皂苷-蛋白質(zhì)相互作用的研究進展

朱力杰 許楊楊 徐清瑩 尹 鵬 劉 賀

（渤海大學食品科學與工程學院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013）

皂苷是自然界中一類結(jié)構(gòu)較為復雜的低聚糖苷類化合物，通常由疏水性皂苷苷元和親水性糖配基（如葡萄糖、鼠李糖、半乳糖等）組成，二者通過糖苷鍵相連[1]。根據(jù)皂苷水解后的苷元結(jié)構(gòu)，可分為三萜皂苷與甾體皂苷兩大類。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，皂苷的許多活性功能被發(fā)現(xiàn)，如抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、保肝等[2-4]。此外，它們還兼具乳化性、起泡性等能夠?qū)κ称返募庸ぬ匦援a(chǎn)生影響的性質(zhì)。皂苷無論是作為功能性成分還是表面活性劑都具有很大的發(fā)展前景。

蛋白質(zhì)是一類由氨基酸以脫水縮合的方式組成的多肽鏈，經(jīng)過盤曲折疊形成具有空間結(jié)構(gòu)的化合物，其作為生物體最基本的結(jié)構(gòu)和功能單元幾乎參與了所有的生命活動。氨基酸的種類、數(shù)量、排列順序以及肽鍵的空間構(gòu)象決定著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)又決定著蛋白質(zhì)的功能。目前有研究表明，蛋白質(zhì)與配體的相互作用會改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進而影響蛋白質(zhì)的功能特性，比如乳化性、凝膠性、起泡性等。

食品是多成分共存的復雜體系，而多成分之間會發(fā)生相互作用，進而影響食品的營養(yǎng)和品質(zhì)，如蛋白質(zhì)與多酚能以共價鍵和非共價鍵發(fā)生復合反應，形成的蛋白質(zhì)-多酚復合物對食品體系的感官性質(zhì)、安全性以及營養(yǎng)性等產(chǎn)生影響[5-6]，因此研究食品組分之間的相互作用對探明食品體系的形成機制至關(guān)重要。皂苷和蛋白質(zhì)都具有兩親性結(jié)構(gòu)并表現(xiàn)出較好的表面活性，已被廣泛應用于食品、藥品和化妝品等領域。皂苷與蛋白質(zhì)能以氫鍵、疏水相互作用、范德華力等方式進行結(jié)合，一方面會對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響，如將人參皂苷Rg1 加入到胰蛋白酶中，會造成蛋白質(zhì)中α-螺旋和無規(guī)則卷曲的含量下降，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的含量增加，改變胰蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)[7]；另一方面是皂苷要表達活性時需要與蛋白質(zhì)相結(jié)合，如人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）可以提升人參皂苷Rh2 的水溶性，從而更好地發(fā)揮皂苷的各種活性[8]。Wojciechowski 等[9]也發(fā)現(xiàn)添加一定濃度的溶菌酶可以提高皂樹皂苷的發(fā)泡性。

本文主要概述皂苷與蛋白質(zhì)的相互作用機制、影響因素及分析方法，以及二者相互作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響。

