基于UPLC-QTOF-MS 和HPLC-QQQ-MS 技術(shù)的鷹嘴豆酚類化合物定性、定量分析及其抗氧化能力研究

李文婷 李紅艷 鄧澤元 張 兵

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330047）

鷹嘴豆（Chickpea，Cicer arietinum L）屬于高營養(yǎng)豆類作物，在中國新疆地區(qū)有逾2500 年的種植歷史[1]。作為藥食兩用植物資源，鷹嘴豆不僅富含礦物質(zhì)、淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)素，而且還含有黃酮、皂苷、膽堿、肌醇、維生素及低聚糖等生物活性成分[2]。研究表明，鷹嘴豆提取物具有降血脂[3]、降血糖[4-5]、抗腫瘤[6]、抗菌、抗氧化[7]、改善學(xué)習(xí)記憶[8]及對(duì)阿爾茨海默病的保護(hù)作用[9]。此外，鷹嘴豆含44.09%的淀粉，明顯低于玉米（70.2%）、蕎麥（69%）、燕麥（60%）中的淀粉含量，是糖尿病患者的理想低糖食品[10]。

豆類作物具有較高的抗氧化活性，與其所含的黃酮、酚酸等物質(zhì)密切相關(guān)[11-13]。有研究結(jié)果顯示[14-16]，植物中存在的天然抗氧化劑，如類胡蘿卜素、生育酚、多酚等，食用后可用于慢性疾病的預(yù)防，保持身體健康。植物中含有豐富的天然多酚類物質(zhì)，主要包括黃酮、酚酸和單寧類物質(zhì)[17]。目前對(duì)植物中酚類物質(zhì)的研究主要為：可溶性酚類和結(jié)合態(tài)酚類，可溶性酚類可經(jīng)有機(jī)溶劑直接提取得到，提取后的殘?jiān)M(jìn)行結(jié)合態(tài)酚類研究，而結(jié)合態(tài)酚類不能直接通過有機(jī)溶劑提取獲得。其中，可溶性酚類提取物除以游離形態(tài)存在，還可與其它物質(zhì)以鍵合態(tài)形式結(jié)合，如醚鍵、糖苷鍵、酯鍵[18]。王畢妮等[17，19-20]以紅棗為原料，對(duì)紅棗中的游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)和堿解結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)進(jìn)行研究。原料經(jīng)有機(jī)溶劑提取后，對(duì)上清液進(jìn)行濃縮及萃取處理，萃取后的有機(jī)相為游離態(tài)酚類；萃取后的水相使用堿溶液處理，可得到酯鍵合態(tài)酚類；酯鍵合態(tài)萃取后的水相使用酸溶液處理，可得到糖苷鍵合態(tài)酚類。

目前，關(guān)于鷹嘴豆所含酚類物質(zhì)的形態(tài)、含量及不同鍵合態(tài)的抗氧化能力，鮮見研究報(bào)道。基于前人對(duì)鷹嘴豆植物化學(xué)物質(zhì)的分析，植物中酚類物質(zhì)的研究，本文以鷹嘴豆80%甲醇提取物為研究對(duì)象，對(duì)不同鍵合態(tài)存在的酚類物質(zhì)含量進(jìn)行測定，評(píng)價(jià)其體外抗氧化能力，同時(shí)采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)鷹嘴豆80%甲醇提取物中酚類物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，以進(jìn)一步了解鷹嘴豆的營養(yǎng)保健作用，為開發(fā)鷹嘴豆相關(guān)高值化產(chǎn)品提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

鷹嘴豆，江西省南昌市當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 試劑及檢測儀器

蘆丁、沒食子酸、染料木苷、兒茶素、牡荊素、原兒茶酸、槲皮素、對(duì)羥基苯甲酸、黃豆苷、對(duì)香豆酸、黃豆黃苷、TPTZ、Trolox、ABTS，阿拉?。籇PPH，西亞試劑；乙醚，國藥試劑；福林酚，上海荔達(dá)生物科技有限公司；無水甲醇、三水醋酸鈉、冰醋酸、鹽酸、乙酸乙酯、硫酸、K2S2O8、FeCl3·6H2O、NaOH，西隴科學(xué)；AlCl3，恒興試劑；Na2CO3、NaNO2、FeSO4，西隴化工股份有限公司。

BioTek 酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；6538-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀HPLC-ESI-Q-TOF-MS、6430-三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀HPLC-ESI-QQQMS，美國Agilent 公司。

