‘禾荔’優(yōu)質(zhì)晚熟突變體‘GLL-1’類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶基因LcUFGT的克隆與表達分析

張樹偉 彭宏祥

摘 要：‘GL為‘禾荔中選育出的一個優(yōu)質(zhì)晚熟芽變新種質(zhì)。為探討‘GL果實成熟期延遲的遺傳基礎(chǔ)，該研究以‘禾荔和‘GL為實驗材料，克隆花色素苷合成途徑結(jié)構(gòu)基因LcUFGT，并對其進行生物信息學預(yù)測及分析，同時通過qRT-PCR對LcUFGT基因在果實發(fā)育不同階段的表達進行研究，分析LcUFGT的表達對突變體果實發(fā)育速度的影響。結(jié)果表明：（1）LcUFGT基因ORF長1 359 bp，編碼453個氨基酸，推測蛋白質(zhì)分子量約為50.16 kD。（2）序列比對發(fā)現(xiàn)所編碼蛋白與‘禾荔等荔枝品種高度保守，在蛋白的C端具有PSPG盒。（3）在果實發(fā)育成熟進程中，‘禾荔和‘GL果皮逐漸退綠轉(zhuǎn)紅，兩者LcUFGT基因的表達量都呈先上升后下降的表達趨勢，然而，‘禾荔 LcUFGT基因的表達量在花后56 d顯著增加，突變體‘GL LcUFGT基因的表達量在花后67 d顯著增加，LcUFGT基因在突變體‘GL中顯著上升表達的時間比‘禾荔延遲，且與果實發(fā)育延遲基本一致。以上結(jié)果表明，LcUFGT基因在荔枝果皮著色過程中發(fā)揮重要作用，是果實著色的關(guān)鍵基因之一，突變體‘GL中的延遲表達是引起突變體晚熟的原因之一。

關(guān)鍵詞：晚熟突變體，LcUFGT基因，果實發(fā)育，花色素苷合成，表達分析

中圖分類號：Q943文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）01-0128-08

Abstract：‘GL is an excellent late-maturing bud sport germplasm，which was selected from ‘Heli. To reveal the genetic basis of late-maturing，in this study，‘Heli and ‘GL were used as the materials. The LcUFGT which is a structural gene of anthocyanin synthesis pathway was cloned and analyzed by bioinformatic methods. The corelation between LcUFGT and the character of late-maturing in ‘GL and? the expression of LcUFGT during the development of litchi fruit were analyzed by qRT-PCR. The results were as follows：（1） ORF of LcUFGT gene was 1 359 bp，which encoded 453 amino acids with the molecular weight of 50.16 kD. （2） LcUFGT gene was conservative in ‘GL and other litchi cultivars，and a PSPG box existed in the C-terminal. （3） With the development of litchi fruit，the color of pericarp began to turn from green to red; the expression of LcUFGT was increased and then decreased in both ‘GL and ‘Heli; the expression of LcUFGT was obviously increased at 56 d and 67 d after flowering of ‘Heli and ‘GL，respectively; the expression of LcUFGT had a delayed increase in ‘GL than that of ‘Heli，which was consistent with the late-maturing of fruits. It is supposed that LcUFGT plays an important role in color changes of pericarp，and it is one of the key genes to regulate coloration of pericarp. At the same time，the delay-expression of LcUFGT maybe the main reason of late-maturing of ‘GL.

Key words：late maturity mutant，LcUFGT，fruit development，anthocyanin synthesis，expression analysis

荔枝（Litchi chinensis）是我國華南地區(qū)種植面積最大的木本果樹，是華南地區(qū)農(nóng)民經(jīng)濟收入的主要來源之一。目前，生產(chǎn)上缺乏特早熟和特晚熟優(yōu)質(zhì)荔枝品種，造成荔枝集中在六七月份成熟上市，產(chǎn)期過于集中，造成農(nóng)民豐產(chǎn)而不豐收。‘禾荔是廣西傳統(tǒng)的栽培品種，品質(zhì)優(yōu)良，并且豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)，突變體‘GL不僅保留了‘禾荔的優(yōu)良特性，而且成熟期延遲，較‘禾荔晚熟15 d（李平等，2016），是調(diào)節(jié)荔枝品種栽培結(jié)構(gòu)拉長鮮果供應(yīng)期的優(yōu)異資源，同時也是荔枝熟期育種及果實發(fā)育理論研究的重要材料。

