基于葉綠體基因證據(jù)的民族藥滇白珠復(fù)合群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

李依容 唐麗萍 楊淑達(dá) 陸露

摘 要：滇白珠是我國(guó)重要的民族藥用植物，廣泛分布于長(zhǎng)江以南地區(qū)，是一個(gè)分類(lèi)困難的復(fù)合群。為了探討其種下分類(lèi)關(guān)系，該文對(duì)滇白珠復(fù)合群（包括毛滇白珠、禿果白珠和滇白珠3個(gè)變種）進(jìn)行網(wǎng)羅式采樣，基本覆蓋了該復(fù)合群在中國(guó)的分布范圍，同時(shí)包括菲律賓和馬來(lái)西亞的各1個(gè)居群，共計(jì)81個(gè)居群241個(gè)個(gè)體，通過(guò)聯(lián)合兩個(gè)變異位點(diǎn)適中的葉綠體片段rpl33-psaJ和trnL-rpl32，構(gòu)建基于最大似然法（Maximum Likelihood）和貝葉斯法（Bayesian Inference）的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以及Neighbor-Net法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果表明：滇白珠復(fù)合群內(nèi)具有明顯的遺傳差異，這種差異性相比形態(tài)，與地域分布相關(guān)性更大。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，滇白珠復(fù)合群分為3個(gè)支系。其中：一支包括中國(guó)臺(tái)灣和菲律賓南達(dá)沃的居群，為變種禿果白珠，符合前人分類(lèi)結(jié)果;一支包括分布于橫斷山脈區(qū)域的居群，由變種毛滇白珠和滇白珠組成;剩余一支包括分布于華東南區(qū)域的居群，同樣由變種毛滇白珠和滇白珠組成。分子證據(jù)支持基于形態(tài)分類(lèi)的禿果白珠作為變種，而不支持毛滇白珠作為變種的處理。這樣的遺傳分化式樣可能是由地理隔離導(dǎo)致，這一結(jié)果為民族藥滇白珠的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和保護(hù)利用奠定了分類(lèi)學(xué)框架。然而，變種滇白珠居群間的譜系發(fā)生關(guān)系卻尚未得到很好地解決，特別是無(wú)法明晰華東南大部分居群間的遺傳分化格局，需要進(jìn)一步補(bǔ)充樣本通過(guò)譜系地理學(xué)手段，并尋找分辨率更高的核基因分子標(biāo)記進(jìn)行更深入的研究。

關(guān)鍵詞：滇白珠復(fù)合群，葉綠體DNA，系統(tǒng)發(fā)育，種內(nèi)遺傳差異，種內(nèi)界定，地理隔離

中圖分類(lèi)號(hào)：Q949文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：As an important ethnical medicinal plant in China，Gaultheria leucocarpa var. yunnanensis is a taxonomically difficult complex and widely distributed throughout south of the Yangtze River. In order to understand its intraspecific relationship，we sampled 241 individuals in 81 populations of G. leucocarpa var. yunnanensis complex （i.e.，G. leucocarpa var. crenulata，G. leucocarpa var. psilocarpa and G. leucocarpa var. yunnanensis） representing all Chinese varieties and covering almost recorded distribution ranges in China. One population of G. leucocarpa var. psilocarpa from the Philippines and one population of G. leucocarpa var. leucocarpa from Malaysia were also included. Based on the data from two plastid DNA loci with variable sites in appropriate number，i.e.，rpl33-psaJ and trnL-rpl32，we reconstructed phylogenetic trees using both Maximum Likelihood and Bayesian Inference methods，and phylogenetic network using Neighbor-Net method. The results were as follows：There was a distinct genetic differentiation in the G. leucocarpa var. yunnanensis complex，and this differentiation was more correlated with geographical distribution rather than morphology. This complex was mainly divided into three clades. One clade was composed of populations from Taiwan of China and the Davao del Sur of Philippines that were previously categorized as G. leucocarpa var. psilocarpa; one clade included populations of the G. leucocarpa var. yunnanensis and G. leucocarpa var. crenulata with a distribution in the Hengduan Mountains region; and the remaining clade included the populations mainly distributed in the southeastern range of China，which was composed of G. leucocarpa var. yunnanensis and G. leucocarpa var. crenulata as well. Molecular evidence supported G. leucocarpa var. psilocarpa was treated as a variety but did not support G. leucocarpa var. crenulata as a variety. Such genetic differentiation pattern may be caused by geographical isolation. This result lays a basic taxonomic framework for the evaluation and protection of germplasm resources for this ethnical medicinal plant. However，the relationships among populations of G. leucocarpa var. yunnanensis has not been well resolved in this study. In particular，it is still unable to clarify genetic differentiation pattern among most populations in Southeast China. Therefore，it is necessary to further carry out phylogeographic study at population level using higher variable nuclear markers in future.

