食源性原花青素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制

鐘 越，李海超，馮馨銳，崔雨舒，鄭中華，王瑋瑤，齊 玲,3

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院管理學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；3. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院 廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511518)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤的病變部位主要始于原始的神經(jīng)峭[1]，是一種較為常見的兒童腫瘤，其具有發(fā)病率高、病變部位較多、易轉(zhuǎn)移和惡性度高等特點(diǎn)，其臨床治療非常困難[2-3]。雖然近年來的新型治療手段使神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療有所改進(jìn)，但由于患兒初診時(shí)多數(shù)即處于中晚期，再加上化療藥物耐藥，患兒的5年生存率僅為15%～25%[4]。原花青素主要來源于葡萄、山楂、銀杏和花生等品種[5]。在美國(guó)，食源性原花青素是民眾最信賴的十大植物藥之一，是公認(rèn)的清除體內(nèi)自由基的天然抗氧化劑。食源性原花青素水溶性好，對(duì)人體無明顯的毒副作用。本課題組前期研究[6]顯示：越桔原花青素具有良好的抗膠質(zhì)瘤作用。但目前食源性原花青素對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究利用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞作為研究對(duì)象，探討食源性原花青素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并闡明其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞系(吉林醫(yī)藥學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心提供)。食源性原花青素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，PBS緩沖液、高糖DMEM培養(yǎng)基、小牛血清和0.25%胰酶(美國(guó)Gibco公司)，噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞楓(DMSO)、MuseTMAnnexin Ⅴ細(xì)胞凋亡試劑盒和細(xì)胞周期試劑盒(美國(guó)Millipore公司)。Muse智能觸控細(xì)胞狀態(tài)分析儀(德國(guó)Merck Millipore 公司)，CB150型CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司)，J-26XP 型超低溫高速離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)，PLUS 384型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)MDC公司)，Ⅸ-70型倒置式相差顯微鏡(日本Olympus 公司) 。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 自液氮罐中取出凍存的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞，置于37℃水浴箱中均勻振蕩1 min，再以800 r·min-1離心3 min，吸出上清后用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%融合進(jìn)行傳代。

1.3 MTT法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞增殖率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，以每孔6×103個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為對(duì)照組及10、20和40 mg·L-1食源性原花青素組，次日開始分制加入含不同濃度(0、10、20和40 mg·L-1)食源性原花青素的培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含5%小牛血清的DMEM，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)(24、48和72 h)和每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待實(shí)驗(yàn)終止每孔加入20 μL MTT孵育4 h，棄上清后每孔加入150 μL DMSO均勻振蕩10 min，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定各孔吸光度(A)值。根據(jù)A值計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(對(duì)照孔A值-用藥孔A值)/ 對(duì)照孔A值×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同細(xì)胞周期SH-SY5Y細(xì)胞百分率 1×106個(gè)SH-SY5Y細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，設(shè)對(duì)照組及10、20和40 mg·L-1食源性原花青素組，待細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～60%，各組分別加入含0、10、20和40 mg·L-1食源性原花青素培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束，收集所有細(xì)胞，冷PBS洗滌離心，重懸細(xì)胞，70%乙醇固定。24 h后冷PBS再次洗滌細(xì)胞，200 μL細(xì)胞周期試劑重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×106mL-1，將試劑與細(xì)胞輕輕混勻，避光孵育30 min，200目濾網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期細(xì)胞百分率。

1.5 AnnexinⅤ凋亡試劑盒檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率 分組同1.4，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合，對(duì)照組加入含DMEM培養(yǎng)液，不同濃度食源性原花青素組加入含10、20和40 mg·L-1食源性原花青素的培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。收集所有細(xì)胞，PBS洗滌并重懸細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×106mL-1。加入Annexin Ⅴ溶液5 μL和PI 10 μL，冰浴10 min，上機(jī)檢測(cè)每組10 000個(gè)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié) 果

2.1 各組SH-SY5Y細(xì)胞增殖率 與對(duì)照組比較，各時(shí)間點(diǎn)10、20和40 mg·L-1食源性原花青素組細(xì)胞增殖率均降低，作用48和72 h時(shí)

20 mg·L-1食源性原花青素組細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，作用24、48和72 h時(shí)40 mg·L-1食源性原花青素組細(xì)胞增殖率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且不同濃度食源性原花青素組細(xì)胞增殖率呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。由于72 h時(shí)作用效果最為明顯，選取72 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物作用時(shí)間。見表1。

2.2 各組不同細(xì)胞周期SH-SY5Y細(xì)胞百分率 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示：G0/G1期細(xì)胞百分率隨著藥物濃度的增加而升高，G2/M期細(xì)胞百分率隨藥物濃度增加而降低。與對(duì)照組比較，40 mg·L-1食源性原花青素組G0/G1期細(xì)胞百分率明顯升高(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞百分率明顯降低(P<0.01)；而10和20 mg·L-1食源性原花青素組S期細(xì)胞百分率略有增加，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表2。