1.3 酚類物質(zhì)提取及測定

使用80%甲醇∶水（V/V）溶液進(jìn)行可溶性酚類提取，料液比為1∶15，使用超聲波萃取儀于室溫下提取1 h，離心機(jī)轉(zhuǎn)速4 200×g 離心10 min 進(jìn)行上清液的收集，提取過程重復(fù)4 次，合并所得提取液，用于下述3 種存在形式酚類提取及研究，于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 不同存在形式酚類提取液的制備[17，19-20]游離態(tài)：鷹嘴豆經(jīng)80%甲醇提取的上清液于35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至20 mL，使用鹽酸溶液（6 mol/L）將pH 值調(diào)至2 用于游離態(tài)酚類萃取，萃取液為20 mL 乙醚和乙酸乙酯混合溶液（體積比1∶1），收集有機(jī)相，重復(fù)5 次萃取過程，合并所得有機(jī)相，在35 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用5 mL 80%甲醇復(fù)溶，于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

酯鍵合態(tài)：將提取游離態(tài)酚類所得水相中加入10 mL 4 mol/L NaOH 溶液，充入氮?dú)夂蠓饪冢覝卣袷幏磻?yīng)4 h，加6 mol/L HCl 將pH 值調(diào)至2，酯鍵合態(tài)酚類萃取過程同上。

糖苷鍵合態(tài)：將提取完酯鍵合態(tài)酚類所得水相進(jìn)行糖苷鍵合態(tài)提取，與4 mL HCl 混勻進(jìn)行水解提取，水解溫度85 ℃，時(shí)間30 min，糖苷鍵合態(tài)酚類萃取方法同上。

1.3.2 酚酸含量測定[21-22]采用Folin-Ciocalten法進(jìn)行酚酸含量的測定，用96 孔板進(jìn)行試驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)品為沒食子酸（Gallic acid），由沒食子酸系列標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。25 μL 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中加125 μL 福林酚試劑（0.2 mol/L），室溫下反應(yīng)10 min，再加飽和Na2CO3溶液（10 g/100 mL）125 μL 反應(yīng)30 min，樣品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液加反應(yīng)液后在振蕩器上緩慢搖勻，測定其在波長765 nm 下的吸光度值，樣品所測含量以mg/g DW 表示。

1.3.3 黃酮含量測定[21-22]采用亞硝酸鈉-三氯化鋁法進(jìn)行黃酮含量測定，用96 孔板進(jìn)行試驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)品為兒茶素（Catechin），由兒茶素系列標(biāo)準(zhǔn)濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。25 μL 樣品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液與110 μL NaNO2（0.066 mol/L）于室溫混合反應(yīng)5 min，加入15 μL 的AlCl3（0.75 mol/L）溶液反應(yīng)6 min，最后加入100 μL NaOH（0.5 mol/L）溶液反應(yīng)10 min，樣品或標(biāo)準(zhǔn)品溶液加反應(yīng)液后在振蕩器上緩慢搖勻，測定其在波長510 nm 下的吸光度值，樣品所測含量以mg/g DW 表示。

1.3.4 亞鐵離子還原能力（FRAP）測定[22-23]FRAP工作液：TPTZ 溶液（10 mmol/L）、醋酸鈉緩沖溶液（0.3 mol/L）和三氯化鐵溶液（20 mmol/L）按1∶10∶1 的體積比進(jìn)行混合，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

方法：預(yù)熱至37 ℃的FRAP 工作液180 μL加10 μL 樣品或FeSO4標(biāo)品溶液，混勻后37 ℃避光反應(yīng)10 min，測定其在波長593 nm 下的吸光度值，以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，抗氧化活性測定結(jié)果以mmol Fe2+/g DW 表示。

1.3.5 DPPH 自由基清除能力測定[22-23]100 μL DPPH 甲醇溶液（0.065 mmol/L）和100 μL 樣品或空白溶液混勻后室溫避光反應(yīng)30 min，測定其在波長517 nm 下的吸光度值，以Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，樣品DPPH 清除能力以mg TE/g DW（TE，Trolox equivalent）表示。清除率按公式（1）計(jì)算。

式中，Ai——DPPH 工作液加樣品溶液所測吸光度值；Aj——甲醇加樣品溶液所測吸光度值；Ac——樣品溶劑加DPPH 工作液所測吸光度值。

1.3.6 ABTS 自由基清除能力[23-24]ABTS 工作液：取7.0 mmol/L ABTS 儲(chǔ)備液5 mL，添加88 μL 140 mmol/L K2S2O8溶液后混勻，靜置12～16 h。用80%的甲醇溶液稀釋ABTS 工作液，使稀釋后溶液在波長734 nm 處的吸光值為0.7±0.02。

方法：20 μL 樣品或標(biāo)品溶液加200 μL ABTS 工作液，混勻后室溫避光反應(yīng)6 min，測定其在波長734 nm 下的吸光度值，以Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，樣品ABTS 清除能力以mg TE/g DW（TE，Trolox equivalent）表示。清除率按公式（2）計(jì)算。