1 皂苷與蛋白質(zhì)相互作用機理及影響因素

蛋白質(zhì)與小分子之間的相互作用主要涉及共價鍵和非共價鍵。皂苷和蛋白質(zhì)都是兩親性分子，就目前研究而言，皂苷與蛋白質(zhì)的相互作用主要為非共價相互作用（疏水相互作用、氫鍵、范德華力以及離子相互作用等）。2011 年，林玉龍等[10]利用熒光光譜、紫外光譜技術(shù)研究了齊墩果酸（Oleanolic acid，OA）與牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）的相互作用及熱力學特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA 能使BSA 的內(nèi)源熒光猝滅，并以動態(tài)猝滅為主，通過熱力學參數(shù)的焓變△H＞0、熵變△S＞0 得出二者的相互作用主要為疏水相互作用。B?ttcher 等[11]則通過熒光光譜法測定了皂樹皂苷（Quillaja Saponin，QS）與β-乳球蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)猝滅類型為靜態(tài)猝滅，QS 可能通過氫鍵或疏水相互作用與β-乳球蛋白的兩個結(jié)合位點發(fā)生非共價結(jié)合，界面剪切流變學和膨脹流變學也證實了這一相互作用。Liang 等[12]于2018 年綜合多種分析技術(shù)（熒光光譜法、圓二色譜、分子對接技術(shù)）研究了柴胡皂苷D 與HSA 之間的相互作用力，結(jié)果通過Stern-Volmer 方程可知猝滅類型主要是靜態(tài)猝滅，通過熱力學參數(shù)（焓變△H、熵變△S 及吉布斯自由能△G 為負值）分析發(fā)現(xiàn)，氫鍵和范德華力是柴胡皂苷D 與HSA 之間的主要作用力。Reichert 等[13-15]研究了酪蛋白酸鈉、豌豆蛋白與QS 的相互作用，認為疏水相互作用是主要作用力。

目前，對皂苷與蛋白質(zhì)相互作用影響因素的研究主要包括蛋白質(zhì)種類與濃度、皂苷結(jié)構(gòu)與濃度、皂苷/蛋白質(zhì)比例以及溫度、pH 值、鹽離子濃度等外界因素。早在1995 年，Tanaka 等[16]通過對茶籽皂苷與鹽溶性蛋白的相互作用研究，發(fā)現(xiàn)茶籽皂苷具有抑制鹽溶性蛋白熱變性的能力，隨著皂苷濃度的增加，抑制蛋白聚集的程度越大。隨后Makoto 等[17]通過CD 光譜圖發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白與大豆皂苷結(jié)合后的復合物對胰凝乳蛋白酶的敏感性表現(xiàn)為：大豆球蛋白＞β-伴大豆球蛋白，其原因是兩種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾能力不同。到2001 年，Morton 等[18]通過建立一種酸性飲料絮狀物（Acid beverage floc，ABF）模型發(fā)現(xiàn)，在酸性條件（pH=2）下，單獨的甜菜糖蛋白和皂苷溶液無法構(gòu)成ABF，只有二者進行復合并且蛋白質(zhì)濃度較低時才能形成ABF，此時測定的皂苷-蛋白質(zhì)復合物的濁度增加，飲料絮狀體較多，原因是蛋白質(zhì)（正電荷）與皂苷具有相反的電荷，導致了靜電絡合物的形成。2015 年起，Kezwon 等[19]研究了溶菌酶、β-乳球蛋白、β-酪蛋白對皂樹皮皂苷（Quillaja bark saponin，QBS）界面張力的影響，發(fā)現(xiàn)造成皂苷界面張力不同的原因可能與蛋白質(zhì)的特定結(jié)合位點有關(guān)，其可以選擇性識別皂苷分子的糖或羧基。Hou 等[20]采用熒光光譜、紫外吸收光譜、同步熒光光譜和三維熒光光譜等技術(shù)，研究了齊墩果烷型三萜化合物與BSA 結(jié)合的親和性。結(jié)果表明，皂苷與蛋白質(zhì)結(jié)合親和力的順序為甘珀酸＞甘草次酸＞甘草甜素，其原因是結(jié)合過程中的相互作用力不同，甘珀酸與BSA 相互作用力主要為疏水相互作用，而甘草次酸、甘草甜素主要為氫鍵。Reicher 等[21]研究了酪蛋白酸鈉、豌豆蛋白與QS 以不同比例形成的復合乳液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有當酪蛋白酸鈉與QS 的濃度比為0.1∶0.4 時形成的乳液粒徑較大，可能是因為在此比例下二者存在拮抗作用且形成的復合物的界面活性較低，而豌豆蛋白與QS 的濃度比為2.0∶0.3、3.0∶0.2 和4.0∶0.1 時，乳液發(fā)生相分離并凝膠化，可能是因為蛋白質(zhì)濃度的增加使得液滴之間的靜電排斥力降低。Salminen 等[22]通過研究溫度、pH 值、NaCl 濃度對QS 和酪蛋白酸鈉相互作用的影響，發(fā)現(xiàn)復合物乳液（QS∶酪蛋白酸鈉=2∶3，1∶4）在pH 為2，6，7時，NaCl＜200 mmol/L 時的粒徑較小且較穩(wěn)定，表明疏水相互作用是主要作用力，而溫度對其影響較小是因為酪蛋白酸鈉對溫度變化不敏感。Reicher 等[14]研究了酪蛋白、豌豆蛋白、菜籽卵磷脂、雞蛋卵磷脂在不同pH 值條件下與QS 的相互作用，發(fā)現(xiàn)pH 值的變化會影響二者復合體系的凝聚狀態(tài)及相互作用。因此，在研究皂苷與蛋白質(zhì)相互作用方式時，需要考慮皂苷和蛋白質(zhì)的具體結(jié)構(gòu)，因為結(jié)構(gòu)決定著二者相互結(jié)合的位點及作用力類型。此外還需要考慮二者發(fā)生反應的溫度、pH 值、離子強度等環(huán)境條件。

