超聲輔助提取茶葉中高效氯氟氰菊酯的富集條件優(yōu)化

江 瑋 趙 源 劉慧琳

（北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院 北京 100048）

茶是世界上消費(fèi)最廣泛的飲料，具有特殊的香氣和抗氧化性，對(duì)人體健康有益，其品質(zhì)和安全性也受到人們的普遍關(guān)注[1]。而擬除蟲菊酯類殺蟲劑在我國茶葉、棉花、大豆、花生、果樹、蔬菜等農(nóng)作物的害蟲防治中應(yīng)用廣泛[2-3]，是一類新型仿生農(nóng)藥，相比于有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯類農(nóng)藥，具有高效、低毒，殺蟲譜廣，活性較高的特點(diǎn)。高效氯氟氰菊酯（λ-cyhalothrin）化學(xué)名稱為α-氰基-3-苯氧基芐基-3-（2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基）-2，2-二甲基環(huán)丙烷羧酸酯，是菊酯類殺蟲劑的典型代表，能通過抑制昆蟲神經(jīng)軸突部位的傳導(dǎo)，導(dǎo)致昆蟲興奮過度而死亡[4-5]。近年來的研究表明菊酯類農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人體仍具有潛在危害[6-8]。高效氯氟氰菊酯是一種典型的擬除蟲菊酯，主要用于防治茶葉、蔬菜、菊花、煙草等植物病蟲害。眾所周知，擬除蟲菊酯農(nóng)藥可引起意識(shí)障礙和癲癇發(fā)作，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有影響，并可能具有內(nèi)分泌干擾作用。美國環(huán)境保護(hù)署規(guī)定，擬除蟲菊酯殘留量的最大限量不超過0.05 μg/g。因此，對(duì)于高效氯氟氰菊酯的高效、準(zhǔn)確定量檢測顯得頗為重要。目前，液液萃?。↙LE）[9]、固相微萃?。⊿PME）[10]和攪拌棒吸附萃取（SBSE）[11]等樣品前處理技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，然而有機(jī)溶劑用量大、耗時(shí)長、固相萃取柱價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制了其進(jìn)一步的應(yīng)用[12]。超聲輔助提取技術(shù)是通過超聲波在材料介質(zhì)中傳播，由于連續(xù)的壓縮和周期振動(dòng)引起氣泡破裂，導(dǎo)致空化效應(yīng)，增加樣品中溶劑的滲透并加速分析物的遷移過程[13]，可以更簡易分離和富集樣品中的目標(biāo)物[14-15]。本文通過超聲提取技術(shù)對(duì)樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化，并使用高效液相色譜對(duì)茶葉中高效氯氟氰菊酯的殘留量進(jìn)行檢測，為保證茶葉的質(zhì)量和消費(fèi)者的安全提供一定的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉，商超；高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，阿拉丁試劑（上海）有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈、丙醇，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；二氯甲烷、氯苯，天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙醇、三氯甲烷，北京化工廠；四氫呋喃，西隴科學(xué)股份有限公司；丙酮，國藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司；超純水，屈臣氏飲用水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A 高效液相色譜儀、配SPD-20A 紫外吸收檢測器，日本島津儀器有限公司；KQ-700GVPV 型三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；R-300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦有限公司；抽濾裝置。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 準(zhǔn)確稱取高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品50 mg，將其溶于50 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解定容，搖勻，將其配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，并將其稀釋成所需的濃度，備用。所需溶液均過0.45 nm 的微孔濾膜。

1.3.2 液相色譜條件 根據(jù)Wang 等[26]的方法，并通過預(yù)試驗(yàn)進(jìn)行修改。

色譜柱：Inertsil ODS-C18（150 mm×4.6 mm，4.6 μm）。

流動(dòng)相：水（甲酸1%）-甲醇溶液（15∶85，V∶V）。

紫外檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：5.0 μL；柱溫：30 ℃；流速：0.5 mL/min；梯度洗脫時(shí)間：30 min。

1.3.3 樣品前處理方法 將商業(yè)茶葉（10 g）注入甲醇（100 mL）中，超聲提取1 h，將甲醇提取物過0.45 nm 的微孔濾膜，并在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)濃縮至干燥，將提取物用5 mL 甲醇重新溶解進(jìn)樣。并在樣品中混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度：每種100 μg/L，以確保標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間與樣品中該物質(zhì)的出峰時(shí)間一致。