Key words：Gaultheria leucocarpa var. yunnanensis complex，cpDNA，phylogeny，intraspecific genetic difference，intraspecific delimitation，geographic isolation

滇白珠（Gaultheria leucocarpa var. yunnanensis）是白果白珠（G. leucocarpa）的變種，隸屬于杜鵑花科（Ericaceae）越桔亞科（Vaccinioideae）白珠樹(shù)族（Gaultherieae）白珠樹(shù)屬（Gaultheria Kalm & L.）（Kron et al.，2002）。在國(guó)內(nèi)廣泛分布于長(zhǎng)江流域以南各省區(qū)，包括臺(tái)灣島和海南島，生長(zhǎng)在海拔3 500 m以下的針闊混交林下。滇白珠是我國(guó)重要的民族藥用植物，為很多地區(qū)（特別是西南地區(qū)）的白族、彝族、侗族、傈僳族、苗族、納西族、水族、瑤族、壯族、布依族10 個(gè)民族習(xí)用（馬小軍等，2001）。滇白珠也是我國(guó)醫(yī)藥界的戰(zhàn)略性資源，市場(chǎng)需求廣泛，該植物含多種化學(xué)成分，目前被開(kāi)發(fā)的相關(guān)藥物有主治眩暈癥的‘滇白珠糖漿（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20040088）、治療風(fēng)濕腫痛的‘金骨蓮片（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20080203）、具有活血祛瘀、消腫止痛功效的‘復(fù)方透骨香軟膏（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026850）等;其枝、葉富含芳香油（水楊酸甲酯，為0.5%～0.8%），是工業(yè)化提取精油的良好原料。

與滇白珠同屬于白珠樹(shù)屬的芳香白珠（G. fragrantissima）、五雄白珠（G. semi-infera）、紅粉白珠（G. hookeri）、尾葉白珠（G. griffithiana）等，因其不同程度地含有水楊酸甲酯而被混作滇白珠的基原使用（喬文林，2013）。但是，這些植物均不含重要抗炎活性成分—滇白珠樹(shù)苷（Gaultherin）（Liu et al.，2013）。上述4種植物與滇白珠在形態(tài)上具有明顯差異，容易辨識(shí)，藥源鑒定不會(huì)造成較大困難。然而，滇白珠基原本身的次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)及含量差異性較大，趙玉娟等（2002）、馬小軍等（2002）、喬文林（2013）、Liu et al.（2015）等對(duì)不同基原/產(chǎn)地的滇白珠開(kāi)展了化學(xué)成分相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)化合物及其含量具有顯著地域性差異，為該植物的資源開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論參考。但是，這些工作主要聚焦在藥物化學(xué)成分含量的研究上，卻往往忽略了基原調(diào)查，以及生物學(xué)（包括遺傳學(xué)）特性與地理分布關(guān)系的研究。

就滇白珠本身而言，雖然該植物形態(tài)變異不大但是遺傳分化顯著（陸露，2009），是一個(gè)分類(lèi)困難的復(fù)合群，是水平和垂直空間分布最廣的國(guó)產(chǎn)白珠樹(shù)屬植物，其余的種均集中分布于喜馬拉雅-橫斷山區(qū)（Fang & Stevens，2005）。除了滇白珠以外，白果白珠還包括其他5個(gè)變種，我國(guó)境內(nèi)有毛滇白珠（G. leucocarpa var. crenulata）和禿果白珠（G. leucocarpa var. psilocarpa）（分布于中國(guó)臺(tái)灣）2個(gè)變種（Fang & Stevens，2005）。這3個(gè)國(guó)產(chǎn)變種果實(shí)均為黑紫色，構(gòu)成了滇白珠復(fù)合群，均可入藥，且均為民族藥滇白珠的基原。滇白珠復(fù)合群的葉型、毛被、花部結(jié)構(gòu)和果實(shí)形態(tài)有一定程度變異但不顯著，其分類(lèi)處理一直以來(lái)倍受爭(zhēng)議（Copeland，1932;Sleumer，1967;Ying，1976;徐廷志，1991;Fang & Stevens，2005;Fritsch et al.，2008）。除了毛滇白珠明顯被毛以外，其余2個(gè)國(guó)產(chǎn)變種即滇白珠和禿果白珠還在形態(tài)上較難相互辨別，僅依靠蒴果是否被毛所區(qū)別。同時(shí)，滇白珠變種內(nèi)形態(tài)變異有時(shí)大于變種間變異，為其分類(lèi)學(xué)處理增加了難度。

