二乙酰胺三氮脒對肢體缺血再灌注模型小鼠腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制

王建軍， 劉亞楠，王建輝，劉 燕， 李 穎， 王瑞雪，楊秀紅,3

(1.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河北 唐山063000；2.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北 唐山063000；3.河北省唐山市慢性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000)

肢體長時(shí)間缺血后突然恢復(fù)其血流灌注，除肢體本身受到嚴(yán)重?fù)p傷外，還會出現(xiàn)更為嚴(yán)重的遠(yuǎn)隔組織器官損傷，如腎臟、心臟、肺臟和腸道都會出現(xiàn)或序貫性出現(xiàn)不同程度損傷，引起多臟器功能障礙，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)休克和多臟器功能衰竭，其發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。研究[1]表明：肢體缺血后再灌注(limb ischemia-reperfusion，LIR)后遠(yuǎn)隔組織器官損傷與局部腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)表達(dá)失衡有關(guān)。本文作者通過研究血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)激動劑二乙酰胺三氮脒(diminazene，DIZE)對小鼠LIR后腎損傷指標(biāo)和腎局部組織RAS系統(tǒng)中血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)和血管緊張素(1-7)[ angiotensin(1-7)， Ang(1-7)]水平及其相應(yīng)受體血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ type-1 receptor ，AT1R)和Mas受體(Mas receptor，MasR)蛋白表達(dá)的影響，探討DIZE對腎損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為LIR后器官保護(hù)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、Western blotting蛋白Marker、ECL發(fā)光劑、定影劑和顯影劑均為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品，ELISA-Ang(1-7)試劑盒和ELISA-AngⅡ試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，AT1R一抗試劑盒購自美國Santa Cruz公司，MasR一抗購自以色列Alomone Labs公司， DIZE 購自美國Sigma公司。套扎槍(M-M-0084)，江蘇金壇醫(yī)療器械有限公司；酶標(biāo)儀(Model 680),美國Bio-RAD公司；電泳儀(ECP3000),北京六一儀器廠；低溫高速離心機(jī)(Centrifuge 5804R),德國Eppendorf公司；SM2400平推式切片機(jī)，德國Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 ICR小鼠由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所提供，在華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級動物房采用SPF級基礎(chǔ)飼料和繁殖飼料進(jìn)行繁育和飼養(yǎng)，小鼠自由進(jìn)食和飲水。選取8周齡雄性ICR小鼠18只，隨機(jī)分為對照組、LIR組和LIR后DIZE治療(LIR+DIZE)組，每組6只。

1.3 LIR模型制備 腹腔注射水合氯醛(3 mg·kg-1)麻醉小鼠，制備LIR模型：在雙后肢根部行橡皮套結(jié)扎術(shù)，使雙后肢缺血2 h，隨后用手術(shù)剪剪斷橡膠圈，并對小鼠雙側(cè)后肢按摩，進(jìn)行血流再灌注4 h。LIR組和LIR+DIZE組小鼠采用常規(guī)方法復(fù)制小鼠LIR模型，LIR+DIZE組小鼠于LIR前皮下注射DIZE(10 mg·kg-1·d-1)預(yù)處理14 d。摘除眼球取血處死小鼠，留取血漿和雙側(cè)腎臟，分別在-80℃冰箱和甲醛固定液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 HE染色觀察小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn) 將小鼠一側(cè)腎臟浸于10%甲醛中充分固定后，按常規(guī)方法脫水、包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)。參照文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行病理損傷評分,即每張切片在皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)觀察10個(gè)無重疊視野(×200)，每個(gè)視野選取50個(gè)腎小管進(jìn)行評分：正常腎小管為0分，刷狀緣消失為2分，腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平為1分，間質(zhì)水腫1分，細(xì)胞質(zhì)空泡2分，腎小管細(xì)胞壞死2分，形成管型或碎片為2分。每個(gè)腎小管病理損傷評分總計(jì)為10分，每個(gè)視野最高評分為500分。

1.5 小鼠腎功能測定 血清離心取上清，打開生化儀電源及系統(tǒng)軟件，設(shè)置測定小鼠血清中尿素和血肌酐(Scr)水平，反應(yīng)溫度37℃，使用與試劑配套的校準(zhǔn)溶液進(jìn)行定標(biāo)，先將待測的樣本依次放入樣本位中，然后啟動測定程序，進(jìn)行檢測。

1.6 ELISA法檢測小鼠腎組織中AngⅡ和Ang(1-7)水平 應(yīng)用競爭性抑制酶聯(lián)免疫分析法測定小鼠腎組織中AngⅡ和Ang(1-7)水平。將腎組織勻漿、離心，取上清，按試劑盒說明操作，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AngⅡ和Ang(1-7)水平。