1.3.4 測定 待儀器穩(wěn)定后，在上述液相條件下進(jìn)行檢測。比較樣品與高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間，確定目標(biāo)物在色譜柱上相應(yīng)的色譜峰。隨后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線生成的方程計(jì)算樣品中高效氯氟氰菊酯的含量。回收率采用空白加標(biāo)的方法測定，計(jì)算方式如下：回收率=測定值/標(biāo)準(zhǔn)加入量×100%[27]，每個(gè)樣品測定3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法和提取溶劑的優(yōu)化

目標(biāo)物的提取通過提取溶劑與目標(biāo)物“相似相溶”原理來完成，與目標(biāo)物的性質(zhì)、樣本的種類及檢測技術(shù)有關(guān)。考察以甲醇、水、三氯甲烷、二氯甲烷和氯苯分別做液液萃取劑和超聲提取劑時(shí)目標(biāo)物的回收情況。分別使用上述溶劑在30 ℃搖床和30 ℃超聲儀里進(jìn)行提取，如表1 所示，液液萃取的回收率普遍低于超聲輔助提取。對(duì)提取溶劑來說，回收率較低的是水；經(jīng)醇提取時(shí)，有雜峰干擾；氯苯和三氯甲烷無雜峰干擾，而回收率低于二氯甲烷，Cao 等[2]的研究也證實(shí)了擬除蟲菊酯在二氯甲烷中有良好的溶解性和穩(wěn)定性，因此選擇二氯甲烷作為茶葉的超聲提取劑。

表1 不同提取方法及提取溶劑的回收率Table 1 Recovery rates of different extraction methods and extraction solvents

2.2 復(fù)溶溶劑的優(yōu)化

分別考察了甲醇、乙醇、丙醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃6 種有機(jī)試劑做復(fù)溶溶劑的效果。如表2所示，丙醇、四氫呋喃有雜質(zhì)峰干擾目標(biāo)物峰圖，其它有機(jī)物的回收率均低于乙醇，因此選擇乙醇做復(fù)溶劑溶解提取物。

2.3 超聲條件的優(yōu)化

2.3.1 超聲功率的優(yōu)化 考察了45，80 kHz 及100 kHz 的超聲頻率對(duì)回收率的影響。如圖1 所示，當(dāng)樣品用不同的超聲波頻率處理時(shí)，目標(biāo)物的回收率沒有顯著差異。隨著超聲頻率的加大，液體壓縮和周期振動(dòng)加快，能加速高效氯氟氰菊酯的提取，然而隨著超聲頻率進(jìn)一步增加至100 kHz，液體的熱效應(yīng)增強(qiáng)，二氯甲烷經(jīng)連續(xù)熱解會(huì)產(chǎn)生無色易揮發(fā)液體，溶劑體積減少，降低了高效氯氟氰菊酯的回收率。

表2 不同復(fù)溶溶劑的回收率Table 2 Recovery rates of different resoluble solvents

2.3.2 超聲提取時(shí)間的優(yōu)化 超聲提取時(shí)間會(huì)對(duì)回收率產(chǎn)生較大的影響，如圖2 所示，其它條件一定時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，回收率先增多，因?yàn)榇郎y組分在有機(jī)相中的溶解需要一定時(shí)間。超聲時(shí)間為40 min 時(shí)，回收率達(dá)到最大值，且與其它超聲時(shí)間的回收率有顯著性差異。隨著超聲時(shí)間的進(jìn)一步延長，目標(biāo)物的回收率反而降低?？梢酝茰y超聲時(shí)間過長引起目標(biāo)物結(jié)構(gòu)改變，加劇了有機(jī)溶劑的揮發(fā)，因此降低了回收率。

2.3.3 超聲溫度的影響 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物遇熱不穩(wěn)定，在高溫下易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，且高溫下有機(jī)試劑的揮發(fā)性較大。為了選擇合適的超聲溫度，考察在10，20，30，40 ℃下超聲時(shí)的目標(biāo)物回收情況，如圖3 所示，超聲溫度對(duì)高效氯氟氰菊酯的回收率有影響，溫度太低時(shí)分子運(yùn)動(dòng)緩慢，阻礙了目標(biāo)物的提取，而溫度太高時(shí)，分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)劇烈，會(huì)導(dǎo)致溶劑損失[28]，不適宜高效氯氟氰菊酯殘留的提取，因此采用20 ℃進(jìn)行樣品預(yù)處理。

