時(shí)發(fā)現(xiàn)藥液比較粘稠，小鼠灌胃給藥過(guò)程相對(duì)比較困難，因此未采取提高給藥劑量來(lái)增加藥物血藥濃度的措施。

4 討論

十五味龍膽花丸由白花龍膽、檀香、訶子、丁香、巴夏嘎、木香等配伍而成。其君藥為白花龍膽，《晶珠本草》記載龍膽花性味苦寒無(wú)毒，主治各種喉癥，其活性與龍膽苦苷有關(guān)，后者具有清熱瀉火、鎮(zhèn)咳利喉的作用[12]。訶子為獨(dú)特的珍稀藏藥材，具有廣譜抗菌作用。訶子提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌[13]和耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌[14]有顯著的抑菌作用，但對(duì)大腸桿菌較弱。丁香中也是該方劑主要活性成分之一，丁香對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及沙門(mén)菌有明顯的抑菌作用[15]。本研究首次探討了十五味龍膽花丸的體外抑菌作用，發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌有顯著抑菌作用，對(duì)銅綠假單胞菌抑菌及沙門(mén)菌也有一定抑菌作用，對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌則無(wú)抑菌作用，與上述方劑組分的研究報(bào)道基本一致。根據(jù)Dade AutoScan-4細(xì)菌鑒定結(jié)果，本研究中耐藥性金黃色葡萄球菌均為MRSA （methicillin-resistant Staphylococcus aureus），該菌已成為全球醫(yī)院感染的主要病原體之一[16]，提示十五味龍膽花丸具有較好的臨床應(yīng)用前景。

藏藥方劑與中草藥方劑的藥物成分比較復(fù)雜，不同成分之間存在擴(kuò)散差異，而且沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)紙片，實(shí)驗(yàn)結(jié)果質(zhì)量較難控制。中藥體外抑菌實(shí)驗(yàn)常用的研究方法[17]主要包括：肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法、紙片擴(kuò)散法、牛津杯法、打孔法等。牛津杯法、打孔法與紙片擴(kuò)散法原理相似，操作簡(jiǎn)便，而且藥液擴(kuò)散相對(duì)均勻。研究結(jié)果顯示，牛津杯法擴(kuò)散速度較慢，24h后部分牛津杯中仍有尚未擴(kuò)散的藥液，而且形成抑菌圈的效果較差。因此本研究的抑菌實(shí)驗(yàn)均采用平板打孔法。

十五味龍膽花丸方劑的化學(xué)成分極其復(fù)雜，經(jīng)口服以后在體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列變化，含藥血清能更好的反映藥物在體內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過(guò)程，特別適合復(fù)方進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)及其作用機(jī)制的研究。所以在平板打孔法抑菌實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用血清藥理學(xué)方法進(jìn)一步研究了小鼠含藥血清對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用。低、中、高劑量給藥組抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性。由此推測(cè)十五味龍膽花丸體內(nèi)抗感染療效并不完全依賴(lài)血清藥物濃度，可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等途徑實(shí)現(xiàn)抗炎止咳的療效。且有研究表明訶子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌，從而有效地增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能[18]；丁香具有抗菌和增強(qiáng)體液免疫的作用[15]。因此有必要進(jìn)一步考察該藥物對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。

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（收稿日期：2015.12.06）