‘GL一個最重要突變特征是其果皮著色顯著延遲，成熟期延后。荔枝果皮著色是一個花色苷合成積累的過程，最終果皮呈現(xiàn)出鮮艷的紅色。自然界中花色苷以穩(wěn)定的花青素的配糖體形式存在，常見的有六種：花葵素（pelargonidin）、矢車菊素（cyanidin）、飛燕草素（delphinidin）、芍藥素（peonidin）、矮牽?；ㄉ兀╬etunidin）和錦葵色素（malvidin）（王延玲等，2012;李金星和胡志和，2013;肖長城等，2014）。荔枝果皮中的花色苷主要是矢車菊素-3-蕓香糖苷（劉亮等，2013）。

植物花色苷合成途徑已經(jīng)明確，在苯丙烷類代謝的基礎(chǔ)上經(jīng)由類黃酮合成途徑完成。涉及的結(jié)構(gòu)基因依次有苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）、查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）、黃烷酮3-羥化酶（Flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、二氫黃酮醇還原酶（Dihydroflavonol reductase，DFR）、花色素苷合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）和類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP glucose：flavonoid 3-O-glycosyl transferase，UFGT）等（Winkel-Shirley，2001）。在荔枝中UFGT酶活性與果皮花色素苷合成顯著正相關(guān)，LcUFGT是荔枝果皮紅色形成的關(guān)鍵基因（王惠聰?shù)龋?004;Li et al.，2016）?；ㄉ盏纳锖铣墒苓z傳因素和環(huán)境因素共同影響，遺傳因素主要影響花色苷合成的種類和合成的時間。突變體‘GL與‘禾荔有高度相似遺傳背景，但是果實成熟期顯著不同，本研究從‘GL中分離UFGT基因，探討‘GL果實成熟延遲的遺傳基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為‘禾荔和其芽變‘GL，樣品采自桂平市麻垌鎮(zhèn)（芽變發(fā)現(xiàn)地），樣品為果實發(fā)育不同時期的果皮（花后30、42、56、67和79 d），采摘洗凈后將果皮放入錫紙袋，液氮速凍帶回實驗室，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 荔枝果皮總RNA提取和cDNA合成

果皮總RNA提取采用華越洋植物總RNA提取試劑盒（北京），用RNA free DNase（TaKaRa）消化DNA殘留，分別用1.0%瓊脂糖凝膠和全自動核酸蛋白分析儀檢測RNA純度和濃度，cDNA第一鏈的合成采用Invitrogen的cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.3 LcUFGT基因的獲得

根據(jù)NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）登入的荔枝UFGT基因序列信息（GenBank No. HQ402914），用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物P1U和P1L（表1），以合成的cDNA第一鏈為模板，用ExTaq酶（TaKaRa）擴增。具體PCR反映體系和擴增程序參照產(chǎn)品說明書。PCR產(chǎn)物檢測純化后克隆到pMD20-T載體，進行測序。

1.4 LcUFGT基因生物信息學分析

NCBI ORF finder（（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/）在線分析LcUFGT的開放閱讀框，用ExPASy ProtParam在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）分析LcUFGT的理化性質(zhì)，用Wolf PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線預(yù)測LcUFGT蛋白的定位。利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽分析。用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線工具預(yù)測其跨膜結(jié)構(gòu)域，通過NCBI中BLAST（（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）工具進行同源性比對分析，用DNAMAN software（version 5.2.2.0）軟件進行多序列比對，利用MEGA5.0采用鄰近相接法（neighbour joining）步長值1 000構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 LcUFGT基因的表達水平分析

