序貫培養(yǎng)體系和單一培養(yǎng)體系對人卵母細(xì)胞受精和早期胚胎發(fā)育的影響

李友筑，顏曉紅，吳榮鋒，陶 萍，程 玲，葉圓圓，周衛(wèi)東

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，福建 廈門 361003)

體外受精-胚胎移植(invitrofertilization and embryo transfer，IVF-ET)是目前治療不孕癥最常用的人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)。自1978年英國的醫(yī)學(xué)工作者利用IVF-ET技術(shù)讓1例不孕癥女性患者成功懷孕并誕生世界上第一例“試管嬰兒”以來，IVF-ET技術(shù)在世界各國廣泛應(yīng)用于不孕癥的治療。目前，世界范圍內(nèi)每年開展的IVF助孕周期總數(shù)已超過百萬[1]。如何獲得更為優(yōu)質(zhì)的可移植胚胎是生殖醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)師和胚胎學(xué)家們一直關(guān)注的熱點(diǎn)問題，特別是近年來隨著單胚胎移植理念的不斷推廣，對于移植胚胎的質(zhì)量提出了更高的要求。胚胎培養(yǎng)是IVF-ET治療中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，與IVF治療結(jié)局有著密切關(guān)系[2]。胚胎培養(yǎng)液是胚胎培養(yǎng)體系中與胚胎關(guān)系最為密切、接觸時間最長的組成部分。目前商業(yè)化供應(yīng)的人類胚胎培養(yǎng)液主要有序貫培養(yǎng)液(sequential culture medium)和單一培養(yǎng)液(single step culture medium)。目前常用的序貫培養(yǎng)液有Vitrolife、Cook和Quinne’s等系列產(chǎn)品，而單一培養(yǎng)液有Global和Irvine等系列產(chǎn)品。近年來，研究者對不同培養(yǎng)液體系中胚胎發(fā)育的情況進(jìn)行了初步探索，但主要是研究不同序貫培養(yǎng)液體系對胚胎生長發(fā)育的影響[3-4]。MORBECK等[5]比較了不同序貫培養(yǎng)液和單一培養(yǎng)液的組分差異及對小鼠囊胚形成的影響。目前，關(guān)于序貫培養(yǎng)體系和單一培養(yǎng)體系對胚胎生長影響的比較還鮮有報道。鑒于上述2種培養(yǎng)體系設(shè)計理念的差異及各自的優(yōu)勢，本研究比較分析了Vitrolife的序貫培養(yǎng)液體系和Irvine的單一培養(yǎng)液體系對人類早期胚胎發(fā)育的影響，為人類ART中胚胎培養(yǎng)體系的選擇和評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年3月-2018年1月于本院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精/卵胞質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射(IVF/ICSI)助孕的患者155例，平均年齡(29.91±4.03)歲，每例患者獲卵數(shù)≥8枚。同一個患者的卵子分為2組，分別在2種培養(yǎng)體系中進(jìn)行體外受精和胚胎培養(yǎng)，2組的卵子數(shù)基本相同。序貫培養(yǎng)組：體外受精和胚胎在序貫培養(yǎng)體系G-IVF/G1/G2(G-IVF plus、G1 plus和G2 plus培養(yǎng)液，瑞典Vitrolife公司)中培養(yǎng)；單一培養(yǎng)組：體外受精和胚胎在單一培養(yǎng)體系(CSCC培養(yǎng)液，美國Irvine Scientific公司)中培養(yǎng)。

1.2 卵母細(xì)胞的收集及培養(yǎng) 采用陰道B超引導(dǎo)下卵泡穿刺取卵，抽取所有直徑≥10 mm卵泡。取卵日男方手淫取精獲取精液，并根據(jù)患者情況行常規(guī)IVF或ICSI方式授精。授精后16～20 h(第1天，D1)倒置顯微鏡下觀察受精情況，并記錄原核(PN)數(shù)目：雙原核(2PN)為正常受精；單原核(1PN)受精和≥3PN為多PN受精，均為異常受精。第2天(D2)和第3天(D3)評估卵裂期胚胎形態(tài)，記錄胚胎數(shù)；第5天(D5)和第6天(D6)評估囊胚期胚胎形態(tài)，記錄胚胎數(shù)。

1.3 胚胎在不同培養(yǎng)體系中的培養(yǎng) 對于序貫培養(yǎng)體系，卵母細(xì)胞于G-IVF plus培養(yǎng)液中行受精，卵裂期胚胎于G1 plus培養(yǎng)液中37℃、6% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)；D3轉(zhuǎn)入G2 plus培養(yǎng)液中置于37℃、6% CO2、5%O2及飽和濕度下行囊胚培養(yǎng)。對于單一培養(yǎng)體系，卵母細(xì)胞從受精、卵裂期及囊胚期，均在CSCC培養(yǎng)液中培養(yǎng)。受精和卵裂期胚胎均于37℃、6% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)；D3更換新培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入37℃、6% CO2、5%O2及飽和濕度下行囊胚培養(yǎng)。

