姜黃素抑制胃癌多藥耐藥相關(guān)因子特性研究

隋欣 孫綱 盧光輝

[摘要] 目的 探討姜黃素抑制人胃癌SGC7901/ADR細(xì)胞增殖情況以及與多藥耐藥相關(guān)因子P170及GST-π表達(dá)規(guī)律的相關(guān)性。 方法 采用CCK-8檢測(cè)不同濃度姜黃素對(duì)SGC7901/ADR細(xì)胞12 h、24 h、36 h的抑制情況;通過免疫細(xì)胞化學(xué)法分析各濃度梯度姜黃素作用36 h時(shí)P170及GST-π的表達(dá)差異;采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析。 結(jié)果 姜黃素作用于人胃癌SGC7901/ADR耐藥細(xì)胞劑量越高、時(shí)間越長吸光度越低（P<0.05），各濃度梯度姜黃素作用36 h時(shí)GST-π陽性表達(dá)有降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而與P170陽性表達(dá)則無直接關(guān)聯(lián)性。 結(jié)論 姜黃素可抑制人胃癌SGC7901/ADR耐藥細(xì)胞的增殖，可能抑制GST-π的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 姜黃素;SGC7901/ADR細(xì)胞株;多藥耐藥;P170;GST-π

[中圖分類號(hào)] R735.2 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）10-0034-03

[Abstract] Objective To investigate the inhibition of Curcumin on the proliferation of human gastric cancer SGC7901/ADR cells and the relationship between Curcumin and the expression of multidrug resistance related factors P170 and GST-π. Methods Cell counting kit-8（CCK-8） was used to detect the inhibition of Curcumin at different concentrations on SGC7901/ADR cells for 12， 24 and 36 hours; immunocytochemistry was applied to analyze the differences of P170 and GST-π expression at 36 hours after Curcumin treatment at different concentrations; statistical method was used to analyze the results. Results The higher the dose of Curcumin on SGC7901/ADR cells and the longer the time， the lower the absorbance（P<0.05）. After 36 hours of Curcumin treatment at different concentrations， the positive expression of GST-π decreased， and the difference was not statistically significant（P>0.05）， and had no direct correlation with positive expression of P170. Conclusion Curcumin can inhibit the proliferation of SGC7901/ADR cells， and may inhibit the expression of GST-π.

[Key words] Curcumin; SGC7901/ADR cell line; Multidrug resistance; P170; GST-π

近年來相關(guān)研究表明，從中草藥姜黃中分離出的多酚-姜黃素（Curcumin）對(duì)胃癌的治療具有積極意義，特別是其對(duì)化學(xué)治療的增效性及抗耐藥性[1]。胃癌是我國發(fā)病率及死亡率很高的消化道惡性腫瘤，但目前其治療效果仍不理想，主要原因是腫瘤所具備的多藥耐藥特性（multi-drug resistance，MDR）[2]。多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞先天或后天具有對(duì)某種抗腫瘤藥物的耐藥特性，而且可能對(duì)其他結(jié)構(gòu)特征、干擾機(jī)制、靶目標(biāo)不盡相同的其他類型抗腫瘤藥物具有耐藥特性。經(jīng)相關(guān)研究證實(shí)，其主要作用因子包括已知的P170和GST-π等，可多角度、多靶點(diǎn)干預(yù)胃癌的進(jìn)程和預(yù)后，以及胃癌對(duì)化學(xué)藥物MDR的強(qiáng)度，是近年腫瘤耐藥及多藥耐藥的集中因子[3]。正是基于上述原因，我們著手研究姜黃素對(duì)胃癌多藥耐藥的抑制作用，從而為中草藥抗腫瘤特別是胃癌的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源

胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADR（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍消化病研究所）;姜黃素（Curcumin，C21H20O6=368.38）純度≥65%（ALADDIN）。