2 皂苷與蛋白質(zhì)相互作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的影響

目前，關(guān)于皂苷與蛋白質(zhì)相互作用對皂苷的影響研究較少，而對蛋白質(zhì)的影響研究較多。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)，其中一級結(jié)構(gòu)是基本結(jié)構(gòu)，二級、三級、四級屬于空間結(jié)構(gòu)。圖1 為蛋白質(zhì)與皂苷相互作用的機理圖[23-26]，反映了二者相互作用帶來的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化。目前研究這一相互作用對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響主要集中在二級和三級結(jié)構(gòu)上。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，由骨架上的羰基和酰胺基團之間形成的氫鍵維持這些結(jié)構(gòu)。1996 年Shingo 等[27]在BSA中添加大豆皂苷，通過熱穩(wěn)定性和蛋白酶消化性研究了BSA 與皂苷之間的相互作用，結(jié)果表明二者復合物的α-螺旋的含量在各溫度下均高于單獨BSA，并且也發(fā)現(xiàn)添加大豆皂苷可提高BSA 的熱穩(wěn)定性，降低BSA 對胰凝乳蛋白酶的敏感性。隨后Makoto 等[28]于2007 年通過研究發(fā)現(xiàn)加入單體大豆皂苷I 后，蛋白酶抑制劑（Bowman-birk inhibitor，BBI）的CD 光譜圖發(fā)生的改變?yōu)椴ㄩL210 nm 處的負峰向左偏移，橢圓度變大，表明添加皂苷后BBI 結(jié)構(gòu)的變化，而這種結(jié)構(gòu)的改變也提高了胰蛋白酶與BBI 之間的親和性，從而增強了BBI 對胰蛋白酶的抑制活性。桑尚源等[29]2016 年研究發(fā)現(xiàn)，在HSA 與大豆皂苷Ⅱ的濃度比例為1∶0.5、1∶2 和1∶4 時，HSA 的α-螺旋含量增加，β-折疊含量下降，其原因是大豆皂苷Ⅱ與HSA 的結(jié)合可能改變了HSA 的氫鍵骨架，導致HSA 的二級結(jié)構(gòu)從β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置，即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。皂苷與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用會導致蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化，其相應的蛋白質(zhì)固有熒光特性也會發(fā)生變化。Hu 等[30]利用甘草酸單銨（Monoammonium glycyrrhizinate，MAG）與BSA 進行復合反應，發(fā)現(xiàn)隨著MAG 濃度的增加，BSA 的熒光強度降低，其發(fā)射波長向長波方向移動，表明色氨酸殘基周圍的極性增加，疏水性降低，猝滅類型可能為動態(tài)猝滅。Zhang 等[31]研究了人參皂苷Rg3 與HSA 之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的熒光強度增加且發(fā)生藍移，說明色氨酸處于更加疏水的環(huán)境中，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加緊密。