1.4 胚胎評估標(biāo)準(zhǔn) 本研究D3優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)：D1為2PN，細(xì)胞數(shù)≥6(含桑葚胚)，卵裂球大小均勻或略不均勻，形態(tài)規(guī)則或略不規(guī)則，無碎片或<10%；D3可用胚胎標(biāo)準(zhǔn)：D1為2PN，細(xì)胞數(shù)≥6(含桑葚胚)，細(xì)胞碎片<40%。根據(jù)Gardner評分標(biāo)準(zhǔn)[6]對囊胚進(jìn)行評估，D5或D6可用囊胚標(biāo)準(zhǔn)： 對于擴(kuò)張期囊胚(3期)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和外滋養(yǎng)層細(xì)胞評級為A或B的囊胚；對于完全擴(kuò)張囊胚(4期)、孵化囊胚(5期)和已孵出囊胚(6期)外滋養(yǎng)層細(xì)胞評級為A或B的囊胚。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組患者受精率、2PN受精率、多核受精率、卵裂率、可用胚胎率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎致密化率、囊胚形成率和可用囊胚形成率均以百分率(%)表示，2組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2種培養(yǎng)體系胚胎形態(tài)表現(xiàn) 在G1培養(yǎng)體系中，胚胎形態(tài)表面光滑、均勻(圖1A和B，見插頁一)；在CSCC培養(yǎng)體系中胚胎表面較為粗糙、有顆粒狀(圖1C和D，見插頁一)。在CSCC培養(yǎng)體系中，D2和D3階段有高于10%比例的胚胎出現(xiàn)致密化現(xiàn)象(圖1E和F，見插頁一)，而在G1培養(yǎng)體系中，D2和D3胚胎致密化比例低于2%。

A, B: Embryo cultured in G1 plus; C-F: Embryo cultured in CSCC; A, C, E: D2; B, D, F: D3.
圖1 不同培養(yǎng)時間序貫培養(yǎng)體系和單一培養(yǎng)體系中胚胎形態(tài)表現(xiàn)(×200)
Fig.1 Morphology of embryos in single-step and sequential culture media systems at different culture time(×200)

2.2 2種培養(yǎng)體系受精情況 本研究共有155例患者，其中IVF 123例，ICSI 32例，序貫培養(yǎng)組和單一培養(yǎng)組培養(yǎng)體系的卵母細(xì)胞來自于相同患者。在IVF中，序貫培養(yǎng)組有921枚卵母細(xì)胞，單一培養(yǎng)組有935枚卵母細(xì)胞；在ICSI中，序貫培養(yǎng)組有244枚卵母細(xì)胞[其中減數(shù)第二次分裂中期(MⅡ)卵201枚]，單一培養(yǎng)組有234枚卵母細(xì)胞(其中MⅡ卵198枚)。單一培養(yǎng)組的受精率和2PN受精率均略高于序貫培養(yǎng)組，但組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。單一培養(yǎng)組的多PN受精率略低于序貫培養(yǎng)組，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 2種培養(yǎng)體系中早期胚胎發(fā)育情況 在IVF患者中，序貫培養(yǎng)組和單一培養(yǎng)組的卵裂率、可用胚胎率和優(yōu)質(zhì)胚胎率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在ICSI患者中，序貫培養(yǎng)組和單一培養(yǎng)組的卵裂率和可用胚胎率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但序貫培養(yǎng)組的優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯高于單一培養(yǎng)組(P=0.015)。IVF和ICSI患者，單一培養(yǎng)組D3胚胎致密化的比例均明顯高于序貫培養(yǎng)組(P=0.001)。見表2。

表1 序貫培養(yǎng)組和單一培養(yǎng)組受精率Tab.1 Fertilization rates in sequential and single-step culture groups [η/%(n/N)]

在囊胚形成方面，序貫培養(yǎng)組的囊胚形成率和可用囊胚形成率高于單一培養(yǎng)組，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。單一培養(yǎng)組D5可用囊胚形成的比例高于序貫培養(yǎng)組，序貫培養(yǎng)組D6可用囊胚形成的比例高于單一培養(yǎng)組，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