根據(jù)獲得的LcUFGT基因序列，用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計定量引物（表1），Real-Time PCR反應(yīng)在羅氏LightCycler 480 system上完成，試劑采用SYBR Green Real-time PCR Master Mix （Takara），反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)程序如下：95 ℃，60 s;95 ℃，15 s;55 ℃，20 s;72 ℃，30 s;40個循環(huán)。以LcActin作為內(nèi)參基因，每個樣品3次重復(fù)，運用2-ΔΔCT （Livak & Schmittgen，2001）計算LcUFGT基因的表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 LcUFGT基因的克隆

經(jīng)檢測，從果皮提取的總RNA質(zhì)量較好，A260/A280比值在1.80～2.0之間，電泳檢測條帶清晰無降解（圖1）。逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA用于克隆LcUFGT基因，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，可見一條清晰條帶（圖1），純化后連接到pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過藍白斑篩選克隆測序，獲得荔枝LcUFGT基因序列信息（圖2）。

2.2 LcUFGT基因的序列分析

荔枝LcUFGT同源基因ORF長1 359 bp，編碼453個氨基酸，用ExPASy ProtParam在線工具預(yù)測LcUFGT蛋白分子式為C2266H3549N607O643S18，相對分子質(zhì)量是50 160.87，等電點為7.70，脂溶指數(shù)為91.04，是脂溶性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)為44 053，屬于不穩(wěn)定蛋白，親水性指數(shù)為-0.067，是疏水性蛋白。用Wolf PSORT在線工具預(yù)測LcUFGT蛋白定位在細胞質(zhì)。SignalP 4.1 Server在線預(yù)測表明該蛋白不存在信號肽。用TMHMM Server v. 2.0在線工具預(yù)測其跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明LcUFGT蛋白無跨膜區(qū)?？梢酝茰y，LcUFGT蛋白合成后不經(jīng)轉(zhuǎn)運，在細胞質(zhì)中行使催化功能。

在蛋白數(shù)據(jù)庫中對LcUFGT序列進行blast，結(jié)果顯示荔枝LcUFGT與草莓（Q66PF5）、白梨（A0A0A0P547）、蘋果（Q9XES4）、山葡萄（B6DU53）、藍莓（X5HZM4）、櫻桃（F2VR51）、葡萄柚（C5MR71）和克里曼丁橘（V4TSJ3）等的一致性在53%～61%之間。LcUFGT具有TDP結(jié)合位點，其三維結(jié)構(gòu)類型為GT-B類，在C-端具有一個由44個氨基酸殘基組成的PSPG盒，PSPG盒是糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合糖基供體的區(qū)域，其中第22位、第23位和第44位氨基酸在選擇糖基供體中發(fā)揮重要作用，LcUFGT的PSPG第22位為色氨酸，可定位UDP-葡萄糖，第23位絲氨酸在UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶中保守性強，第44位谷氨酰胺在葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶中保守性很強，推測LcUFGT以UDP-葡萄糖為主要糖基供體的葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（圖3）。

用MEGA5.0鄰近相接法對LcUFGT蛋白及其他物種UFGT進行系統(tǒng)進化樹分析，從圖4可以看出，荔枝LcUFGT同源性最高，與柑橘類葡萄柚、甜橙和克里曼丁橘的UFGT有較近的親緣進化關(guān)系;來自同一科的UFGT進化關(guān)系較近，薔薇科草莓、梨、蘋果、月季和櫻桃等UFGT聚為一類;山葡萄、圓葉葡萄和河岸葡萄的UFGT聚為一類。

2.3 LcUFGT基因的表達分析

UFGT是荔枝果皮花色素苷合成的關(guān)鍵酶之一，熒光定量分析顯示結(jié)果見圖5?！瓽L突變體和‘禾荔中，LcUFGT均隨荔枝果實發(fā)育和著色增加表達量先上升后下降，在果實發(fā)育前期表達量維持較低水平，果實發(fā)育進入轉(zhuǎn)色期表達量顯著增加，接近成熟時表達量顯著降低?；ê?6～67 d是‘禾荔果實花色苷快速積累的時期，此時LcUFGT表達量顯著增加;‘GL突變體果實著色延遲，LcUFGT的表達也延遲到67 d顯著增加。因此，LcUFGT的表達與‘禾荔、‘GL的果實著色進程一致，推測‘GL果實著色延遲與LcUFGT的表達延遲有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