滇白珠復(fù)合群具有明顯的遺傳分化，廣域分布的滇白珠和Flora of China（Fang & Stevens，2005）中作為滇白珠異名處理的屏邊白珠（G. leucocarpa var. pingbienensis）（狹域分布于云南省屏邊縣）形態(tài)相近。近年來(lái)，利用分子手段對(duì)滇白珠復(fù)合群展開(kāi)的研究揭示了復(fù)合群內(nèi)部分變種的系統(tǒng)關(guān)系：葉綠體基因trnL-trnF和rpl16序列中的一些插入/缺失對(duì)譜系界定起到了重要作用，聯(lián)合分析高度支持了變種屏邊白珠與白果白珠原變種構(gòu)成一支，而變種滇白珠卻與形態(tài)有別的變種毛滇白珠聚成另一支，這兩個(gè)分支構(gòu)成姐妹群關(guān)系（陸露，2009）。這些結(jié)果顯示出滇白珠復(fù)合群形態(tài)和遺傳的不一致，基于傳統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)無(wú)法明晰滇白珠復(fù)合群的種內(nèi)分類(lèi)問(wèn)題。經(jīng)野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，滇白珠和毛滇白珠雖然在形態(tài)上以毛被區(qū)分，但兩者分布范圍和生長(zhǎng)環(huán)境卻相似，常?；焐?，且一些滇白珠的幼株莖葉也常常被毛。因此，了解滇白珠復(fù)合群的遺傳分化格局對(duì)重新認(rèn)識(shí)基于形態(tài)劃分的變種具有重要意義，亟需對(duì)該類(lèi)群開(kāi)展遺傳分化格局與地域、形態(tài)的相關(guān)性研究。本研究首次對(duì)滇白珠復(fù)合群在中國(guó)境內(nèi)進(jìn)行了大范圍取樣，幾乎涵蓋了中國(guó)境內(nèi)滇白珠復(fù)合群的分布區(qū)域，同時(shí)包括東南半島的菲律賓和馬來(lái)西亞各1個(gè)居群，共計(jì)81個(gè)居群 （表1，圖1）。其中，在中國(guó)的云南武定（WD）和貴州印江（YHA）分別采集1個(gè)毛滇白珠居群，中國(guó)臺(tái)灣（HXQ）和菲律賓南達(dá)沃（F）分別采集1個(gè)禿果白珠居群，以及馬來(lái)西亞鼓亨（WH）的1個(gè)白果白珠原變種居群。選用進(jìn)化速率相對(duì)快的葉綠體DNA非編碼區(qū)序列rpl33-psaJ和trnL-rpl32，首次開(kāi)展滇白珠復(fù)合群的遺傳分化和種下系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究，進(jìn)而為滇白珠基原界定和之后化學(xué)活性成分的地域性研究提供遺傳學(xué)理論框架。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究共收集了滇白珠復(fù)合群81個(gè)居群和1個(gè)芳香白珠居群（作為外類(lèi)群）的分子材料，分別采自中國(guó)云南（17，其中WD居群為毛滇白珠）、中國(guó)貴州（20，其中YHA居群為毛滇白珠）、中國(guó)四川（3）、中國(guó)重慶（2）、中國(guó)湖北（3）、中國(guó)湖南（11）、中國(guó)江西（4）、中國(guó)福建（4）、中國(guó)廣東（9）、中國(guó)廣西（5）、中國(guó)臺(tái)灣（1，禿果白珠）、菲律賓南達(dá)沃（1，禿果白珠）、馬來(lái)西亞鼓亨（1，白果白珠原變種），其中有76個(gè)滇白珠居群;芳香白珠（FX）采自中國(guó)云南大理。每個(gè)居群隨機(jī)挑選3個(gè)個(gè)體[注：峨眉山（EMS）僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)個(gè)體]，包括外類(lèi)群共計(jì)244個(gè)個(gè)體（表1）。采集材料時(shí)，居群內(nèi)每個(gè)個(gè)體至少相隔10 m。新鮮葉片立即用變色硅膠干燥，憑證標(biāo)本儲(chǔ)存于昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本儲(chǔ)藏室中。

1.2 引物的篩選

在引物篩選階段，我們從白果白珠變種已有各居群中根據(jù)地理相對(duì)距離較遠(yuǎn)原則挑選出中國(guó)云南騰沖（滇白珠）、中國(guó)云南武定（毛滇白珠）、中國(guó)貴州平塘（滇白珠）、中國(guó)廣西大瑤山（滇白珠）、中國(guó)臺(tái)灣玉山（禿果白珠）、馬來(lái)西亞鼓亨（白果白珠原變種）共6個(gè)居群，每個(gè)居群隨機(jī)選取2個(gè)個(gè)體，共12個(gè)個(gè)體。從杜鵑花科近緣的山茶科（Theaceae）中，選取了進(jìn)化速率較快的10個(gè)葉綠體基因片段（P37、P45、P57、P58、P60、P61、P64、P69、P70即rpl33-psaJ、P72）（Yang et al.，2013）進(jìn)行分析，最終選出rpl33-psaJ（F：5′-TCCGGATGCGTTAACATTCCCCTT-3′，R：5′-CCTTGGAAGGGTAACACACAGGTGC-3′）和在杜鵑花科中擁有較高分辨率的trnL-rpl32（trnL：5′-CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT-3′，rpL32：5′-CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC-3′）（Shaw et al.，2007）作為開(kāi)展系統(tǒng)發(fā)育研究的分子片段。