1.2 方法

1.2.1 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 ?于培養(yǎng)孔板每孔中分別加入100 μL濃度為5×104/mL對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，預(yù)留等比空白組。將姜黃用培養(yǎng)基等比稀釋成細(xì)胞濃度梯度為0 μmol/L（對(duì)照組）、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L溶液，然后加到培養(yǎng)孔板中，每孔100 μL，每個(gè)濃度18個(gè)復(fù)孔（備份培養(yǎng)供進(jìn)一步免疫細(xì)胞化學(xué)法分析使用）分別培養(yǎng)12、24、36 h，每孔加入CCK-8后采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（波長450 nm）。

1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法分析各濃度梯度姜黃素作用36 h時(shí)P170及GST-π的表達(dá)差異 ?選擇實(shí)驗(yàn)時(shí)間組別姜黃素干預(yù)最充分的36 h時(shí)間點(diǎn)，按各梯度濃度組別從孵箱中取出培養(yǎng)36 h的細(xì)胞，用含EDTA的胰酶消化，分別取2 mL細(xì)胞懸液滴于培養(yǎng)孔板中，放入37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)備用。清洗、固定、去除內(nèi)源性過氧化物酶并濕盒室溫孵育。將標(biāo)本加入適量對(duì)應(yīng)抗體1：100稀釋，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯浸泡并中性樹膠封片。

顯微鏡下逐一觀察，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為：選用已知陽性平片作對(duì)照，P170主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，GST-π主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，染色成棕黃色顆粒且間質(zhì)不染色表達(dá)為陽性，染色強(qiáng)度依次定為棕褐色（+++）、棕黃色（++）、淡黃色（+）[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析，各數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的資料經(jīng)轉(zhuǎn)換后比較，各計(jì)量資料采用（x±s）表示，兩組組間比較采用LDS-t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，各濃度梯度姜黃素與P170及GST-π表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman法分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素梯度濃度及時(shí)間對(duì)胃癌耐藥SGC7901/ADR細(xì)胞株的影響

隨時(shí)間及劑量梯度變化，姜黃素濃度及作用時(shí)間與吸光度呈反比，既抑制了胃癌耐藥SGC7901/ADR細(xì)胞株的增殖，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 各濃度梯度姜黃素與P170及GST-π表達(dá)的相關(guān)性

姜黃素濃度強(qiáng)度分別對(duì)應(yīng)為0 μmol/L（-）、50 μmol/L（+）、100 μmol/L（++）、150 μmol/L（+++）。充分培養(yǎng)36 h后，隨濃度升高，GST-π陽性表達(dá)率均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但采用Spearman法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），無明確相關(guān)性;而P170陽性表達(dá)率無明確相關(guān)變化趨勢(shì)，見表2、3。

3討論

腫瘤的多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞本身具有的對(duì)特定抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)對(duì)其結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、作用目標(biāo)不盡相同的其他抗腫瘤藥物存在耐藥的特性[5]。多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，已知可能的原因?yàn)椋孩倏缒まD(zhuǎn)運(yùn)引起的藥物分子細(xì)胞內(nèi)外分布失調(diào)，導(dǎo)致藥物分子外泄;②調(diào)節(jié)細(xì)胞器靶點(diǎn)分布，從而隱藏藥物靶點(diǎn);③LRP的類膜泵效應(yīng)胞吐藥物分子;④細(xì)胞的自我修復(fù)過表達(dá);⑤細(xì)胞的藥物靶點(diǎn)突變，降低其對(duì)藥物敏感性;⑥PKC過表達(dá)，促進(jìn)相關(guān)蛋白磷酸活化;⑦凋亡基因的影響等[6]。有多種蛋白、信號(hào)通道及生物酶參與其中。如何減輕、抵消甚至逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，從而加強(qiáng)化學(xué)治療的療效，提升化學(xué)治療的預(yù)后，已成為目前癌癥治療研究的重點(diǎn)之一[7]。特別是嚴(yán)重危害我國人民健康的胃癌，其手術(shù)后多需化學(xué)治療，但其療效同樣受困于多藥耐藥的影響。P170、GST-π作為多藥耐藥基因的產(chǎn)物已被廣泛證實(shí)與胃癌的多藥耐藥關(guān)系密切，可影響胃癌等腫瘤對(duì)化學(xué)治療的多藥耐藥進(jìn)程[6]。其中起到介導(dǎo)媒體的P170，對(duì)基因在多藥耐藥層面的重組、轉(zhuǎn)錄起到正向作用;而GST-π是一種廣泛參與機(jī)體解毒的與蛋白結(jié)合的同工酶，一方面加強(qiáng)細(xì)胞毒的溶水性，將其代謝成為沒有毒性的物質(zhì)排出，又對(duì)細(xì)胞的自我修復(fù)起到指導(dǎo)作用，除去對(duì)細(xì)胞積極作用外，也導(dǎo)致了多藥耐藥的強(qiáng)勢(shì)[8]。P170、GST-π均是明確的多藥耐藥相關(guān)因子。實(shí)際上MDR因素很多，且某些MDR因子還存在雙刃劍機(jī)制，如p38MAPK信號(hào)通路等，他們聯(lián)合或孤立對(duì)包括胃癌在內(nèi)的消化道腫瘤的進(jìn)程及后續(xù)化學(xué)治療的療效起著重要的作用，也是腫瘤多藥耐藥的研究高地[3，9]。

