大麻素對(duì)雙環(huán)己酮草酰二腙誘導(dǎo)的脫髓鞘模型小鼠髓鞘的修復(fù)作用

同思雅，楊 謙，張咪娟，李 偉，王 濤

(1. 西安醫(yī)學(xué)院研究生院，陜西 西安 710068；2. 陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，陜西 西安 710068)

多發(fā)性硬化是一種以免疫反應(yīng)及炎癥介導(dǎo)的以脫髓鞘及軸突變性為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性進(jìn)展性疾病[1-3]。依病灶的分布部位不同，多發(fā)性硬化的癥狀多種多樣，常見肢體無力、感覺障礙、視覺異常、言語困難、括約肌障礙和自主神經(jīng)功能紊亂等癥狀[4-5]。上述癥狀的產(chǎn)生大部分與多發(fā)性硬化導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘有關(guān)，因此保護(hù)并促進(jìn)髓鞘的再生成為治療多發(fā)性硬化的重要方向。目前研究[6]顯示：人工合成大麻素(WIN55212-2)可能通過保護(hù)并促進(jìn)髓鞘再生緩解脫髓鞘疾病模型動(dòng)物的癥狀，但其具體的作用機(jī)制仍不清楚。結(jié)側(cè)蛋白(juxtanodin，JN)是髓鞘的重要成分，在髓鞘的合成和發(fā)育中具有重要作用[7-8]。在生后表達(dá)時(shí)間特點(diǎn)上，JN與髓鞘的主要成分髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)相當(dāng)，其表達(dá)略晚于MBP，是評(píng)價(jià)少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟和髓鞘發(fā)育完善的重要指標(biāo)[8]。本研究采用喂食雙環(huán)己酮草酰二腙(cuprizone)法建立脫髓鞘小鼠模型，采用WIN55212-2進(jìn)行治療，通過治療前后JN表達(dá)的變化來評(píng)估髓鞘修復(fù)情況及治療效果，以期為大麻素治療脫髓鞘疾病的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 8周齡雄性C57BL/6小鼠95只，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(陜)2014-001。小鼠飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，于12 h光亮/12 h黑暗、環(huán)境溫度18℃～25℃條件下分籠喂養(yǎng)，每籠不多于5只，普通無菌飼料，自由進(jìn)食、進(jìn)水，每2 d更換一次墊料。WIN55212-2和cuprizone購自美國Sigma公司，JN抗體黑金Ⅱ髓鞘染色試劑盒(Black-gold Ⅱmyelin staining kit)購自美國Millipore公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.2抗體和MBP抗體購自英國Abcam公司，GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，SYBR Premix Ex Taq購自大連寶生物工程有限公司，RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑購自西安晶彩科技有限公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Bio-Rad公司。電泳儀、垂直電泳槽、ECL化學(xué)發(fā)光試劑和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備 95只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(30只)、模型組(25只)、二甲基亞砜(DMSO)組(15只)和治療組(25只)?？瞻讓?duì)照組小鼠給予普通飼料正常喂養(yǎng)6周。模型組、DMSO組和治療組小鼠制備脫髓鞘模型，將普通飼料粉碎后，每100 g加入0.2%的cuprizone 0.2 g，加入約50 mL水拌勻壓成正常飼料的形狀并烘干：模型組小鼠連續(xù)喂養(yǎng)6周[9]； DMSO組小鼠自喂食3周后開始腹腔注射與WIN55212-2等量的DMSO混合液，連續(xù)注射10 d；治療組小鼠自喂養(yǎng)3周后開始每天1次按劑量1 mg·kg-1腹腔注射WIN55212-2(WIN55212-2按照小鼠體質(zhì)量比例溶于10%DMSO∶生理鹽水1∶1的混合液中)，連續(xù)注射10 d[10]。

