新疆哈薩克熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁中游離氨基酸和揮發(fā)性物質(zhì)分析

劉文營(yíng) 李開(kāi)雄 王守偉* 李 享 成曉瑜 喬曉玲

（1 中國(guó)肉類食品綜合研究中心 國(guó)家肉類加工工程技術(shù)研究中心 北京食品科學(xué)研究院 北京 100068 2 石河子大學(xué)食品學(xué)院 新疆石河子 832003）

熏馬腸是哈薩克族居民每年于入冬時(shí)節(jié)加工的傳統(tǒng)馬肉制品，是哈薩克族集中居住地區(qū)特殊環(huán)境和飲食文化的重要載體[1]。隨著“一帶一路”倡議的實(shí)施和發(fā)展，新疆獨(dú)特的區(qū)位優(yōu)勢(shì)和向西開(kāi)放的重要窗口作用[2]，使得熏馬腸等特色民族食品被越來(lái)越多的消費(fèi)者所接觸。相應(yīng)地，熏馬腸等食品加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也必然有助于促進(jìn)地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，對(duì)人們生活水平提高和社會(huì)穩(wěn)定均有裨益[3-4]。

目前，研究者針對(duì)熏馬腸的研究集中于開(kāi)展降鹽加工工藝[5]，生物胺分析[6]，以及與生物胺生成有關(guān)的微生物菌相[7-8]和調(diào)控研究[9]等。加工工藝會(huì)對(duì)熏馬腸脂肪氧化[10]、脂肪酶活力[11]和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[12]產(chǎn)生影響，而顏色[13-14]、滋味[14]和風(fēng)味[14-17]等感官特征都是肉制品品質(zhì)的重要參考，研究者也試圖通過(guò)多種方法來(lái)改善肉制品的感官品質(zhì)[18-19]。然而，目前除少數(shù)研究對(duì)熏馬腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析外[12]，鮮有文獻(xiàn)對(duì)熏馬腸煮制成熟過(guò)程中主體風(fēng)味、味覺(jué)特性和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)釋放等感官品質(zhì)進(jìn)行分析，而肉制品的感官特性又是影響消費(fèi)者消費(fèi)體驗(yàn)和購(gòu)買(mǎi)意愿的決定性因素[20]。鑒于此，本文選取哈薩克族居民以傳統(tǒng)方法制備的熏馬腸作為研究對(duì)象，對(duì)其煮制過(guò)程中湯汁滋味和風(fēng)味物質(zhì)釋放進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熏馬腸，于2018 年12 月采集于新疆維吾爾自治區(qū)伊犁哈薩克自治州伊寧市。熏馬腸的加工工藝：新鮮馬肉經(jīng)去骨和筋膜后，加入食鹽（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%）、白砂糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%）和香辛料（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，胡椒粉、八角粉、花椒粉、姜）后腌制24 h，切為小塊（2 cm×2 cm×2 cm）后灌裝，置于50～70 ℃烘房?jī)?nèi)煙熏12 h。

氯化鉀（KCl）、酒石酸、氯化銀（AgCl）、乙醇、氫氧化鉀（KOH）、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-甲基-3-庚酮（99.9%，CAS 號(hào)13019-20-0），美國(guó)Sigma Aldrich 公司；電極內(nèi)部液、清洗液，日本insent 公司；氮?dú)猓?9.9%），北京如源如泉科技有限公司；茚三酮顯色液（貨號(hào)：299-70501），日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社（Wako）。

1.2 儀器與設(shè)備

Cascada BIO 純水機(jī)，美國(guó)PALL 公司；0.22 μm 微濾膜，美國(guó)PALL 公司；BSA822-CW 天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；F6/10-10G 超細(xì)勻漿器，上海FLUKO 流體機(jī)械制造有限公司；PEN3電子鼻，德國(guó)Airsense 公司；TS5000Z 味覺(jué)分析系統(tǒng)，日本INSENT 公司；L-8900 高速全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司；GC-MS 聯(lián)用儀（TG-Wax MS 極性柱，30 m×0.25 mm，0.25 μm），美國(guó)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Gerstel TDS 半自動(dòng)熱脫附進(jìn)樣器，德國(guó)Gerstel 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熏馬腸蒸煮熟制 熏馬腸經(jīng)溫水清洗后均分為3 組，每組1.0 kg，均切為1 cm 長(zhǎng)小段，按照1∶3 的質(zhì)量比加入純水，置于電磁爐上保持微沸加熱，分別于水沸騰0，15，30，45，60，75，90，105，120 min 取樣分析，樣品分別標(biāo)記 為m0，m15，m30，m45，m60，m75，m90，m105 和m120。