圖1 皂苷與蛋白質(zhì)相互作用[23-26]Fig.1 Interaction between saponin and protein[23-26]

皂苷與蛋白質(zhì)的相互作用使得蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，影響了蛋白質(zhì)分子的表面性能，改變了蛋白質(zhì)表面的親水/疏水性，從而導致蛋白質(zhì)功能特性的改變。蛋白質(zhì)的功能特性是指食品體系在加工貯藏過程中發(fā)生的物理或化學變化，這種變化會直接影響食品的感官和品質(zhì)特性。皂苷與蛋白質(zhì)相互作用對蛋白質(zhì)功能特性影響主要集中在蛋白質(zhì)的乳化性、起泡性、凝膠性等。Xu 等[32]利用水解谷蛋白（Hydrolyzed rice glutelin，HRG）與QS 反應形成了水包油乳液，結(jié)果表明當HRG 與QS 濃度比為1∶1 時，二者形成的乳液在高鹽（NaCl）、高溫及低pH 值下的穩(wěn)定性高于單獨體系，其原因是添加QS 可提高HRG 的乳化穩(wěn)定性，形成較厚的界面層，從而產(chǎn)生較強的空間排斥力以及較弱的靜電斥力，減少乳液的絮凝。同樣，在Defaria 等[33]研究中發(fā)現(xiàn)將QS 與β-乳球蛋白濃度比為1∶1 混合制備的乳液在pH 7～9，NaCl 濃度0～200 mmol/L 下較單一體系穩(wěn)定，說明添加QS可以提高β-乳球蛋白的乳化穩(wěn)定性。Reichert等[13-14]將QS 與豌豆蛋白質(zhì)進行反應，因儲能模量G′大于損耗模量G″證實了復合體系凝膠網(wǎng)絡的存在，隨著QS 濃度的增加，儲能模量G′、損耗模量G″增加，蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡持水性增加，其原因是QS 使得疏水相互作用增強。劉雨陽等[34]成功構(gòu)建了茶皂苷-小麥醇溶蛋白復合體系，并指出茶皂苷對小麥醇溶蛋白發(fā)泡性和泡沫穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明皂苷可使蛋白質(zhì)形成尺寸更小的泡沫，提高了復合體系的發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性。

3 皂苷與蛋白質(zhì)相互作用研究方法

3.1 圓二色譜

圓二色譜（Circular dichroism，CD）在結(jié)構(gòu)生物學中已經(jīng)被廣泛應用了近半個世紀，主要用于測定溶液中蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)[35-36]。蛋白質(zhì)是具有光學活性的分子，由于肽鍵和芳香氨基酸等生色基團的存在，可以產(chǎn)生CD 信號。當?shù)鞍踪|(zhì)與小分子發(fā)生作用后，可以判斷小分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響及蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化[37-41]。在研究皂苷與蛋白質(zhì)相互作用時，由于CD 光譜的數(shù)據(jù)能最直觀的反應蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，因此被廣泛應用。

Yu 等[42]利用CD 研究了5 種三萜皂苷與胰脂肪酶（Pancreatic lipase，PL）的相互作用，結(jié)果表明茶皂苷（Tea saponin，TS）的加入對PL 二級結(jié)構(gòu)沒有影響，說明TS 通過對底物的競爭性抑制來抑制PL 活性；而OA、人參皂苷Ro（Ginsenoside Ro，Ro）、人參皂苷Rd（Ginsenoside Rd，Rd）、白樺脂醇（Betulin，Be）的加入使得PL 中的α-螺旋含量從37%降到了25%，β-轉(zhuǎn)角含量從25%降到11%，說明皂苷Ro、Rd、OA 和Be 改變了PL 二級結(jié)構(gòu)進而影響了PL 活性。Chen 等[43]利用CD 研究了柴胡皂苷C 與HSA 的相互作用，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷C 與HSA 結(jié)合會導致209 nm 處的波峰藍移，并且使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角的含量增加了4.9%，β-折疊和無規(guī)則卷曲的含量減少了2.3%，說明柴胡皂苷C 的添加影響了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，并引發(fā)了多肽的重排現(xiàn)象。Su 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍皂苷能減少腸道膽固醇的吸收，起到降血脂的作用。原因是絞股藍皂苷的添加使得豬胰脂肪酶結(jié)構(gòu)中的α-螺旋含量減少，β-折疊含量增加，而豬胰脂肪酶的活性與α-螺旋的含量成正相關(guān)。