1.3 黑金Ⅱ髓鞘染色觀察各組小鼠大腦組織形態(tài)表現(xiàn) 采用黑金Ⅱ髓鞘染色技術(shù)對(duì)小鼠髓鞘組織進(jìn)行染色，判斷脫髓鞘小鼠模型是否成功。于第3和6周取空白對(duì)照組、模型組小鼠各3只，按照10 mL·kg-1劑量用0.5%水合氯醛麻醉后，進(jìn)行心臟灌注，隨后剝離小鼠完整的大腦組織，4%多聚甲醛固定過夜，30%蔗糖沉淀，進(jìn)行小鼠大腦冠狀面的冰凍切片，厚度14～30 μm。4%多聚甲醛固定切片，ddH2O浸洗2 min，將切片放入60℃黑金Ⅱ染色液中染色約12 min，直到在顯微鏡下觀察到著色均勻、深淺適合的切片。經(jīng)ddH2O浸洗，60℃硫代硫酸鈉中孵育3 min，ddH2O浸洗，結(jié)晶紫染色3 min，酒精梯度脫水，二甲苯透明，吸水封片。陽性結(jié)果判定：正常情況下小鼠大腦胼胝體區(qū)域著色明顯，髓鞘結(jié)構(gòu)致密完整；反之，則表明脫髓鞘小鼠模型制備成功。

1.4 Western blotting法檢測(cè)小鼠大腦組織中JN、MBP和Nkx2.2蛋白表達(dá)水平 將各組小鼠大腦組織按照1∶10(g∶mL)比例加入RIPA蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑進(jìn)行冰上研磨，并使用BCA蛋白定量。配制12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，上樣后進(jìn)行蛋白電泳。電泳結(jié)束后將膠轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，加入一定稀釋比例的一抗4℃過夜。次日TBST緩沖液洗膜，室溫孵育HRP標(biāo)記二抗1 h，再次洗膜后，加入 ECL化學(xué)發(fā)光液，Bio-rad成像系統(tǒng)上拍照并利用Image J軟件進(jìn)行圖像灰度掃描分析，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 造模不同時(shí)間小鼠大腦組織形態(tài)表現(xiàn) 黑金Ⅱ髓鞘染色結(jié)果顯示：空白對(duì)照組小鼠大腦胼胝體區(qū)有明顯的著色；6周后模型組小鼠大腦胼胝體區(qū)著色減少，提示模型組小鼠的髓鞘發(fā)生脫落，造模成功。見圖1(插頁三)。

A:Blank control group；B:Model group(3 weeks)；C:Model group(6 weeks).
圖1 2組小鼠大腦胼胝體區(qū)形態(tài)表現(xiàn)(黑金Ⅱ，×200)
Fig.1 Morphology of corpus callosum of brain of mice in two groups(Black-goldⅡ，×200)

2.2 空白組和模型組小鼠大腦組織中JN和MBP蛋白表達(dá)水平 模型制備3周后，脫髓鞘小鼠逐漸出現(xiàn)情感淡漠、發(fā)育遲緩和活動(dòng)減少等表現(xiàn)。與空白對(duì)照組(0.58±0.08和0.72±0.06)比較，6周后模型組小鼠大腦組織中JN和MBP蛋白表達(dá)水平(0.31±0.05和0.23±0.04)明顯降低(P<0.05)。見圖2。

Lane 1: Blank control group；Lane 2: Model group(3 weeks)；Lane 3: Model group(6 weeks).
圖2 Western blotting法檢測(cè)空白對(duì)照組和模型組小鼠大腦組織中JN(A)和MBP(B)蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.2 Electrophoregram of expressions of JN(A) and MBP(B) proteins in brain tissue of mice in balnk control group and model group detected by Western blotting method

2.3 WIN55212-2處理后各組小鼠大腦組織中JN和Nkx2.2蛋白表達(dá)水平 脫髓鞘小鼠制備模型第3周時(shí)，治療組小鼠給予1 mg·kg-1WIN55212-2注射，注射后第10天分別收集空白對(duì)照組、模型組、DMSO組和治療組小鼠大腦組織檢測(cè)JN和Nkx2.2蛋白表達(dá)水平。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠大腦組織中JN和Nkx2.2蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組和DMSO組比較，治療組小鼠大腦組織中JN和Nkx2.2蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見圖3和表1。