式中，A0——ABTS 工作液加樣品溶劑所測吸光度值；Ai——ABTS 工作液加樣品溶液所測吸光度值；Aj——80%甲醇加樣品溶液所測吸光度值。

1.4 UPLC-QTOF-MS 定性分析[25-26]

液相條件如下，色譜柱：C18 色譜柱（Agilent eclipse plus，2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速：0.3 mL/min，流動(dòng)相：甲醇溶液（A）和含0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0～10 min，95%-90%A；10～30 min，90%-70%A；30～38 min，70%-50%A；38～43 min，50%A；43～45 min，50%-95%A。DAD：280 nm，進(jìn)樣量：5 μL，柱溫：35 ℃。

質(zhì)譜條件：全掃描模式：負(fù)離子，干燥氣溫度：300 ℃，離子源：電噴霧離子源，全質(zhì)譜數(shù)據(jù)的質(zhì)量范圍：m/z 50～1 000，裂解電壓：175 V，毛細(xì)管電壓：3.5 kV，霧化氣壓力：30 psi，母離子的MS2 碰撞能：10～40 V，干燥氣流速：10.0 L/min。

1.5 HPLC-QQQ-MS 定量分析[25-26]

液相條件：色譜柱：C18 色譜柱（Agilent eclipse plus，2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：5 μL，柱溫：35 ℃。流動(dòng)相：甲醇溶液（A）和含0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0～18 min，95%-50%A；18～25 min，50%-5%A；25～28 min，5%-95%A。

質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源，質(zhì)譜MRM多反應(yīng)監(jiān)測模式：負(fù)離子。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD，n=3）表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析軟件為SPSS，方差分析用于顯著性研究，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著的指標(biāo)為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 含量分析

鷹嘴豆提取物中酚酸及黃酮含量見表1，不同存在形式酚類物質(zhì)的酚酸、黃酮含量不同，其中糖苷鍵合態(tài)酚類物質(zhì)的酚酸含量最高，可達(dá)0.81 mg/g，而黃酮含量最低，為0.14 mg/g；游離酚類物質(zhì)黃酮含量最高（0.26 mg/g），酚酸含量最低（0.16 mg/g）；酯鍵合態(tài)酚類物質(zhì)的酚酸、黃酮含量分別為0.32 mg/g 和0.18 mg/g。Xu 等[27]采用有機(jī)溶劑提取鷹嘴豆酚酸含量為1.41～1.81 mg/g、黃酮含量為0.18～3.16 mg/g。Xu 等[28]所測鷹嘴豆酚酸、黃酮含量分別為0.98 mg/g，0.72 mg/g。Han 等[29]所測鷹嘴豆酚酸含量為2.2 mg/g，高于本研究結(jié)果；而Fernandez-Orozco 等[30]所測酚酸含量為0.54 mg/g，低于本研究結(jié)果。研究時(shí)所用的原料提取方法、原料品種、生長區(qū)域及環(huán)境、選取標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照種類等因素都有可能造成研究結(jié)果的差異。

表1 提取物含量及抗氧化能力測定Table 1 Determination of extracts content and antioxidant activity

2.2 抗氧化能力分析

鷹嘴豆酚類提取物的抗氧化能力如表1 所示，不同存在形式酚類提取物的抗氧化能力差異顯著，其中糖苷鍵合態(tài)提取物具有最高的FRAP還原能力、DPPH 清除能力、ABTS 清除能力，其值分別為36.66 mmol Fe2+/g，1.20 mg TE/g，0.93 mg TE/g；游離態(tài)提取物具有最低的FRAP 還原能力、DPPH 清除能力、ABTS 清除能力，其值分別為2.61 mmol Fe2+/g，0.27 mg TE/g，0.22 mg TE/g。Han 等[28]研究表明，有機(jī)溶劑所提鷹嘴豆ABTS 清除能力為1.5 μmol TEAC/g，而Nithiyanantham等[31]采用不同溶劑提取鷹嘴豆酚類物質(zhì)，其FRAP值為758.88～1517.57 mmol Fe（Ⅱ）/μg 提取物，趙艷等[32]所測FRAP 值為45.02～53.38 μmol/g。提取方法、提取所得物質(zhì)酚類種類及含量不同，原料品種、采收時(shí)間及栽培地區(qū)等因素都有可能造成研究結(jié)果的差異。

2.3 定性分析

80%甲醇提取物中物質(zhì)初步分析鑒定使用UPLC-QTOF-MS，主要依據(jù)指標(biāo)為樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜分子離子峰及離子碎片數(shù)據(jù)、UV 吸收光譜、出峰時(shí)間等信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫（Metlin）和參考文獻(xiàn)等信息。圖1 所示總離子流圖（Total ion current，TIC），鑒定結(jié)果見表2，初步鑒定出24 種化合物，包括4 種酚酸、12 種黃酮。