3.2 熒光光譜法

熒光光譜法（Fluorescent spectrometry，F(xiàn)S）被廣泛應用于研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用[45]。分子的結(jié)構(gòu)變化、成鍵情況、發(fā)光特性可以通過測定蛋白質(zhì)的熒光參數(shù)反映出來，得到蛋白質(zhì)與小分子相互作用的信息及蛋白質(zhì)分子在各種環(huán)境中的構(gòu)象變化[46]，從而進一步闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。目前應用較廣泛的FS 法有熒光猝滅法和同步熒光光譜法。FS 法可以反應蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化，因操作簡單、數(shù)據(jù)準確而被廣泛應用。除上述兩種方法外，熒光光譜法還包括熒光偏振、熒光增強等方法。

Yang 等[48]利用FS 法研究了齊墩果酸及其三萜皂苷衍生物（OA、LL-4、LL-2）與血清白蛋白（BSA、HSA）的疏水相互作用。通過Stern-Volmer方程分析處理數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)熒光猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小，說明二者結(jié)合的猝滅機制為靜態(tài)猝滅，而皂苷及其衍生物與蛋白質(zhì)的結(jié)合順序為LL-4＞LL-2＞OA 且存在唯一的結(jié)合位點。Zhou等[49]研究發(fā)現(xiàn)甘草次酸（Glycyrrhetinic acid，GEA）與BSA 之間的相互作用為非特異性疏水相互作用并通過Stern-Volmer 方程得知二者的猝滅機制為靜態(tài)猝滅，由于圖形偏向Y 軸時結(jié)合常數(shù)大于1。Chen 等[50]利用同步熒光光譜研究了人參皂苷（Rg1、Rb1、Re）與k-酪蛋白的相互作用，結(jié)果表明人參皂苷單體Rg1、Rb1 與蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射峰的峰位發(fā)生了輕微藍移，而人參皂苷Re 發(fā)生了紅移，說明皂苷使得蛋白質(zhì)周圍微環(huán)境的疏水性減弱，極性增加。

3.3 紫外-可見吸收光譜法

紫外可見吸收光譜（UV-visible spectroscopy，UV-vis）是用來研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的一種方法。由分子內(nèi)電子的躍遷而產(chǎn)生，因物質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，所以吸收光譜也不同[51-52]。在蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基的側(cè)鏈基團和肽鍵對光存在吸收，由于氨基酸中生色基團不同而產(chǎn)生了不同的吸收光譜[53-54]，因此通過觀察小分子與蛋白質(zhì)作用前、后紫外吸收光譜的變化，可以進一步了解分子間相互作用的機理、作用部位、作用程度等信息，從而進行定性定量分析。UV 常與FS 聯(lián)用，利用二者的重疊光譜，按照非輻射能量轉(zhuǎn)移理論計算皂苷與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合距離。此外，UV 吸收光譜的變化可以用于判斷二者的猝滅類型。

劉媛等[55]研究了三七總皂苷中的兩種單體皂苷R1、Rg1 與BSA 的相互作用，通過Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)方程曲線圖可知，二者復合物的結(jié)合常數(shù)較小且BSA-R1 結(jié)合常數(shù)小于BSA-Rg1，說明二者結(jié)合相對較弱，結(jié)合力與皂苷成分也有關(guān)系。Cheng 等[56]利用紫外可見吸收光譜研究了OA與BSA 的相互作用，發(fā)現(xiàn)隨著OA 含量的增加，二者復合體系的紫外吸收強度增加，其原因是OA與BSA 的結(jié)合導致了蛋白質(zhì)中螺旋穩(wěn)定性的下降，造成了蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。