1.7 蛋白免疫印跡(Western blotting) 法檢測小鼠腎組織中AT1R和MasR蛋白表達(dá)水平 按照蛋白提取試劑盒說明提取蛋白。取腎組織100 mg放入玻璃勻漿器，加入1 mL蛋白裂解液勻漿，12 000 r·min-1離心30 min，留取上清。用BCA法測定蛋白濃度，用裂解液將各蛋白配成濃度為3 mg·L-1，取10 μL蛋白樣品與5×上樣緩沖液混勻，煮沸10 min后SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜45 min，5%BSA室溫封閉1 h，一抗孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗37℃溫箱孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑均勻鋪于膜上孵育2 min，曝光后顯影、定影。用Image J圖像分析軟件分析處理?xiàng)l帶灰度值，計(jì)算蛋白相對表達(dá)水平，以目的條帶與內(nèi)參灰度值比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)及病理損傷評分 光鏡下觀察，與對照組比較，LIR組小鼠腎組織中腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，炎細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫，腎小管上皮細(xì)胞壞死，蛋白質(zhì)管型較為常見，腎組織病理損傷評分明顯升高(P<0.05)。與LIR組比較，LIR+DIZE組小鼠腎組織中偶見腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、炎細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫和腎小管上皮脫落等病理表現(xiàn)，腎組織病理損傷評分明顯降低(P<0.05)。見圖1(插頁一)和表1。

A：Control group；B：LIR group；C：LIR+DIZE group.
圖1 各組小鼠腎組織病理形態(tài)表現(xiàn)(HE，×200)
Fig.1 Pathomorphology of kidney tissue of mice in various groups (HE,×200)

表1 各組小鼠腎組織病理損傷評分Tab.1 Pathological injury scores of kideny tissue of mice in various groups

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLIR group.

2.2 各組小鼠腎功能指標(biāo) 與對照組比較，LIR組和LIR+DIZE組小鼠血清中尿素和Scr水平明顯升高(P<0.05)；與LIR組比較， LIR+DIZE組小鼠血清中尿素和Scr水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.3 各組小鼠腎組織中AngⅡ和Ang(1-7)水平 與對照組比較，LIR組小鼠腎組織中AngⅡ和Ang(1-7)水平及AngⅡ/Ang(1-7)比值明顯升高(P<0.05)；與LIR組比較，LIR+DIZE組小鼠腎組織AngⅡ水平明顯降低(P<0.05)，Ang(1-7)水平明顯升高(P<0.05)，AngⅡ/Ang(1-7)比值明顯降低(P<0.05)。見表3。

表2 各組小鼠血清中尿素和Scr水平Tab.2 Levels of serum urea and Scr of mice in various groups

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLIR group.

表3 各組小鼠腎組織中AngⅡ和Ang(1-7)水平及AngⅡ/Ang(1-7)比值Tab.3 Levels of AngⅡ and Ang(1-7) in kidney tissue and ratios of AngⅡ/Ang(1-7) of mice in various groups

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLIR group.

2.4 各組小鼠腎組織中AT1R和MasR蛋白表達(dá)水平及AT1R/MasR比值 與對照組比較，LIR組小鼠腎組織中AT1R蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，MasR蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，AT1R/MasR比值降低(P<0.05)；與LIR組比較，LIR+DIZE組小鼠腎組織中AT1R和MasR蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，AT1R/MasR比值也明顯升高(P<0.05)。見圖2和表4。

3 討 論

LIR可引起遠(yuǎn)隔器官如心臟、肺臟和腎臟等的損傷，其機(jī)制十分復(fù)雜。本課題組前期研究[1-2]顯示：LIR后急性腎和肺損傷與器官局部組織RAS失衡有關(guān)。器官局部RAS由兩條作用相反的通路組成，一條是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)-AngⅡ-AT1R軸，另一條是ACE2-Ang(1-7)-MasR軸，兩條軸的作用相反，其表達(dá)失衡可能是引起器官損傷的一個(gè)重要原因。在各種病理情況下ACE-AngⅡ-AT1R過表達(dá)可通過炎癥和過氧化等機(jī)制造成器官損害，而ACE2-Ang(1-7)-MasR軸的作用正好與其相反，對器官具有保護(hù)作用。

Lane 1:Control group;Lane 2:LIR group;Lane 3:LIR+DIZE group.
圖2 各組小鼠腎組織中AT1R和MasR蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.2 Electrophoregram of AT1R and MasR proteins in kidney tissue of mice in various groups

表4 各組小鼠腎組織中AT1R和MasR蛋白表達(dá)水平及AT1R/MasR比值Tab.4 Expression levels of AT1R and MasR proteins in kidney tissue and ratios AT1R/MasR of mice in various groups

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsLIR group.