荔枝LcUFGT蛋白含有453個氨基酸殘基，是一種存在于細胞質(zhì)基質(zhì)的非分泌型蛋白，有類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶保守序列PSPG盒，該保守序列是糖基供體的結(jié)合域，LcUFGT的PSPG盒第22位色氨酸，說明其糖基供體主要是UDP-葡萄糖。LcUFGT在進化關(guān)系上與柑橘類葡萄柚、甜橙和克里曼丁橘較近，但是是否具有相同的功能，還有待進一步研究。

‘GL突變體果實發(fā)育遲緩，較母株果實成熟期延遲15 d左右，而荔枝果實成熟的主要標志之一即為果皮花色苷的積累。UFGT是花色素苷合成的最后一個關(guān)鍵酶，使不穩(wěn)定的花青素轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的花青苷，蘋果、梨、草莓和葡萄等果樹中，UFGT活性與花色素合成顯著正相關(guān)（Kobayashi et al.，2001; Griesser et al.，2008; Onik et al.，2018），抑制荔枝果皮UFGT酶活性可以抑制花青苷合成。已有研究結(jié)果表明，桂味荔枝果皮中，LcUFGT的表達量呈直線增加，在采收時略微降低（魏永贊等，2014）;妃子笑LcUFGT的表達量隨著果皮顏色加深表達量逐漸增加（Wei et al.，2011）;糯米糍LcUFGT基因在紅色果皮和嫩葉中表達量高于其他綠色組織，并且LcUFGT表達量隨果實發(fā)育逐漸增加，LcUFGT與荔枝果皮著色進程顯著正相關(guān)（王惠聰?shù)龋?004;Wei et al.，2011;Lai et al.，2014）。本研究與前人研究結(jié)果一致，‘禾荔及其突變體‘GL的果皮中LcUFGT表達趨勢與果皮著色進程正相關(guān)，隨著果實發(fā)育進入轉(zhuǎn)色期，LcUFGT表達量增加，并且‘GL突變體LcUFGT表達上升期比‘禾荔延遲，與果實發(fā)育延遲一致。因此，我們推測，LcUFGT是‘GL突變體果實發(fā)育延遲的關(guān)鍵基因之一。

VvUFGT是葡萄花色苷合成的關(guān)鍵酶，白色和紅色葡萄漿果的發(fā)育過程中，檢測花色苷合成相關(guān)基因的表達發(fā)現(xiàn)VvUFGT僅在紅色品種中表達（Boss et al.，1996），進一步研究發(fā)現(xiàn)白色和紅色葡萄品種的UFGT基因序列沒有差異，這可能與VvUFGT的調(diào)控基因變異有關(guān)（Kobayashi et al.，2001，2002）。本研究從‘禾荔及其突變體‘GL中克隆LcUFGT基因，兩者序列一致性100%，沒有變異。花色素苷的合成受到結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因的協(xié)同調(diào)控，需要進一步研究LcUFGT的上游調(diào)控基因，找到LcUFGT基因表達上升期延遲的原因，為研究‘GL果實成熟期延遲的遺傳基礎(chǔ)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

BOSS PK，DAVIES C，ROBINSON SP，1996. Analysis of the expression of anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L. cv. Shiraz grape berries and the implications for pathway regulation[J]. Plant Physiol，111：1059-1066.

GRIESSER M，HOFFMANN T，BELLIDO ML，et al.，2008. Redirection of flavonoid biosynthesis through the down-regulation of an anthocyanidin glucosyltransferase in ripening strawberry fruit[J]. Plant Physiol，146：1528-1539.

KOBAYASHI S，ISHIMARU M，DING CK，et al.，2001. Comparison of UDP glucose：flavonoid 3-O-glucosyltransferase （UFGT） gene sequences between white grapes （Vitis vinifera） and their sports with red skin[J]. Plant Sci，160：543-550.

KOBAYASHI S，ISHIMARU M，HIRAOKA K，et al.，2002. MYB related genes of the Kyoho grape （Vitis labruscana） regulate anthocyanin biosynthesis[J]. Planta，215：924-933.