3 討 論

自1978年ART開展并應(yīng)用于臨床以來，配子和胚胎培養(yǎng)技術(shù)得到了迅猛發(fā)展。胚胎體外培養(yǎng)是IVF-ET周期中的主要環(huán)節(jié)，其可直接影響胚胎體外發(fā)育甚至最終妊娠結(jié)局[7-8]。因此，一直以來，胚胎學(xué)家們期望通過改良胚胎體外培養(yǎng)體系來提高胚胎質(zhì)量，進(jìn)而改善IVF的結(jié)局。如何創(chuàng)建一種更為理想的胚胎培養(yǎng)體系一直是ART領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，目前也尚未明確哪種胚胎培養(yǎng)液對IVF的成功率更高[9]。培養(yǎng)液對于胚胎體外培養(yǎng)至關(guān)重要，培養(yǎng)液的組分、各成分含量、配比、pH值和滲透壓等均會影響胚胎的體外發(fā)育[5, 10]。20世紀(jì)80年代IVF和胚胎培養(yǎng)常用的培養(yǎng)液主要參照組織細(xì)胞的培養(yǎng)，因此并非理想的胚胎培養(yǎng)體系。近年來，胚胎培養(yǎng)體系有了較大改善，培養(yǎng)液的組成模擬了輸卵管的成分及其濃度，從而更好地滿足人類胚胎的需求[11]。隨著胚胎體外培養(yǎng)液在IVF領(lǐng)域的成功應(yīng)用，多種商業(yè)化供應(yīng)的培養(yǎng)液陸續(xù)出現(xiàn)，目前商業(yè)化供應(yīng)的胚胎體外培養(yǎng)液主要包括序貫培養(yǎng)液和單一培養(yǎng)液。序貫培養(yǎng)液遵循“回歸自然”的理念，是根據(jù)胚胎在著床前對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求以及生殖道內(nèi)的自然環(huán)境研制出來的[12]。目前常用的Vitrolife系列培養(yǎng)液就是序貫培養(yǎng)液，主要包括受精液、卵裂液和囊胚培養(yǎng)液。單一培養(yǎng)液遵循“讓胚胎來選擇”的原則，將胚胎發(fā)育過程中需要的營養(yǎng)組合成一個配方，由胚胎自行選擇需要的營養(yǎng)來攝取[13]。目前常用的Global和CSCC就是單一培養(yǎng)液，可以用于從合子到囊胚的培養(yǎng)。

表2 序貫培養(yǎng)組和單一培養(yǎng)組卵裂期胚胎發(fā)育情況Tab.2 Embryo development in cleavage stage in sequential and single-step culture groups [η/%(n/N)]

表3 序貫培養(yǎng)組和單一培養(yǎng)組囊胚形成情況Tab.3 Blastocyst formation in sequential and single-step culture groups [η/%(n/N)]

本研究主要比較探討了Vitrolife的序貫培養(yǎng)液體系和Irvine的單一培養(yǎng)液體系對人類早期胚胎發(fā)育的影響，結(jié)果顯示：在受精率和2PN受精率上，Irvine的CSCC培養(yǎng)液稍高于Vitrolife的G-IVF培養(yǎng)液受精率，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在卵裂率上，Irvine的CSCC培養(yǎng)液與Vitrolife的G1培養(yǎng)液組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在D3可用胚胎率上，Irvine的CSCC培養(yǎng)液稍低于Vitrolife的G1培養(yǎng)液，但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在D3優(yōu)質(zhì)胚胎率上，Irvine的CSCC培養(yǎng)液稍低于Vitrolife的G1培養(yǎng)液，其中在ICSI組中差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

另外，本文作者還觀察到：在G1培養(yǎng)體系中，胚胎形態(tài)表面光滑、均勻，而在CSCC培養(yǎng)體系中胚胎表面較為粗糙、有顆粒狀。無論是IVF組還是ICSI組，在CSCC培養(yǎng)液中培養(yǎng)的胚胎，D3致密化胚胎的比例均明顯高于在G1培養(yǎng)液培養(yǎng)的胚胎。CSCC中培養(yǎng)的胚胎其D3可用胚胎率和優(yōu)胚胎率有低于在G1培養(yǎng)液中培養(yǎng)的趨勢，原因也可能與CSCC中胚胎形態(tài)較為粗糙和不均勻造成評分時人為主觀地降低評分標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)。致密化是哺乳動物早期胚胎卵裂的重要特征，但其生物學(xué)作用尚不清楚。在IVF-ET中D3胚胎發(fā)生致密化不是常見的現(xiàn)象，一般情況下人類胚胎培養(yǎng)過程中第4天(D4)胚胎發(fā)生致密化是囊胚發(fā)育良好的指標(biāo)，D3發(fā)生早期致密化是非典型的胚胎發(fā)育現(xiàn)象[14]。PEY等[15]研究發(fā)現(xiàn)：鼠胚細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度與胚胎致密化有關(guān)，并參與調(diào)控細(xì)胞骨架系統(tǒng)的功能和定位。另有研究[16]顯示：胚胎細(xì)胞將長E-鈣黏蛋白依賴絲狀偽足擴(kuò)展到鄰近細(xì)胞是胚胎致密化所必需的，絲狀偽足成分(E-鈣黏蛋白、F-肌動蛋白和肌球蛋白-X等)的破壞可能影響細(xì)胞的致密化，肌凝蛋白-X過表達(dá)可以誘導(dǎo)小鼠胚胎過早發(fā)生致密化。劉秀鳳等[17]研究提示：致密化胚胎與未致密化的優(yōu)質(zhì)胚胎比較具有相似的植入潛能。王建業(yè)等[18]研究顯示：D3發(fā)生致密化的胚胎具有更好的發(fā)育潛能，可以作為IVF-ET中的優(yōu)選胚胎。