Zhao 等[33]通過IR 及NMR 等技術(shù)鑒定出鷹嘴豆乙醇提取物中含有鷹嘴豆芽素A、紅車軸草根苷、毛蕊異黃酮、印度黃檀苷、芒柄花素、染料木素、芒柄花苷等7 種異黃酮；Sreerama 等[34]從鷹嘴豆提取物中鑒定出黃豆苷元、對(duì)羥基苯甲酸、綠原酸、槲皮素、染料木素、香草酸、阿魏酸、楊梅素、原兒茶素、咖啡酸、對(duì)香豆酸、山奈酚、沒食子酸、丁香酸、芥子酸等15 種酚類物質(zhì)；Magalh?es 等[35]從鷹嘴豆提取物中鑒定得到槲皮素-3-O-鼠李糖苷、丁香酸、木犀草素-8-O-葡糖苷、對(duì)羥基苯甲酸、楊梅素-3-O-鼠李糖苷、龍膽酸、槲皮素-3-O-半乳糖苷等7 種酚類物質(zhì)；Konar 等[36]鑒定出芒柄花苷、染料木苷、黃豆苷、黃豆黃苷、印度黃檀苷、鷹嘴豆芽素A、黃豆黃素、染料木素、芒柄花素、黃豆苷元等10 種酚類物質(zhì)。本試驗(yàn)在鷹嘴豆80%甲醇提取物中新鑒定出牡荊素、虎杖苷、異鼠李素-O-葡糖苷酸、蘆丁等4 種酚類物質(zhì)。

圖1 80%提取液總離子流圖Fig.1 TIC of 80% methanol extract

2.4 定量分析

采用HPLC-QQQ-MS 對(duì)鷹嘴豆80%甲醇提取物中酚類物質(zhì)進(jìn)行定量分析[37]，條件如表3 所示，標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線由外標(biāo)法測得。

定量測定鷹嘴豆80%甲醇提取物中的9 種酚類物質(zhì)，可以看到，對(duì)羥基苯甲酸、香豆酸、原兒茶酸類物質(zhì)含量最高，分別為（10.26±0.50），（2.30±0.04），（2.67±0.10）μg/g，黃豆苷、蘆丁、槲皮素，而染料木苷、黃豆黃苷、牡荊素含量最低，分別為（0.13±0.01），（0.08±0.01），（0.07±0.01）μg/g。Konar 等[36]對(duì)鷹嘴豆提取物進(jìn)行定量分析，測得鷹嘴豆芽素A、黃豆苷元、芒柄花素、染料木素、黃豆黃素、印度黃檀苷、黃豆苷、芒柄花苷、染料木苷、黃豆黃苷含量分別為0.846，0.009，0.08，0.012，0.772，1.016，0.014，0.056，0.05，0.221 μg/g；Magalh?es等[35]從鷹嘴豆提取物中測得對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、龍膽酸、木犀草素-8-O-葡糖苷、楊梅素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量分別為19.2～60.5，45.9，8.1～26.0，1.2，7.4，5.0，7.2 μg/g；Fratianni 等[38]所測鷹嘴豆提取物中沒食子酸、綠原酸、兒茶素、槲皮素、阿魏酸、木犀草素、香豆酸含量分別為5.42～6.2，4.62～7.37，147.79～178.21，0.37～3.17，5.03～8.37，0.55，0.43 μg/g。本研究與所報(bào)道文獻(xiàn)所測單體酚類含量有所不同，可能是因?yàn)樵掀贩N、原料顏色、提取方法及定量分析方法等存在差異。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)用有機(jī)溶劑提取鷹嘴豆中可溶性酚類，并對(duì)其中以不同鍵合態(tài)存在的物質(zhì)進(jìn)行分離，結(jié)果表明，以糖苷鍵存在的酚酸含量可達(dá)0.81 mg/g，相比于其它鍵合態(tài)含量最高；游離態(tài)酚酸含量最低，黃酮含量最高。糖苷鍵合態(tài)提取物具有最高的FRAP 還原能力、DPPH 清除能力、ABTS 清除能力，其值分別為36.66 mmol Fe2+/g，1.20 mg TE/g，0.93 mg TE/g；而游離態(tài)提取物具有最低的FRAP 還原能力、DPPH 清除能力、ABTS 清除能力。本試驗(yàn)采用液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)鷹嘴豆提取物進(jìn)行定性分析，80%甲醇提取物中共鑒定出24 種物質(zhì)，其中黃酮類物質(zhì)有12 種、酚酸有4 種；對(duì)所鑒定物質(zhì)中的9 種酚類物質(zhì)進(jìn)行定量研究，結(jié)果顯示鷹嘴豆中對(duì)羥基苯甲酸、原兒茶酸、香豆酸類化合物含量豐富。本研究可為鷹嘴豆的進(jìn)一步開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化利用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。