圖1 不同超聲頻率對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物回收率Fig.1 Recovery rate of target substance corresponding to different ultrasonic frequencies

圖2 不同超聲時(shí)間對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物回收率Fig.2 Recovery rate of target substance corresponding to different ultrasonic time

圖3 不同超聲溫度對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物回收率Fig.3 Recovery rate of target substance with different ultrasonic temperatures

圖4 不同料液比對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物回收率Fig.4 Recovery rate of target substance with solvent volume of ultrasonic extraction

2.3.4 料液比的優(yōu)化 考察不同料液比對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，一是保證目標(biāo)物在超聲過程中能完全溶于提取溶劑；二是減少轉(zhuǎn)移過程中目標(biāo)物的損失。如圖4 所示，在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)，回收率達(dá)到最大，隨著溶液體積的進(jìn)一步增大，回收率反而下降，可以推測茶葉中其它物質(zhì)的溶解，阻礙了高效氯氟氰菊酯的提取。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測限

用甲醇稀釋質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成質(zhì)量濃度為0.2，0.5，1，5，10，20，50，80，100 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣測定。平行測量每個(gè)濃度3 次，并根據(jù)獲得的峰面積平均值（Y）繪制高效氯氟氰菊酯質(zhì)量濃度（X）標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5），以獲得回歸方程和相關(guān)參數(shù)。本方法的定量限（LOQ）、最小檢出限（LOD）分別根據(jù)10 倍、3 倍信噪比（S/N）計(jì)算得出，相關(guān)信息如表3 所示。

圖5 高效氯氟氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 The standard curve of λ-cyhalothrin

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 3 Linear equation，correlation and detection limit

2.5 實(shí)際樣品測定結(jié)果

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.6 The chromatogram of standard sample

選取了市售的5 種茶葉進(jìn)行實(shí)際樣品檢測和加標(biāo)回收試驗(yàn)，基于上述試驗(yàn)結(jié)果，按最佳條件進(jìn)行樣品預(yù)處理，并依據(jù)1.3.2 節(jié)高效液相色譜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加標(biāo)回收色譜圖如圖6～8 所示。結(jié)果如表4 所示，在3 種茶葉樣品中檢測到了高效氯氟氰菊酯殘留，根據(jù)GB 2763-2016[29]相關(guān)規(guī)定，樣品均符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)校正，測定結(jié)果含有目標(biāo)物的樣品，先經(jīng)二氯甲烷超聲提取除去樣品中可能殘留的目標(biāo)物，二次提取后過液相色譜檢測確保沒有目標(biāo)物殘留，在空白基質(zhì)中加入1 mL 質(zhì)量濃度為1 mg/L 的目標(biāo)物超聲提取后，經(jīng)10 mL 乙醇復(fù)溶后測定回收率。結(jié)果顯示，高效氯氟氰菊酯的平均回收率在76%～103%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.853%。

圖7 茶葉樣品圖Fig.7 The chromatogram of the spiked samples

圖8 茶葉樣品加標(biāo)圖Fig.8 The chromatogram of the real samples

表4 實(shí)際樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=3）Table 4 Recovery experiment of actual sample adding standard（n=3）

3 結(jié)論

本文建立了一種操作簡便、分析速度快、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高的測定茶葉中高效氯氟氰菊酯農(nóng)藥殘留的檢測方法。樣品前處理采用二氯甲烷萃取、乙醇復(fù)溶的方法，最佳超聲條件為：料液比為1∶10（g/mL）、超聲功率80 kHz、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度20 ℃。該方法的回收率、精密度適用于茶葉中高效氯氟氰菊酯殘留量的檢測，且檢出限及定量限均符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)。超聲提取結(jié)合高效液相色譜法由于其檢測精準(zhǔn)和分析快速的優(yōu)勢，能為茶葉中擬除蟲菊酯類的測定提供可行的檢測手段。