1.3 DNA提取與PCR擴(kuò)增

植物總DNA的提取使用改進(jìn)的4×CTAB法，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)DNA主帶的整齊度和亮度判斷DNA的質(zhì)量，用紫外分光光度計(jì) （NanoDropND-1000，Thermo Fisher Scientific，Delaware，USA）測(cè)定DNA的濃度和純度，用ddH2O稀釋至30～50 ng·μL-1以備后續(xù)PCR擴(kuò)增使用。擴(kuò)增體系：10 μL PCR Master Mix（2×）（Thermo Scientic），9 μL ddH2O，正反向引物（10 ng·μL-1）各0.4 μL，1 μL 模板DNA。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性 4 min; 94 ℃ 變性 45 s，52 ℃（trnL-rpl32）/60 ℃（rpl33-psaJ）退火 1 min，72 ℃ 延伸45 s，循環(huán)35次;72 ℃ 延伸 10 min。取 2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。剩余的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，采用 5.5 μL的反應(yīng)體積，包括 1.5 μL的測(cè)序混合物（BigDye）、1 μL的測(cè)序引物、1 μL的純化PCR產(chǎn)物和 2 μL的雙蒸水。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 40 s;95 ℃ 20 s、50 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min 30 s，共 35個(gè)循環(huán)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過(guò)75%乙醇和無(wú)水乙醇純化后，加入10 μL的雙蒸水充分溶解，用ABI 3730 xl 自動(dòng)測(cè)序儀（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California，USA）進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得序列用Sequencher軟件進(jìn)行拼接。拼接好的序列首先逐一對(duì)每一個(gè)變異位點(diǎn)的原始峰圖進(jìn)行校對(duì)，確認(rèn)無(wú)誤后用Se-al軟件進(jìn)行比對(duì)構(gòu)建矩陣，根據(jù)頭尾的缺失情況對(duì)序列做適當(dāng)調(diào)整，矩陣中的插入/缺失（indel）處理為單次進(jìn)化事件。為解析目前所獲各居群間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，我們對(duì)兩個(gè)葉綠體片段rpl33-psaJ和trnL-rpl32進(jìn)行了聯(lián)合分析。本研究用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）和貝葉斯法（Bayesian Inference，BI）構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，以比較不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的異同，并計(jì)算支持率（Stamatakis et al.，2008）。利用軟件jmodeltest 2.110（Darriba，2012），分別檢測(cè)到兩個(gè)葉綠體基因片段的最佳堿基替代模型都為GTR。最大似然法依據(jù)DNA序列突變是隨機(jī)的這種假設(shè)，將構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)所用到的分枝長(zhǎng)度與推斷肯定發(fā)生的額外突變結(jié)合起來(lái)，利用特定突變概率的所有假設(shè)共同組成一個(gè)演化模型（model of evolution），選取具有最大可能性的樹(shù)作為引證，分析其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并計(jì)算支持率（Bootstrap，BP）。用貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系樹(shù)時(shí)，需對(duì)4個(gè)平行進(jìn)化鏈進(jìn)行1 000萬(wàn)代運(yùn)算，每10 000代保存一棵進(jìn)化樹(shù)，分別去掉最初和最后的25%系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)作為“burn-in”。每個(gè)分支的支持率由保存的進(jìn)化樹(shù)中出現(xiàn)的后驗(yàn)概率（posterior probability，PP）表示，后驗(yàn)概率值PP<0.95視為低或較弱的支持，0.95～1.00視為高或好的支持。兩種建樹(shù)方法都通過(guò)CIPRES 網(wǎng)上建樹(shù)平臺(tái)（https：//www.phylo.org/）實(shí)現(xiàn)，最后得到的基于ML和BI法的嚴(yán)格一致樹(shù)用Figtree 1.43軟件（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/）查看。為了直觀地判斷滇白珠復(fù)合群的系統(tǒng)演化關(guān)系，用Splitstree4軟件運(yùn)用鄰接網(wǎng)法（Neighbor-Net）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡(luò)（Bryant，2003），Bootstrapping通過(guò)1 000次重復(fù)，支持率大于50%的顯示在支上。