近年來隨著中醫(yī)腫瘤學(xué)的深入發(fā)展，中醫(yī)藥對(duì)腫瘤多藥耐藥的調(diào)控及影響作用已得到了公認(rèn)，并轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐取得了較好的療效[10]。姜黃是一種具有歷史藥用價(jià)值的中草藥，具有行氣破淤、通經(jīng)止痛的功效。而姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種酚類色素，具有抗氧化、促凋亡、化療增敏、抗血管生成、抗腫瘤等生物活性，可直接或間接地影響多藥耐藥的進(jìn)程，臨床及基礎(chǔ)研究均提示其聯(lián)合化療藥物在抗腫瘤治療中已取得了正面效果[11]。目前尋求高效、低毒的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的方法已成為研究的熱點(diǎn)。實(shí)際上引起腫瘤多藥耐藥的機(jī)制比較復(fù)雜，但中藥以資源豐富、含有多種逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的活性成分、作用靶點(diǎn)多，而引起了廣泛關(guān)注。特別是近年來以姜黃素為代表的中藥提取物的相關(guān)研究更是取得了突破性的進(jìn)展。姜黃素具有抗癌譜廣、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，可從凋亡、干擾多藥耐藥、增強(qiáng)化療效果、影響滋養(yǎng)血管形成等多角度抗腫瘤，自1985年起就被相關(guān)研究揭示可抑制食管癌、胃癌、肝癌等相關(guān)細(xì)胞系[12-14]，同時(shí)已被美國國立腫瘤研究所列為腫瘤第三代化學(xué)預(yù)防劑[15]。但姜黃素對(duì)多藥耐藥作用的機(jī)制仍不完全明確，特別是腫瘤發(fā)展各階段可直接進(jìn)行微觀干預(yù)的信號(hào)通路、蛋白等角度研究較為稀少，不利于其廣泛的臨床應(yīng)用及推廣。

正是基于上述原因本研究通過探討姜黃素抑制人胃癌SGC7901/ADR細(xì)胞增殖情況以及過程中與多藥耐藥相關(guān)因子P170、GST-π表達(dá)規(guī)律的相關(guān)性，本研究在一定程度上揭示了姜黃素對(duì)胃癌多藥耐藥的抑制作用，既姜黃素的濃度及作用時(shí)間抑制SGC7901/ADR細(xì)胞株的增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;隨姜黃素濃度升高GST-π陽性表達(dá)率均出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而與P170則無直接關(guān)聯(lián)性，這可能與實(shí)驗(yàn)樣本較少及各細(xì)胞株獨(dú)特性有關(guān)，待進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Kang Y，Hu W，Bai E，et al.Curcumin sensitizes human gastric cancer cells to 5-fluorouracil through inhibition of the NFκB survival-signaling pathway[J].Onco Targets Ther，2016，9：7373-7384.

[2] 蔡朋朋，王東紅，李雪松，等.As2O3及聯(lián)合紫杉醇對(duì)胃癌MGC803細(xì)胞的生長和耐藥性的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（29）：4-6，10.

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