Lane 1: Blank control group；Lane 2: Model group；Lane 3: DMSO group；Lane 4: Treatment group.
圖3 Western blotting法檢測(cè)各組小鼠大腦組織中JN(A)和Nkx2.2(B)蛋白表達(dá)電泳圖
Fig.3 Electrophoregram of expressions of JN(A) and Nkx2.2(B) proteins in brain tissue of mice in various groups detected by Western blotting method

表1 各組小鼠大腦組織中JN和Nkx2.2蛋白表達(dá)水平Tab.1 Expression levels of JN and Nkx2.2 proteins in brain tissue of mice in various groups

*P<0.05vsblank control group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group;#P<0.05,##P<0.01vsDMSO group.

3 討 論

多發(fā)性硬化表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性脫髓鞘改變[11]，其中炎癥性脫髓鞘是重要環(huán)節(jié)[11-13]，其病理特征為大腦和脊髓多個(gè)散在的斑塊性神經(jīng)元軸突髓鞘脫失[14]，因此保護(hù)髓鞘及促進(jìn)髓鞘再生成為改善多發(fā)性硬化患者臨床癥狀的重要治療手段及方向[15-16]。在多發(fā)性硬化等中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞分化出具有功能性的少突膠質(zhì)細(xì)胞減少，從而導(dǎo)致髓鞘再生障礙。JN是一種少突膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的骨架蛋白，其表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)與髓鞘發(fā)生相一致。JN可通過與F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)直接結(jié)合引起細(xì)胞骨架變動(dòng)，促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞突起的生長及形態(tài)變化，在少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化和髓鞘形成方面具有重要作用[7-8,17]。因此，促進(jìn)JN的表達(dá)，可能成為治療脫髓鞘疾病中保護(hù)少突膠質(zhì)細(xì)胞及促進(jìn)髓鞘再生的潛在治療手段。

cuprizone是一種銅離子螯合劑，通過干擾少突膠質(zhì)細(xì)胞線粒體能量代謝破壞該細(xì)胞進(jìn)而導(dǎo)致髓鞘脫失。但cuprizone并不影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中其他細(xì)胞的功能，是建立脫髓鞘模型的常用誘導(dǎo)藥物，模擬脫髓鞘疾病的發(fā)生[18-19]。在本實(shí)驗(yàn)中，利用cuprizone誘導(dǎo)小鼠發(fā)生髓鞘脫失，結(jié)果顯示：作為髓鞘的主要成分MBP蛋白表達(dá)水平降低，其趨勢(shì)隨時(shí)間的增加而更明顯，表明造模成功，小鼠發(fā)生髓鞘的破壞；而JN蛋白的表達(dá)隨著損傷時(shí)間的延長而減少，在第6周時(shí)最明顯，提示JN參與了髓鞘脫失的病理過程。WIN55212-2能夠通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和抗炎作用促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活及髓鞘修復(fù)，減輕多發(fā)性硬化癥狀[20-21]。本研究結(jié)果顯示：在給予脫髓鞘小鼠注射WIN55212-2后，與空白組比較，治療組小鼠腦組織中JN蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WIN55212-2可上調(diào)Nkx2.2蛋白表達(dá)。有研究[22]表明：Nkx2.2蛋白是中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進(jìn)JN蛋白的表達(dá)。因此本文作者推測(cè)：WIN55212-2可能通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.2蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)JN蛋白表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)髓鞘再生與修復(fù)。

綜上所述，本研究通過建立cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠模型，使用WIN55212-2對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行干預(yù)，證實(shí)WIN55212-2可能通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.2蛋白進(jìn)而促進(jìn)JN蛋白表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)髓鞘的作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究大麻素治療多發(fā)性硬化的機(jī)制及相應(yīng)的干預(yù)靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和線索。