LAI B，LI XJ，HU B，et al.，2014. LcMYB1 is a key determinant of differential anthocyanin accumulation among genotypes，tissues，developmental phases and ABA and light stimuli in Litchi chinensis[J]. PLoS ONE，9（1）：e86293.

LI JX，HU ZH，2013. Advances in research on anthocyanins of blueberry[J]. J Nucl Agric Sci，27（6）：817-822. [李金星，胡志和，2013. 藍莓花青素的研究進展[J]. 核農(nóng)學報，27（6）：817-822.]

LI P，ZHONG MZ，DING F，et al.，2016. Screening and identification of a new late-maturing litchi mutation GL[J]. Chin Trop Agric，6：46-49. [李平， 鐘敏芝，丁峰，等，2016. 特晚熟荔枝優(yōu)良芽變新種質(zhì)‘GL篩選鑒定[J]. 中國熱帶農(nóng)業(yè)，6：46-49.]

LI XJ，ZHANG JQ，WU ZC，et al.，2016. Functional characterization of a glucosyltransferase gene，LcUFGT1，involved in the formation of cyanidin glucoside in the pericarp of Litchi chinensis[J]. Physiol Plant，156（2）：139-149.

LIU L，CAO SQ，XIE BJ，2013. Purification and structural identification of anthocyanins and oligomeric flavanols from litchi pericarp[J]. J Chin Inst Food Sci Technol，13（4）：191-201. [劉亮，曹少謙，謝筆鈞，2013. 荔枝果皮中花色苷及低聚黃烷醇類化合物的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定[J]. 中國食品學報，13（4）：191-201.]

LIVAK KJ，SCHMITTGEN TD，2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT methods[J]. Methods，25（4）：402-408.

ONIK JC，HU XJ，LIN Q，et al.，2018. Comparative transcriptomic profiling to understand pre-and post-ripening hormonal regulations and anthocyanin biosynthesis in early ripening apple fruit[J]. Molecules，23（8）：1908.

WANG A，TAN D，TATSUKI M，et al.，2009. Molecular mechanism of distinct ripening profiles in “Fuji” apple fruit and its early maturing sports[J]. Postharvest Biol Technol，52（1）： 38-43.

WANG HC，HUANG XM，HU GB，et al.，2004. Studies on the relationship between anthocyanin biosynthesis and related enzymes in litchi pericarp[J]. Sci Agric Sin，37（12）：2028-2032. [王惠聰，黃旭明，胡桂兵，等，2004. 荔枝果皮花青苷合成與相關(guān)酶的關(guān)系研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，37（12）：2028-2032.]

WANG YL，ZHANG YM，F(xiàn)ENG SQ，et al.，2012. The mechanism of red coloring difference between skin and cortex in Malus sieversii f. neidzwetzkyana （Dieck） Langenf[J]. Sci Agric Sin，45（13）：2771-2778.[王延玲，張艷敏，馮守千，等，2012. 新疆紅肉蘋果果皮果肉呈色差異機理[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，45（13）：2771-2778.]

WEI YZ，ZHANG HN，LAI B，et al.，2014. Effect of abscisic acid and CPPU on the coloration of lychee pericarp[J]. J Fruit Sci，31（4）：653-659. [魏永贊，張紅娜，賴彪，等，2014. 脫落酸和吡效隆對荔枝果皮著色的影響[J]. 果樹學報，31（4）：653-659.]

WINKEL-SHIRLEY B，2001. Flavonoid biosynthesis，a colorful model for genetics，biochemistry，cell biology，and biotechnology[J]. Plant Physiol，126：485-493.

XIAO CC，LI JM，YAO GF，et al.，2014. Characteristics of components and contents of anthocyanin in peel of red-skinned pear fruits from different species[J]. J Nanjing Agric Univ，37（4）：60-66. [肖長城，李甲明，姚改芳，等，2014. 不同紅梨品種果皮中花色素苷組分及含量特征分析[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學學報，37（4）：60-66.]

（責任編輯 何永艷）