2 結(jié)果與分析

2.1 從滇白珠復(fù)合群241個(gè)樣本和外類(lèi)群芳香白珠3個(gè)樣本獲得rpl33-psaJ和trnL-rpl32片段rpl33-psaJ片段比對(duì)矩陣長(zhǎng)678 bp，共有241條序列，一致位點(diǎn)（conserved site）有665個(gè)，變異位點(diǎn)（variable site）有13個(gè)，含簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)（parsimony informative site）有12個(gè);trnL-rpl32片段比對(duì)矩陣長(zhǎng)599 bp，共有241條序列，一致位點(diǎn)有592個(gè)，變異位點(diǎn)有7個(gè)，含簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有5個(gè)?；趦蓚€(gè)葉綠體片段rpl33-psaJ和trnL-rpl32的聯(lián)合分析矩陣長(zhǎng)度為1 277 bp，一致位點(diǎn)有1 257個(gè)，變異位點(diǎn)有20個(gè)，含簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)有17個(gè)。滇白珠復(fù)合群聯(lián)合矩陣的G+C含量為30.70%～30.90%，其中包括一段在trnL-rpl32序列上長(zhǎng)度為31 bp的插入/缺失序列AATTGAATTTCATATTGATTAGTCCAAAACA，該插入/缺失序列為臺(tái)灣居群（HXQ）所特有。此外，3條長(zhǎng)1 215 bp的芳香白珠序列，G+C含量為31.11%，該序列存在一段31 bp的插入/缺失序列AATTGAATTTCATATTGATTAGTCCAAAACA（與HXQ居群的插入/缺失序列一致但位置不同）。圖1顯示了貝葉斯法（BI）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，該樹(shù)與通過(guò)最大似然法（ML）構(gòu)建的樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，在BI樹(shù)上標(biāo)注了ML樹(shù)的支持率，Neighbor-Net構(gòu)建的滇白珠復(fù)合群系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡(luò)關(guān)系如圖2所示。

2.2 基于ML和BI的分析結(jié)果

2.2.1 廣域分布的滇白珠復(fù)合群存在豐富的遺傳變異 ML和BI系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致，滇白珠復(fù)合群大致可以分為三個(gè)大的支系（BP=100%，PP=1.00，圖1）。由圖1可知，中國(guó)臺(tái)灣（HXQ）和菲律賓南達(dá)沃（F）的禿果白珠居群在較基部的位置聚為第一分支（A）（BP=91%，PP=1.00），是較早分化出來(lái)的類(lèi)群，與其它所有居群相區(qū)別，隨后兩個(gè)居群內(nèi)的個(gè)體又各自聚為一支（HXQ：BP=100%，PP=1.00;F：BP=98%，PP=1.00）;剩余居群可以分為兩個(gè)主要分支，第二分支為分布在橫斷山脈的中國(guó)的云南、四川、廣西、廣東、福建的部分個(gè)體以及馬來(lái)西亞鼓亨（WH）居群聚為的一支，具有較高支持率（BP=90%，PP=1.00）。這一分支進(jìn)而分為4個(gè)小的亞分支：馬來(lái)西亞鼓亨的白果白珠原變種（WH）位于較基部的位置，單獨(dú)形成一支（B1）與其他居群分開(kāi)（BP=96%，PP=1.00）;中國(guó)的廣西大瑤山（DYS-1）和廣東鴨兜山（DYDS-1，DYDS-2）聚為一支（B2）（BP = 97%，PP=1.00）;中國(guó)的福建龍巖（FDQS-1）和福建漳州（FMHS-1）聚為一支（B3）（BP=99%，PP=1.00）;剩下的個(gè)體分別來(lái)自中國(guó)的云南和四川的AN（2）、DL（1）、QJ（1）、WD（3）、EMS（1）、XC（3）、SB（3）居群，為該大支的主要成分（B4）。其他剩余的居群聚為第三分支（BP=89%，PP=1.00），這一分支進(jìn)而分為3個(gè)小的亞分支，即第一支（C1）是位于較基部的屏邊大圍山的兩個(gè)個(gè)體（DWS-1，DWS-2），得到了較高的支持率（BP=98%，PP=1.00），福建龍巖兩個(gè)居群的兩個(gè)個(gè)體（FGT-3和FHJS-3）聚為一支（C2）（BP=95%，PP=1.00），剩下的居群個(gè)體構(gòu)成一個(gè)大的分支（C3），序列占總數(shù)的80%（201條序列），這些居群個(gè)體之間的關(guān)系尚未得到很好地解決，只有貴州石阡（SWT-1）和云南曲靖的（ZY-2）聚為一支（C4）而與其他序列分開(kāi)（BP=95%，PP=0.97）。Neighbor-Net的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯示滇白珠復(fù)合群也可以大致分為三個(gè)支系（圖2）。由圖2可知，中國(guó)臺(tái)灣、菲律賓南達(dá)沃和馬來(lái)西亞鼓亨的居群以及分布在橫斷山脈區(qū)域的居群聚為一支（紅色圈注），支持率較低;與ML和BI系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果一致，中國(guó)臺(tái)灣的禿果白珠居群和地理上相距更近的福建滇白珠居群未聚在一支。大多數(shù)來(lái)自華東南地區(qū)的居群聚為一支（藍(lán)色圈注）。滇東南地區(qū)來(lái)自屏邊大圍山的居群（DWS）單獨(dú)構(gòu)成一支（紫色圈注）。