在囊胚形成率上，Vitrolife的G2培養(yǎng)液囊胚形成率和可用囊胚形成率均稍高于Irvine的CSCC培養(yǎng)液，但組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；另外，在CSCC中培養(yǎng)的囊胚，D5可用囊胚形成率高于在G2培養(yǎng)液中培養(yǎng)的囊胚；G2培養(yǎng)液中培養(yǎng)的囊胚D6可用囊胚形成率高于CSCC培養(yǎng)液，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。綜上，雖然Vitrolife的序貫培養(yǎng)液和Irvine的單一培養(yǎng)液設(shè)計理念上有所不同，各有所長，但在總體上2種培養(yǎng)體系中受精和胚胎早期發(fā)育無明顯差別。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者也開始對人類胚胎在不同培養(yǎng)液體系中的發(fā)育情況進(jìn)行了研究。2004年趙濟(jì)華等[3]實驗室分析比較了GⅢ體系和Quinns體系中卵母細(xì)胞的體外受精和胚胎發(fā)育的差異，結(jié)果提示：Quinns系列培養(yǎng)液似乎有助于卵母細(xì)胞的體外受精，而GⅢ培養(yǎng)液體系更有利于胚胎的早期發(fā)育及后期的著床。2013年，BASILE等[19]應(yīng)用實時動態(tài)觀察系統(tǒng)觀察75個贈卵周期中Global單一培養(yǎng)液和Quinns序貫培養(yǎng)液2種培養(yǎng)液體系中培養(yǎng)下的胚胎發(fā)育情況，結(jié)果顯示：2種培養(yǎng)液體系中胚胎發(fā)育的各個參數(shù)、胚胎植入率和臨床妊娠率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。2014年，顧軍[20]探討Earle’s培養(yǎng)液和HTF培養(yǎng)液對胚胎質(zhì)量和IVF-ET妊娠率的影響，結(jié)果顯示：與Earle’s培養(yǎng)液比較，采用HTF培養(yǎng)液培養(yǎng)可明顯提高優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率和著床率。2016年，宋冰冰等[4]比較Vitrolife培養(yǎng)基與Cook培養(yǎng)基對胚胎生長與妊娠結(jié)局的影響，結(jié)果顯示：2種培養(yǎng)基對2PN受精率、卵裂率、D3可用胚胎率和臨床妊娠率的影響等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。SFONTOURIS等[21]在一項前瞻性隨機(jī)研究中比較了Sage(Orion產(chǎn)品)和CSC(Irvine Scientific產(chǎn)品)2種商業(yè)化單一培養(yǎng)基對人類囊胚發(fā)育的差異，結(jié)果顯示：兩者在囊胚形成率、可用囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率方面均無明顯差異。LPEZ-PELAYO等[22]比較了SAGE-1單一培養(yǎng)液和Vitrolife序貫培養(yǎng)液對人胚胎受精、發(fā)育和臨床妊娠的影響，結(jié)果顯示：2種培養(yǎng)液組受精率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但是在優(yōu)質(zhì)胚胎產(chǎn)量上，SAGE-1單一培養(yǎng)液組明顯高于Vitrolife序貫培養(yǎng)液組；在種植率和臨床妊娠率上2組培養(yǎng)液體系比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究結(jié)果顯示：Vitrolife的序貫培養(yǎng)液體系和Irvine的單一培養(yǎng)液體系總體上對人類卵母細(xì)胞受精和早期胚胎發(fā)育的影響無明顯差異，均能較好地應(yīng)用于早期胚胎的體外培養(yǎng)。本研究結(jié)果為人類ART中胚胎培養(yǎng)體系的選擇和評估提供參考。近年來，隨著培養(yǎng)液的更新?lián)Q代和更合適的培養(yǎng)室設(shè)計及空氣處理，IVF的成功率有了較大的提高，但目前體外培養(yǎng)的胚胎著床率仍未能達(dá)到人們的高期望值，有待于進(jìn)一步探索、優(yōu)化和改善體外胚胎培養(yǎng)體系。此外，商品化的胚胎培養(yǎng)液組成成分的不同是否對子代的表觀遺傳學(xué)產(chǎn)生可遺傳的影響，目前也尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。