2.3 各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率 與對(duì)照組(19.03%±3.05%)比較，10、20和40 mg·L-1食源性原花青素組細(xì)胞凋亡率(66.81%±3.89%、72.81%±5.16%和78.92%±6.84%)均明顯升高(P<0.01)。見圖2。

表1 MTT法檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞增殖率Tab.1 Proliferation rates of SH-SY5Y cells in various groups detected by MTT assay

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

A: Control group; B-D:10，20, and 40 mg·L-1 foodborne procyanidins groups.圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組不同細(xì)胞周期SH-SY5Y細(xì)胞百分率Fig.1 Percentages of SH-SY5Y cells in different cell cycles in various groups detected by flow cytometry

表2 各組不同細(xì)胞周期SH-SY5Y細(xì)胞百分率Tab.2 Percentages of SH-SY5Y cells in different cell cycles in various groups

*P<0.01vscontrol group.

A: Control group; B-D:10,20,and 40 mg·L-1 foodborne procyanidins group.圖2 Annexin Ⅴ法檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of SH-SY5Y cells in various groups detected by Annexin Ⅴ assay

3 討 論

原花青素廣泛存在于多種可食用植物如花生、蘋果和葡萄的核、皮等部位，日常生活中被人們所攝取和利用[6]。研究[7-8]表明：花生紅皮中的原花青素可以對(duì)抗前列腺癌細(xì)胞的增殖，蘋果提取出來的原花青素可以上調(diào)緊密連接蛋白的表達(dá)從而減少氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，而紅葡萄酒中的原花青素可以預(yù)防心血管疾病。吉林省食源性原花青素資源豐富，如越桔、葡萄和蘋果等[9-10]，因此對(duì)食源性原花青素進(jìn)行深入研究與開發(fā)具有重要的意義。

在臨床上，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療有多種方法，主要包括手術(shù)、化療、放療、干細(xì)胞移植、誘導(dǎo)分化治療、臍血移植和基因治療等[11]，但由于神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)迅速、易早期轉(zhuǎn)移、且惡性程度高，給治療帶來了諸多的困難。化療作為綜合治療的主要方法之一，一直被聯(lián)合應(yīng)用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床治療中[12-13]。但化療藥物對(duì)患兒的不良反應(yīng)較大，而食源性原花青素作為一種可食用的植物提取成分，具有不良反應(yīng)輕和價(jià)格低廉等特點(diǎn)[14]。因此，本研究針對(duì)食源性原花青素，研究其對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。

本研究應(yīng)用MTT法檢測(cè)食源性原花青素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖率的影響，結(jié)果顯示：10、20和40 mg·L-1食源性原花青素作用于SH-SY5Y細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的增殖率均降低，且各濃度組的作用呈明顯的劑量依賴效應(yīng)，說明食源性原花青素可以降低SH-SY5Y細(xì)胞增殖率。但是，腫瘤細(xì)胞之所以可以過度生長(zhǎng)，主要是在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中激活了特殊的生長(zhǎng)通路或抑制了其死亡通路，從而使細(xì)胞過度惡性增殖，在腫瘤細(xì)胞死亡的多種途徑中，誘導(dǎo)腫瘤凋亡始終是抗腫瘤藥物的最佳選擇途徑[15-16]。

細(xì)胞周期異常和細(xì)胞發(fā)生凋亡與腫瘤細(xì)胞化療敏感性有密切關(guān)聯(lián)，如果腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期出現(xiàn)阻滯，則可加速細(xì)胞凋亡的發(fā)生[17]。因此，研究藥物治療引起的腫瘤細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡，對(duì)于臨床化療具有十分重要的意義。細(xì)胞周期是異常精密的過程，G0/G1期是化療藥物作用的主要位點(diǎn)，而G2/M期是細(xì)胞的高度增殖時(shí)相[18-19]。為明確食源性原花青素是否參與調(diào)控SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞周期，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了SH-SY5Y細(xì)胞周期的變化，結(jié)果顯示：10、20和40 mg·L-1食源性原花青素作用于SH-SY5Y細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞百分率隨著藥物濃度的增加而升高，G2/M期細(xì)胞的比例則呈現(xiàn)濃度遞減趨勢(shì)，表明食源性原花青素的確參與調(diào)控SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞周期，使細(xì)胞生長(zhǎng)周期發(fā)生阻滯。

為了進(jìn)一步明確食源性原花青素是否影響了SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生凋亡，本研究采用Annexin Ⅴ法檢測(cè)了SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示：各濃度食源性原花青素組SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率明顯升高，表明食源性原花青素可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生凋亡，但凋亡的信號(hào)通路有很多，具體是激活哪條信號(hào)通路尚有待證實(shí)。總之，食源性原花青素可以明顯降低SH-SY5Y細(xì)胞的活性，抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制主要是使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但食源性原花青素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。