2.2.2 滇白珠復(fù)合群的遺傳式樣和毛被這一表型式樣不相符 ML和BI分析均顯示采自云南武定（WD）和貴州印江（YHA）的毛滇白珠居群并沒(méi)有聚為一支而是分別和采自相同區(qū)域的滇白珠居群構(gòu)成一支（圖1），Neighbor-Net結(jié)果也顯示毛滇白珠與大部分相同區(qū)域的滇白珠居群聚在一起（圖2）。

3 討論

3.1 滇白珠復(fù)合群的遺傳變異

物種的形成和分化通常源于群體間建立的基因流屏障，主要有遺傳分化造成的生殖隔離、地質(zhì)及氣候歷史變遷造成的地理隔離、繁育系統(tǒng)的復(fù)雜性等（Levin，2003;Mallet，2007;Rieseberg & Willis，2007）。本研究中，滇白珠復(fù)合群分布廣泛，遺傳差異相對(duì)形態(tài)來(lái)說(shuō)，與地理分布相關(guān)性更大。從地形上來(lái)看，它橫跨了二級(jí)、三級(jí)階梯，從橫斷山脈南端一直沿長(zhǎng)江流域分布到東南沿海地區(qū)，海拔上達(dá)2 500 m、下至390 m。野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該植物大多生長(zhǎng)在空曠的土坡或巖壁上，呈帶狀局限分布于較高海拔地帶。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，滇系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上標(biāo)注了基于ML分析的支持率與BI分析的后驗(yàn)率：大于或等于50%的支持率（BP，分枝上左側(cè)）和大于或等于50%的后驗(yàn)率（PP，分枝上右側(cè)）標(biāo)注在分支上，支持率和后驗(yàn)率用逗號(hào)隔開(kāi)。滇白珠復(fù)合群相關(guān)變種及外類(lèi)群系統(tǒng)位置通過(guò)不同顏色標(biāo)識(shí)，F(xiàn)X為外類(lèi)群芳香白珠（藍(lán)色），WD和YHA為毛滇白珠（紅色），HXQ和F為禿果白珠（綠色），WH為白果白珠原變種（黃色），其余為滇白珠（黑色）。分支A包括HXQ和F居群所有個(gè)體;分支B1包括WH居群所有個(gè)體，分支B2包括DYS和DYD居群部分個(gè)體，分支B3包括FDQS和FMHS居群部分個(gè)體，分支B4包括云南和四川的AN、DL、QJ、WD、EMS、XC、SB居群的全部或部分個(gè)體;分支C1包括DWS的部分個(gè)體，分支C2包括FGT和FHJS居群的部分個(gè)體，分支C4包括SWT和ZY的部分個(gè)體，剩下的居群構(gòu)成一個(gè)大的分支C3。系統(tǒng)樹(shù)下部展示了白果白珠原變種和滇白珠復(fù)合群3個(gè)國(guó)產(chǎn)變種的植株照片。