1.3.2 煮制過(guò)程中湯汁主體風(fēng)味分析 基于電子舌特定傳感器會(huì)對(duì)某類化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生特異性響應(yīng)，不同類型傳感器陣列組合可以實(shí)現(xiàn)不同樣品主體風(fēng)味的特征分析，參考文獻(xiàn)[13，21]的方法，取10.0 mL 湯汁于4 ℃離心（5 000 r/min，5 min）后取2.0 mL 無(wú)油上清液，裝瓶密封后置于樣品室檢測(cè)。

試驗(yàn)做3 次重復(fù)，3 次重復(fù)樣品混勻后做5個(gè)平行測(cè)試，樣品室內(nèi)工作溫度為50 ℃，運(yùn)行時(shí)間為90 s，均取70 s 時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.3 煮制過(guò)程中湯汁味覺(jué)特性分析 參考文獻(xiàn)[14]的方法，將20.0 mL 湯汁于4 ℃離心（12 000 r/min，10 min）后取中層澄清無(wú)油樣品，按照1∶5 質(zhì)量比加入純水，均質(zhì)混勻后離心（12 000 r/min，5 min），上清液過(guò)濾（0.22 μm）后上機(jī)檢測(cè)。

檢測(cè)條件：樣品體積為60.0 mL，基線調(diào)整時(shí)間為30 s，單樣品測(cè)定周期為330 s，每次測(cè)試后使用基準(zhǔn)液進(jìn)行沖洗，沖洗時(shí)間為30 s，采集時(shí)間為30 s，做4 次重復(fù)，取后3 次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

試驗(yàn)做3 次重復(fù)，每次3 個(gè)平行，結(jié)果標(biāo)記為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.4 煮制過(guò)程中湯汁游離氨基酸含量分析 參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2016[22]和文獻(xiàn)[23-24]的方法，采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸組分分析。

檢測(cè)條件：分離柱為4.6 mm ID×60 mm L；柱溫為57 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm 和570 nm；緩沖液流速為0.4 mL/min；反應(yīng)液為茚三酮試劑，流速為0.35 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL，反應(yīng)單元溫度為140 ℃。

試驗(yàn)做3 次重復(fù)，每次3 個(gè)平行，結(jié)果標(biāo)記為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.5 煮制過(guò)程中湯汁揮發(fā)性成分分析 參考文獻(xiàn)[14，25-26]的方法，略有修改，均勻取2.0 mL 湯汁，經(jīng)固相吸附柱富集后采用熱脫附-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)組分分析。

固相吸附柱吸附工作條件為50 ℃，恒溫30 min，同時(shí)添加0.182 μg 2-甲基-3-庚酮作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

TDS 程序：初始溫度40 ℃，以40 ℃/min 升溫至210 ℃，保持5 min；

CIS 程序：初始溫度-100 ℃，以10 ℃/min 升溫至215 ℃，分流比為20∶1；

GC-MS 程序：初始溫度40 ℃，以5 ℃/min 升溫至200 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min 升溫至220 ℃，保持3 min。氦氣流速1.0 mL/min，質(zhì)譜傳輸線溫度260 ℃，離子源溫度280 ℃，質(zhì)量掃描范圍40～600 u。

試驗(yàn)做3 次重復(fù)，每次取10.0 mL 樣品混勻后取2.0 mL 進(jìn)行測(cè)試，以2-甲基-3-庚酮（99.9%，CAS 號(hào)13019-20-0，0.182 μg/μL），添加量為1.0 μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Winmuster 軟件進(jìn)行產(chǎn)品風(fēng)味的主成分分析（Principal component analysis，PCA）和線性判別分析（Linear discriminant analysis，LDA）；在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析時(shí)，依據(jù)揮發(fā)性成分的CAS號(hào)進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)檢索分析（http：//www.chemindex.com/）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均由SPSS 9.1 進(jìn)行誤差性分析（F=0.05），由Origin8.0 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁中游離氨基酸組分變化

氨基酸組分，尤其是必需氨基酸含量，是評(píng)價(jià)肉制品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高低的重要依據(jù)，同時(shí)也在風(fēng)味呈現(xiàn)上起著重要作用[23，27-29]，氨基酸也是功能特性呈現(xiàn)的重要載體[30]，肉制品中的游離氨基酸含量受水解度等因素的影響[31]。

熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁游離氨基酸組分如表1、圖1 所示，湯汁中游離氨基酸隨煮制時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，其中m0，m15，m30，m60，m75，m90之間差異不顯著（P＞0.05），m15，m30，m45，m60，m75，m90 之間差異不顯著（P＞0.05），m30，m45，m60，m75，m90，m105，m120 之間差異不顯著（P＞0.05），其它組之間具有顯著性差異（P＜0.05），m105 的游離氨基酸含量最大，與m120 差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁總游離氨基酸含量變化Fig.1 Variation of free amino acid content of smoked horse sausage soup during cooking

天冬氨酸、谷氨酸是呈現(xiàn)鮮味的主要成分[32]，天冬氨酸含量與總氨基酸含量變化趨勢(shì)相似，隨著煮制時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，m0 天冬氨酸含量最低，m0，m15，m30 之間差異不顯著（P＞0.05），m15，m30，m60，m75 之間差異不顯著（P＞0.05），m30，m45，m60，m75，m90 之間差異不顯著（P＞0.05），m45，m60，m75，m90，m105 之間差異不顯著（P＞0.05），m90，m105，m120 之間差異不顯著（P＞0.05），其它組樣品均有顯著性差異（P＜0.05），其中m120 的天冬氨酸含量最高；谷氨酸含量隨著煮制時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，m0 與m15 之間差異不顯著（P＞0.05），m15，m30，m75 之間差異不顯著（P＞0.05），m30，m45，m60，m75，m90，m105，m120之間差異不顯著（P＞0.05），其中m120 的谷氨酸含量較高。

蘇氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸是呈現(xiàn)甜味的主要成分，精氨酸和脯氨酸是呈現(xiàn)苦味的主要物質(zhì)[32]。隨著煮制時(shí)間的延長(zhǎng)，丙氨酸含量逐漸增加，m0 含量較低，與m15，m30 之間差異不顯著（P＞0.05），m30，m45，m60，m75 之間差異不顯著（P＞0.05），m45，m60，m75，m90，m105，m120 之間差異不顯著（P＞0.05），其中m120 丙氨酸含量最高；精氨酸、甘氨酸與之變化趨勢(shì)相似，總體呈增加趨勢(shì)；相較于m0，m120 絲氨酸含量雖有所降低但不顯著（P＞0.05）；脯氨酸、羥脯氨酸變化趨勢(shì)不明顯，m120脯氨酸含量較高。

隨著煮制時(shí)間的延長(zhǎng)，纈氨酸含量總體呈增加趨勢(shì)，m0，m15 差異不顯著（P＞0.05），m15，m30差異不顯著（P＞0.05），m30，m45，m60，m75 差異不顯 著（P＞0.05），m45，m60，m75，m90，m105，m120差異不顯著（P＞0.05），其它組之間有著顯著差異（P＜0.05）；其它如甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸，亦與前述氨基酸變化趨勢(shì)相似，總體呈增加趨勢(shì)；湯汁中的半胱氨酸含量總體呈降低趨勢(shì)，m0，m15，m45，m60，m75 差異不顯著（P＞0.05），m15，m30，m45，m60，m75，m90，m105，m120 差異不顯著（P＞0.05）；而賴氨酸變化趨勢(shì)不明顯，總體來(lái)說(shuō)，m120 賴氨酸含量較低。

如表2 所示，湯汁中呈鮮味、呈愉悅甜味、呈愉悅苦味的氨基酸百分比差異均不顯著，然而，湯汁中氨基酸總量呈增加趨勢(shì)，即呈味氨基酸的含量隨著煮制時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。常亞楠等[33]在煮制雞湯時(shí)，亦發(fā)現(xiàn)雞湯中游離氨基酸成分呈增加趨勢(shì)；劉登勇等[34]在對(duì)扒雞鹵湯反復(fù)煮制時(shí)，發(fā)現(xiàn)煮制次數(shù)越多游離氨基酸含量越多；Buscailhon等[35]在火腿成熟過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)游離氨基酸含量會(huì)從3.6%迅速增加到16.6%，在終產(chǎn)品中含量為4.4%，呈增加趨勢(shì)，與本文結(jié)果相似。