3.4 傅里葉紅外光譜法

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的維持主要依靠肽鏈上的C=O 以及酰胺-N-H 間形成的氫鍵，而傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）對氫鍵又極其敏感，因此它可用來檢測蛋白質(zhì)與小分子之間是否發(fā)生相互作用[57-60]。FTIR 是一種無損檢測技術(shù)，無需對蛋白質(zhì)進行特殊標記，所以被廣泛應用測定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，大多數(shù)情況下可以與CD 光譜聯(lián)合進行分析。

Liu 等[61]利用傅立葉紅外光譜法觀察了三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，TPNS）與HSA的形成過程，結(jié)果表明TPNS 能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的C=O、C-N 的基團發(fā)生親水相互作用，而隨著TPNS 濃度的增加，HSA 中的α-螺旋含量減少，β-折疊含量增加。Tang 等[62]研究發(fā)現(xiàn)GEA 可使HSA的酰胺Ⅰ帶峰位從1656.40 cm-1移到1637.83 cm-1，通過對組分條帶中積分面積計算得知，二者結(jié)合后，蛋白質(zhì)的α-螺旋含量從50.93%減少到24.73%，β-轉(zhuǎn)角含量從23.6%增加到25.27%并且伴隨著無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（13.98%）的出現(xiàn)。

3.5 等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法（Isothermal titration calorimetry，ITC）是采用功率補償?shù)脑?，在恒定溫度下記錄將反應物溶液加入到樣品溶液中的熱量變化的方法，是研究蛋白質(zhì)與小分子相互作用的新型技術(shù)[63-67]。ITC 技術(shù)因測定的焓變△H、熵變△S 及吉布斯自由能△G 值可以很直觀的反應配體與蛋白質(zhì)相互作用的作用力類型，所以應用廣泛。

Kayukawa 等[68]利用ITC 研究了QBS 與β-半乳糖苷酶之間的相互作用，結(jié)果表明加入皂苷后所測得蛋白質(zhì)的焓變△H 由（-16300±395.7）J/mol 變?yōu)椋?41580±1345）J/mol，熵變由（-2223.7±18）J/mol 變?yōu)椋?300.81±22）J/mol，說明皂苷使得疏水相互作用降低，而吉布斯自由能由（-18523.7±320）J/mol 變?yōu)椋?41279.19±1220）J/mol，說明QBS 與β-半乳糖苷酶的結(jié)合是自發(fā)性的且皂苷的加入促進了酶的活性。

3.6 核磁共振波譜法

在原子分辨率下，核磁共振能夠觀察到溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)[69]，因此在研究蛋白質(zhì)與小分子相互作用中被廣泛應用[70-71]。通過核磁共振波譜（Nuclear magnetic resonance，NMR）可以獲得的信息包括：蛋白質(zhì)與小分子發(fā)生相互作用的機理、結(jié)構(gòu)特征、結(jié)合強度以及二者復合物的空間結(jié)構(gòu)和動力學參數(shù)[72]。隨著NMR 技術(shù)的發(fā)展，可分析的蛋白質(zhì)分子量可達50 ku，甚至82 ku[73]。然而由于在水溶液中要求蛋白質(zhì)能夠穩(wěn)定存在，有較高溶解度，不聚合，不降解，所以核磁共振對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析存在一定的局限性。

Shimoyamda 等[74]利用NMR 研究了大豆皂苷和α-乳清蛋白的相互作用，通過計算與皂苷相連的甲基質(zhì)子的弛豫時間，發(fā)現(xiàn)加入蛋白質(zhì)后導致皂苷的弛豫時間降低，證明二者之間存在相互作用且這種作用會加速自旋晶格弛豫。

3.7 計算機模擬分子對接技術(shù)