有研究[3]表明：傳統(tǒng)使用的廣譜抗血液原蟲藥DIZE可以激活RAS中的ACE2，興奮全身的ACE2-Ang(1-7)-MasR軸，從而起到器官保護(hù)作用。FOUREAUX等[4]研究發(fā)現(xiàn)：DIZE對ACE2-Ang(1-7)-MasR軸的干預(yù)，可能成為治療青光眼的潛在策略。也有研究[5]表明：中樞給予DIZE可明顯減少腦梗死的面積，其效果與外周給予Ang(1-7)激活A(yù)CE2-Ang(1-7)-MasR軸的效果相似。也有研究[6]顯示：DIZE通過影響ACE2-Ang(1-7)-MasR軸的表達(dá)，改善阿爾茨海默病大鼠模型的認(rèn)知障礙。QI等[7]研究發(fā)現(xiàn)：DIZE可以通過提高ACE2表達(dá)，改變心臟RAS水平，增加心臟祖細(xì)胞和循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞，減少心

肌梗死區(qū)域巨噬細(xì)胞浸潤，調(diào)控致炎因子，減少心臟誘導(dǎo)的梗死區(qū)域的細(xì)胞凋亡，從而治療心肌梗死誘導(dǎo)的左心功能不全。有研究[8]顯示：DIZE可通過激活心臟ACE2軸增強(qiáng)心肌保護(hù)作用，比依那普利更能改善急性心肌梗死后的心肌功能。CHEN等[9]研究表明：DIZE能明顯降低腫瘤壞死因子α和白細(xì)胞介素6等炎癥因子的水平，激活A(yù)CE2和AT1R, 從而減少心肌梗死面積。DIZE還以通過激動ACE2-Ang(1-7)-MasR軸防止肝臟纖維化[10]。在LIR所致肺損傷小鼠模型中，DIZE可通過改善RAS兩軸的失衡發(fā)揮肺保護(hù)作用[11]。MALEK等[12]發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用DIZE處理腎缺血再灌注后的大鼠，能明顯改善再灌注后的肝腎功能。DIZE還可以減少活性氧(ROS)產(chǎn)物和三磷酸吡啶核苷酸(NADPH)氧化酶的表達(dá)，通過抗氧化和提高亞硝酸鹽水平而發(fā)揮對腎臟的保護(hù)作用[13]。研究[14-15]表明：在糖尿病大鼠模型中，DIZE通過影響RAS相關(guān)因子表達(dá)，保護(hù)腎功能，預(yù)防糖尿病腎病的發(fā)生。 KANGUSSU等[16]研究表明：DIZE通過激動ACE2改善高血壓所致腎臟病變。也有研究[17]顯示：DIZE可以降低體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞AngⅡ和AT1R的表達(dá)和促進(jìn)Ang(1-7)表達(dá)，從而減輕脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。研究[18-19]表明：RAS可影響肝脂肪代謝，ACE2-Ang(1-7)-MasR軸的高表達(dá)有預(yù)防和治療脂肪肝的作用。但也有研究[20]證實(shí)：DIZE不能提高內(nèi)皮的ACE2活性，從而不能在局部組織產(chǎn)生足量的Ang(1-7)來影響血管的緊張性，而是通過抑制ACE的活性發(fā)揮作用。

研究[21]顯示： LIR后腎組織局部出現(xiàn)RAS穩(wěn)態(tài)失衡。ACE2激動劑DIZE是否可通過激活A(yù)CE2改善RAS失衡而發(fā)揮對腎損傷的保護(hù)作用，目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，LIR模型小鼠局部腎組織AngⅡ/Ang(1-7)和AT1R/MasR比值均出現(xiàn)失衡，血清中尿素和Scr水平均升高，病理結(jié)果顯示小鼠有不同程度腎損傷；應(yīng)用DIZE預(yù)處理后，RAS失衡明顯改善，小鼠腎病理損傷明顯減輕，而且Urea和Scr水平明顯降低。因此本文作者推測：作為ACE2激動劑，DIZE可能通過激動ACE2，大量水解AngⅡ生成Ang(1-7)，降低AngⅡ水平，同時(shí)增加組織中Ang(1-7)的水平，上調(diào)MasR表達(dá)，改善RAS失衡狀態(tài)而使腎損傷減輕。

綜上所述，AngⅡ/Ang(1-7)及AT1R/MasR表達(dá)失衡在LIR后急性腎損傷發(fā)生中起重要作用。ACE2激動劑DIZE可能通過改善RAS穩(wěn)態(tài)失衡發(fā)揮對腎臟的保護(hù)作用。