2.2 熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁味覺(jué)特性變化

味覺(jué)特性是肉制品重要的質(zhì)量屬性之一，也是決定消費(fèi)者再次購(gòu)買(mǎi)的重要參考[36]，采用陣列傳感器開(kāi)展食品味覺(jué)的分析，是味覺(jué)特性的重要量化手段之一[37]。熏馬腸煮制過(guò)程中，呈味物質(zhì)釋放過(guò)程如表3 所示，在煮制過(guò)程中，咸味值呈增加趨勢(shì)，其中m0，m15，m30，m45，m60，m105 之間差異不顯著（P＞0.05），m30，m45，m60，m75，m105 之間差異不顯著（P＞0.05），m30，m60，m75，m90，m105，m120 之間差異不顯著（P＞0.05），m120 咸味值最高，與其它組具有顯著性差異（P＜0.05）；鮮味物質(zhì)的釋放過(guò)程也呈增加趨勢(shì)，其中m0 鮮味值最低，m120 鮮味值最高，均與其它組有顯著差異（P＜0.05），m15 和m30 差異不顯著（P＞0.05），m45，m60，m90，m105 之間差異不顯著（P＞0.05），m60，m75，m90，m105 之間差異不顯著（P＞0.05）；湯汁的味覺(jué)豐富度呈增加趨勢(shì)，m120 的味覺(jué)豐富度最高（P＜0.05），m0，m15，m30，m45，m60，m105 之間差異不顯著（P＞0.05），m30，m45，m60，m75，m105之間差異不顯著，m30，m60，m75，m90，m105 之間差異不顯著（P＞0.05）；湯汁的苦味值隨著煮制時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，其中，m75 的苦味值最小，與m0 沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），m30，m60，m90，m120 的苦味值高于m0，差異不顯著（P＞0.05），m15，m30，m45，m90，m120 的苦味值差異不顯著（P＞0.05），m15，m30，m45，m105 的苦味值差異不顯著（P＞0.05）；湯汁的苦味回味值變化趨勢(shì)不明顯，其中m15 的苦味回味值最低（P＜0.05），m45 的苦味回味值最高（P＜0.05）；湯汁的澀味值和澀味回味值變化趨勢(shì)不明顯，其中m120 的澀味值最高（P＜0.05），澀味回味值也最高（P＜0.05）。

游離氨基酸具有顯著的呈味作用[38]，鹽分含量與游離氨基酸含量具有顯著的正相關(guān)[39-40]，熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁咸味值呈增加趨勢(shì)，與2.1 節(jié)中游離氨基酸總量的變化趨勢(shì)相似。產(chǎn)品的澀味值會(huì)受其它組分的影響，如蔗糖、氯化鈉、檸檬酸或咖啡因[41]，而本文中澀味值未呈現(xiàn)規(guī)律性變化，可能與煮制過(guò)程中發(fā)生的水解作用等因素有關(guān)[42]。

2.3 熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁主體風(fēng)味變化

熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁主體風(fēng)味差異如圖2所示，由主成分分析結(jié)果顯示，各樣品在PC1 與PC2 的中方差貢獻(xiàn)率為97.06%，具有良好的獨(dú)立性，風(fēng)味主體成分能代表各自產(chǎn)品的風(fēng)味特征。m0，m120 與其它組均無(wú)交集，m15 與m45 有微小交集，m30，m45，m60 和m75 存在不同程度的交集，m90 和m105 存在部分交集，即煮制加工對(duì)湯汁主體風(fēng)味成分產(chǎn)生了影響，其中m15，m30，m45，m60 和m75 較為相似。煮制時(shí)間達(dá)到90 min后，湯汁主體風(fēng)味成分發(fā)生了顯著變化，然而與煮制105 min 仍有相同組分，當(dāng)煮制時(shí)間達(dá)到120 min 時(shí)，主體風(fēng)味成分與其它組均有顯著差異，與2.1 節(jié)中游離氨基酸含量的變化趨勢(shì)相似。樣品在LD1 和LD2 方向上的總方差貢獻(xiàn)率為85.27%，且在LD1 和LD2 方向上，雖然部分樣品組存在部分交集，但是均能夠進(jìn)行樣品區(qū)分，即隨煮制時(shí)間的延長(zhǎng)，湯汁主體風(fēng)味成分發(fā)生變化，通過(guò)風(fēng)味主成分分析能夠?qū)Σ煌M樣品進(jìn)行識(shí)別分析，與2.1節(jié)中游離氨基酸含量變化趨勢(shì)相似。