The Bootstraps from the ML analysis （tree not shown） and the posterior probabilities are both shown on the branches. Numerals on the left side of branches indicate the bootstrap values （≥50%） and those on the right side indicate the posterior probability values （≥50%），and the BP and PP values are separated with comma. The placements of populations of varieties within the complex and outgroup are indicated by branches in various colors，F(xiàn)X （G. fragrantissima） in blue，WD and YHA （G. leucocarpa var. crenulata） in red，HXQ and F （G. leucocarpa var. psilocarpa） in green，WH （G. leucocarpa var. leucocarpa） in yellow，and all the rest （G. leucocarpa var. yunnanensis） in black. Clade A includes all individuals of the HXQ and F populations; clade B1 includes all individuals of the WH population，clade B2 includes partial individuals of the DYS and DYD populations，clade B3 includes partial individuals of the FDQS and FMHS populations，clade B4 includes all or partial individuals of the AN，DL，QJ，WD，EMS，XC and SB populations; clade C1 includes partial individuals of the DWS population，clade C2 includes partial individuals of the FGT and FHJS populations，and clade C4 includes partial individuals of the SWT and ZY populations，and the remaining individuals form a large clade C3. Images beneath the phylogenetic tree show the close-up of plants of three varieties of China within the G. leucocarpa var. yunnanensis complex.大于或等于50%的支持率顯示在分支上。主要分為三個(gè)支系，即橫斷山脈+中國(guó)臺(tái)灣、菲律賓南達(dá)沃、馬來(lái)西亞鼓亨支系（紅色圈注，右側(cè)）、華東南支系（藍(lán)色圈注，左側(cè)）、大圍山支系（紫色圈注，中央）。其中：橫斷山脈分支包括中國(guó)云南的AN、WD（毛滇白珠）、QJ、SB、DL居群，中國(guó)四川的XC、EMS居群;華東南支系包括中國(guó)云南的PB、XS、ZY、TC、BS、MG、JD、YJ、WX、FY居群，中國(guó)貴州（包括毛滇白珠YHA居群）、廣西、廣東、湖南、湖北、重慶、江西、福建的所有居群;大圍山支系僅包括中國(guó)云南的DWS居群。

Bootstrap values （≥ 50%） based on 1 000 replicates are indicated above branches. Three major clades are divided，i.e.，the clade from Taiwan of China，the Davao del Sur of Philippines，Pahang of Malaysia plus the Hengduan Mountains （colored in red，on the right），the clade from the southeastern China （colored in blue，on the left），and the clade from Dawei Mountain （colored in purple，in the middle）. Populations from the Hengduan Mountains clade include AN，WD （G. leucocarpa var. crenulata），QJ，SB，and DL from Yunnan and XC and EMS from Sichuan. The clade from the southeastern China is composed of populations from Yunnan （PB，XS，ZY，TC，BS，MG，JD，YJ，WX and FY） and all the populations from Guizhou （include YHA of G. leucocarpa var. crenulata），Guangxi，Guangdong，Hunan，Hubei，Chongqing，Jiangxi and Fujian in China. Populations from Dawei Mountain only include the population DWS in Yunnan of China.

白珠主要以根莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，由根延伸出芽形成新植株（馬小軍等，2001），且馬來(lái)西亞的白果白珠原變種為雄蕊先熟和自花授粉（Sleumer，1967）。滇白珠復(fù)合群呈現(xiàn)出的遺傳分化可能是地形的阻隔導(dǎo)致了地理隔離，處于橫斷山脈的居群受高大山脈如哀牢山、點(diǎn)蒼山、無(wú)量山、怒山、大涼山等阻隔，而處于東南地區(qū)的滇白珠居群卻分布在海拔相對(duì)較低的大起伏中山如南嶺、大瑤山、十萬(wàn)大山、云開(kāi)大山等，地勢(shì)較橫斷山脈相對(duì)為平坦和連綿（尤聯(lián)元等，2013），滇白珠復(fù)合群可能因此沒(méi)有產(chǎn)生較大的遺傳變異。

3.2 滇白珠復(fù)合群的系統(tǒng)演化關(guān)系

本研究采用的兩個(gè)葉綠體片段rpl33-psaJ和trnL-rpl32在滇白珠復(fù)合群中變異位點(diǎn)較少，雖然有多個(gè)地區(qū)的序列沒(méi)有形成分支，但解決了部分群體的系統(tǒng)演化關(guān)系。本研究中，中國(guó)臺(tái)灣（HXQ）和菲律賓南達(dá)沃（F）的禿果白珠居群得到了分子系統(tǒng)學(xué)較好的支持，這從遺傳上支持了該變種的成立，也支持了子房壁及蒴果不被毛是劃分該變種重要的共衍征（分類(lèi)性狀），果實(shí)形態(tài)特征被認(rèn)為在白珠樹(shù)屬中具有重要的分類(lèi)學(xué)意義（Lu et al.，2010）。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，禿果白珠是滇白珠復(fù)合群中較早分化出來(lái)的變種，但和具有地理隔離的橫斷山脈居群更近緣的關(guān)系并沒(méi)有得到較好的支持（支持率低）。因此，與橫斷山脈區(qū)域居群之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究。在1991年中文版《中國(guó)植物志》中，屏邊白珠因其葉片形態(tài)和質(zhì)地的差異而被作為白珠的一個(gè)變種處理，后Flora of China（Fang & Stevens，2005）將其作為滇白珠的異名處理。但是，本研究分子系統(tǒng)發(fā)育顯示，屏邊大圍山的兩個(gè)個(gè)體DWS-1和DWS-2與其他滇白珠居群分屬于兩個(gè)分支，且位于較基部而較早地分化出來(lái);從網(wǎng)狀進(jìn)化關(guān)系看，屏邊大圍山的居群被單獨(dú)劃分為一支，一定程度上支持了該變種遺傳學(xué)上的獨(dú)立性。