分子對接（Molecular docking，MD）是利用受體與配體相互作用的“鎖-鑰原理”，將已知三維空間結(jié)構(gòu)的配體放在受體活性位點附近，然后按照幾何互補、能量互補以及化學環(huán)境互補的原則，實時評價配體與受體相互作用的好壞，從而找到二者結(jié)合時能量最低、結(jié)構(gòu)最穩(wěn)的構(gòu)象[75-76]。隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，MD 被廣泛應用與研究皂苷與蛋白質(zhì)相互作用中。因無法考慮pH 值、離子強度等外界環(huán)境對相互作用的影響，因此需要與其它分析技術(shù)進行聯(lián)用，以確定其正確性。

Sathishkumar 等[77]利用分子對接AutoDock 程序就3 種凋亡蛋白（BCL-2、BCL-XL、MCL-1）和12 種人參單體皂苷進行了對接研究，研究發(fā)現(xiàn)人參單體皂苷Rg1、Rg3、Rf 與BCL-2、BCL-XL、MCL-1 能以氫鍵、靜電相互作用發(fā)生結(jié)合，這種結(jié)合降低了凋亡蛋白的表達，從而表明人參皂苷可用于治療癌癥。Tang 等[62]通過模擬分子對接技術(shù)（FlexX 對接軟件）發(fā)現(xiàn)了GEA 與HSA 之間的相互作用，這種相互作用為疏水相互作用，原因是GEA 的甲基與HSA 亞結(jié)構(gòu)域IIA 的疏水殘基（Leu 219、Leu 238、Val 241、Val 216、Trp 214等）相鄰。Khan 等[78]將5 種硫酸鹽皂苷與脲酶之間進行分子對接，發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)活性位點殘基His之間存在氫鍵，而與活性位點殘基Ala 170、Ala 279、Met 318、Leu 319 等之間存在氫鍵和疏水相互作用。

除上述方法之外，表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）、石英晶體微技術(shù)（Quartz crystal microtechnology，QCM）等方法也可用于研究蛋白質(zhì)與皂苷的相互作用。不同相互作用的分析方法都能提供一些信息，然而，由于樣品及儀器自身特點的限制，任何單一方法都無法得到全面解析其相互作用機制，因此需要綜合使用。從表1可以看出，在研究皂苷與蛋白質(zhì)相互作用的方法中，應用較為廣泛的是FS、UV、MD 及CD。研究血清蛋白質(zhì)（HSA、BSA）、人參皂苷的文獻較多，因此在研究皂苷與蛋白質(zhì)相互作用的時候，方法、樣品種類都是制約其發(fā)展的主要原因，此原因可成為未來發(fā)展的方向。

表1 皂苷與蛋白質(zhì)相互作用研究文獻Table 1 Research literature on interaction between saponins and proteins

4 總結(jié)與展望

皂苷作為一種功能性活性成分已被廣泛研究，而對于皂苷與食品中成分的相互作用的研究仍較少。就目前研究的成果來看，皂苷與蛋白質(zhì)相互作用的確切機制并不透徹，其原因主要是二者相互作用受到自身化學結(jié)構(gòu)、外部環(huán)境等多方面因素的影響，需要考慮每種因素對其造成的后果，而食品體系的復雜性又提升了這些分析的難度；大多數(shù)研究僅分析了相互作用對蛋白質(zhì)的影響，并沒有研究對皂苷的活性和結(jié)構(gòu)的變化；分析相互作用的每一種方法都有局限性，無法做到多種方法聯(lián)用，僅能結(jié)合起來初步進行驗證分析。進一步解決上述三方面問題，已經(jīng)成為皂苷-蛋白質(zhì)復合體系未來研究發(fā)展的方向?？傊?，隨著科學技術(shù)的不斷發(fā)展及研究的逐漸深入，人們將會對皂苷-蛋白質(zhì)的機制有更深入的了解，為研究富含皂苷和蛋白質(zhì)的新型復雜食品體系提供理論支持。