圖2 熏馬腸煮制過(guò)程中湯中的主體風(fēng)味特征分析Fig.2 Main flavor characteristics analysis of smoked horse sausage soup during cooking

2.4 熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁揮發(fā)性物質(zhì)組分變化

熏馬腸煮制過(guò)程中湯汁揮發(fā)性成分見(jiàn)表4、圖3 所示，湯汁中的揮發(fā)性物質(zhì)含量呈先增加后降低的趨勢(shì)，其中m15 揮發(fā)性物質(zhì)含量最高，尤其是酚類和芳香族類物質(zhì)的含量較高，這些物質(zhì)也是金華火腿[43]、清爽型黃酒[44]等食品的重要風(fēng)味成分。2.1 節(jié)中游離氨基酸含量呈增加趨勢(shì)，其中m105 含量較高，而湯汁中揮發(fā)性物質(zhì)含量在后期呈降低趨勢(shì)，其中m120 含量最低，說(shuō)明煮制時(shí)間的延長(zhǎng)有助于湯汁滋味的豐富，然而不利于香味的保留。

圖3 熏馬腸湯汁揮發(fā)性物質(zhì)含量變化Fig.3 Variation of volatile substances of smoked horse sausage soup

湯汁揮發(fā)性風(fēng)味成分中，均檢測(cè)到的組分為苯甲醛、軟脂酸甲酯，兩者均為重要的香氣成分[45-46]，其中苯甲醛含量呈降低趨勢(shì)，軟脂酸甲酯的含量則呈先增加后降低的趨勢(shì)。所有樣品中均檢測(cè)出己醛，己醛是脂肪氧化的產(chǎn)物之一，其含量與氧化程度有關(guān)[47-48]，說(shuō)明熏馬腸樣品制備過(guò)程中發(fā)生了氧化反應(yīng)，且脂肪氧化產(chǎn)物在馬肉制品主體風(fēng)味形成上有重要作用[49]。各組產(chǎn)品揮發(fā)性物質(zhì)組分存在差異，說(shuō)明改變煮制時(shí)間可以獲得不同風(fēng)味的產(chǎn)品，與2.3 節(jié)的結(jié)果一致。

湯汁中尚存在2-癸烯-1-醇、正戊醇你、2-乙基己醇、十二醛等變化趨勢(shì)不明顯的揮發(fā)性物質(zhì)，這與熏馬腸的加工過(guò)程及其原輔料的添加有關(guān)，也與復(fù)雜的微生物菌相有關(guān)[8]，造就了熏馬腸獨(dú)特的風(fēng)味特征。

表4 熏馬腸煮制過(guò)程中湯中的揮發(fā)性物質(zhì)（ng）Table 4 Volatile substances content of smoked horse sausage soup during cooking（ng）

（續(xù)表4）

3 結(jié)論

1）通過(guò)對(duì)熏馬腸煮制過(guò)程中的滋味和風(fēng)味物質(zhì)釋放進(jìn)行研究，表明湯汁煮制時(shí)間不同形成不同的揮發(fā)性物質(zhì)組分，均具有獨(dú)特的風(fēng)味特征，通過(guò)風(fēng)味主體成分分析能夠?qū)Σ煌a(chǎn)品進(jìn)行區(qū)分。依據(jù)揮發(fā)性成分中含量及變化，PC1 為酚類和芳香族類化合物呈現(xiàn)的特征，其次是酯類或醛類。湯汁中游離氨基酸含量隨著煮制時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，而呈鮮味氨基酸、呈愉悅甜味氨基酸和呈愉悅苦味氨基酸的百分比差異不顯著。湯汁咸味值、豐富度、鮮味值均呈逐漸升高的趨勢(shì)，苦味值、苦味回味值、澀味回味值變化不規(guī)律，煮制120 min 時(shí)澀味值顯著升高。

2）熏馬腸煮制過(guò)程中，湯汁味覺(jué)特征越來(lái)越明顯，而風(fēng)味強(qiáng)度會(huì)逐漸降低，即湯汁最終呈現(xiàn)給消費(fèi)者的主要是味覺(jué)享受。結(jié)合煮制過(guò)程中游離氨基酸含量、滋味特征、風(fēng)味特性的變化，煮制105 min 時(shí)，湯汁中的游離氨基酸含量較多，風(fēng)味物質(zhì)得到一定保持，咸味值、鮮味值和豐富度均處于較高水平，且此時(shí)湯汁的澀味沒(méi)有明顯增加，較適宜作為加工參數(shù)。