基于傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)，毛滇白珠因其枝、花梗密被均勻分布的硬毛，葉邊緣被緣毛而被單獨(dú)作為一個(gè)變種，區(qū)別于滇白珠（Fang & Stevens，2005）。但是，本研究分子系統(tǒng)發(fā)育顯示，采自云南武定的毛滇白珠和采自云南安寧的滇白珠聚為一支，同時(shí)采自貴州印江的毛滇白珠和同地區(qū)的滇白珠聚為一支。環(huán)境因素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)產(chǎn)生一定的影響，表現(xiàn)出豐富的形態(tài)、生理和發(fā)育等表型（Sultan，2000）。根據(jù)我們野外觀察發(fā)現(xiàn)，生活在背陰環(huán)境的滇白珠居群被毛情況多于向陽(yáng)環(huán)境，且葉片較小，植株較纖細(xì)。本研究分子證據(jù)表明，同域分布的有毛被及無(wú)毛被滇白珠在遺傳上沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明被毛這一性狀與遺傳分化的相關(guān)性不大。形態(tài)與遺傳的不一致性在許多植物中也有報(bào)道，如在薔薇科金露梅屬植物中，金露梅（Dasiphora floribunda）和銀露梅（D. glabra）因?yàn)榛ò觐伾牟煌环譃閮蓚€(gè)物種，但研究發(fā)現(xiàn)基于花瓣顏色對(duì)金露梅屬植物進(jìn)行物種劃分界定沒(méi)有得到遺傳數(shù)據(jù)的支持（Ma et al.，2014）。此外，還有生活在保加利亞的苦苣苔科植物Haberlea ferdinandi-coburgii和H. rhodopensis也出現(xiàn)了形態(tài)變異和遺傳分化不一致的現(xiàn)象（Petrova et al，2014）。對(duì)于滇白珠復(fù)合群這樣的遺傳和形態(tài)不一致性，我們推測(cè)可能的原因如下：（1）滇白珠毛被的生長(zhǎng)發(fā)育容易受到環(huán)境的影響，這種變異不穩(wěn)定，與譜系遺傳無(wú)關(guān)，毛滇白珠只能作為滇白珠的一種生態(tài)類(lèi)型;（2）葉綠體片段沒(méi)有足夠的分辨率且僅為母系遺傳，無(wú)法檢測(cè)是否存在雜交和網(wǎng)狀進(jìn)化，需要篩選合適的核基因片段或開(kāi)展簡(jiǎn)化基因組分析進(jìn)行更深入的研究。

3.3 滇白珠復(fù)合群的種質(zhì)資源保護(hù)和利用

盡管滇白珠復(fù)合群分布廣泛而資源豐富，在一定時(shí)期內(nèi)可以承受一定規(guī)模的開(kāi)發(fā)利用。但是，該植物并非棲生地的優(yōu)勢(shì)種，競(jìng)爭(zhēng)性差、生長(zhǎng)相對(duì)緩慢（灌木）、生物量有限、氣候變化敏感性高，連年的工業(yè)化采挖會(huì)導(dǎo)致區(qū)域性資源很快枯竭。根據(jù)野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南中部、東北部和四川大涼山的居群正處于嚴(yán)重的人為干擾中，該區(qū)域的滇白珠復(fù)合群經(jīng)歷了當(dāng)?shù)匾恍┧幉墓具B續(xù)性整株（包括地下根部）收購(gòu)，并伴有民間藥用采挖。這些居群的生物量正面臨不同程度的減少，對(duì)該復(fù)合群進(jìn)行保護(hù)生物學(xué)的研究極其重要，需要在本研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)行居群式取樣開(kāi)展生態(tài)地理學(xué)及譜系地理學(xué)研究，更深層次闡明遺傳變異格局的形成機(jī)制，確定保護(hù)單元，才能制訂有效的保護(hù)策略。

致謝 感謝中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所的王紅研究員和劉杰副研究員、中國(guó)臺(tái)灣海洋生物博物館何宣慶博士、美國(guó)德克薩斯州植物研究所的Peter W Fritsch館長(zhǎng)研究員為本研究提供分別來(lái)自馬來(lái)西亞鼓亨、中國(guó)云南保山昌寧、中國(guó)臺(tái)灣、菲律賓南達(dá)沃的實(shí)驗(yàn)材料。感謝楊濤參與部分實(shí)驗(yàn)，感謝陸仁福、劉廷勛、張明英、王銀環(huán)、陳彥權(quán)、李國(guó)紅、高亮新參與中國(guó)境內(nèi)實(shí)驗(yàn)材料的采集。

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（責(zé)任編輯 蔣巧媛）