骨肉瘤特異生物診斷探針制備

王華 梁驥 王法佳 周磊 馬艷 張宇飛 傅桂蓮

(1北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132000；2廣西桂林醫(yī)學(xué)院；北華大學(xué) 3研究生院；4檢驗(yàn)學(xué)院)

細(xì)胞表面具有豐富與復(fù)雜的細(xì)胞表位，表位源于細(xì)胞內(nèi)染色體基因的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞往往是某些基因發(fā)生了結(jié)構(gòu)改變(丟失、插入、變異……)，這些改變會賦予腫瘤膜蛋白質(zhì)或其他物質(zhì)的改變從而使細(xì)胞表位更復(fù)雜，這也導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞表位的差異。因此依據(jù)這種差異，人們試想過很多的辦法，例如利用抗原抗體的方式進(jìn)行診斷或者治療。由于抗體制備與生產(chǎn)的某些嚴(yán)苛的限定因素，始終沒有更好地實(shí)現(xiàn)這一想法。而小寡核苷酸DNA或者RNA具有更多的特點(diǎn)：可以自發(fā)卷曲成三維空間結(jié)構(gòu)，可以進(jìn)行體外化學(xué)修飾(連接生物素、氨基、羧基、熒光物質(zhì)……)，而不改變與配體的結(jié)合能力，小寡核苷酸的制備、儲存、運(yùn)輸及應(yīng)用比抗體特別是單克隆抗體顯示更多的優(yōu)勢〔1～4〕。蛋白質(zhì)-核酸可以互相作為配基的理論基礎(chǔ)已被引入細(xì)胞膜表面配基的研究。指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)〔5～7〕的出現(xiàn)為腫瘤標(biāo)志物的篩選及特異診斷探針研制帶來了新的契機(jī)。SELEX技術(shù)的基本原理是利用分子生物學(xué)技術(shù)人工合成單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(SSDNAs)，DNAs或者RNAs，由于單鏈寡核苷酸片段能夠形成三維空間結(jié)構(gòu)〔8～10〕，理論上可以同各種靶分子結(jié)合。一個高通量(1 015～1 018)的寡核苷酸庫包容了所有可能的立體結(jié)構(gòu)，因此有可能從中篩到任何種類的靶分子高親和力配基。利用這一原理，將SSDNAs與靶細(xì)胞相互作用〔11～14〕，保留與靶標(biāo)結(jié)合的寡核苷酸配基，并以此為模板利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體外擴(kuò)增篩選獲得的配基。經(jīng)過幾輪或數(shù)十輪反復(fù)結(jié)合、擴(kuò)增、篩選過程，最終使高親和力的寡核苷酸配基即Aptamer得到富集。目前國內(nèi)外尚無對骨肉瘤生物探針的研制文獻(xiàn)報(bào)告。本研究以人骨肉瘤細(xì)胞(U-2 OS)為靶細(xì)胞，體外合成隨機(jī)序列的DNAs作為被選文庫，應(yīng)用細(xì)胞-SELEX技術(shù)去篩選與U-2 OS高度特異性結(jié)合的細(xì)胞適配體單鏈DNA(ssDNAs)，為骨肉瘤特異診斷建立適配體庫。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 建構(gòu)76 nt的ssDNA文庫：5′-ATC CAG AGT GAC GCA GCA 40(N) TGG ACA CGG TGG CTT AGT-3′及5′-異硫氰酸熒光素(FITC)-ATC CAG AGT GAC GCA GCA 40(N) TGG ACA CGG TGG CTT AGT-BIO-3′，兩端為固定序列引物，中間40個堿基為隨機(jī)序列，以上均由上海生工生物工程股份有限公司合成。人骨肉瘤U2-OS細(xì)胞(陽性細(xì)胞株)，購于武漢博士德生物工程有限公司。SGC7901胃癌細(xì)胞由上海徐匯區(qū)中心醫(yī)院饋贈。

1.2主要試劑 酵母tRNA(Fluka Analytical，cat.no 83853，USA)。胎牛血清(FBS，Invitrogen，USA)。鏈霉親和素瓊脂糖(GE Healthcare Life Scicence USA)。RPMI1640培養(yǎng)基、 McCoys′5A 培養(yǎng)基、青霉素、硫酸鏈霉素(武漢博士德生物工程公司)。胰蛋白酶(北京鼎國生物技術(shù)公司，中國)。 UNIQ-10柱寡聚核苷酸純化試劑盒(上海生工生物工程公司，中國)。 2×Taq PCR Master Mix(KT201-01)、載體pGEM-T、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根生化科技公司，中國)。

1.3主要儀器 凝膠成像分析系統(tǒng)(USA)。 熒光分光光度計(jì)(美國安捷倫)。WD-9403C型紫外分析儀(北京市六一儀器廠，中國)。756PG型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器公司，中國)。SIGMA低溫高速離心機(jī)(美國SIGMA公司)。TGL-18G 臺式高速冷凍離心機(jī)(太倉市醫(yī)療器械廠，中國)。TDZ5-WS低速多管架自動平衡離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器公司中國)。CO2培養(yǎng)箱(美國)，IX50-S8F2倒置式生物顯微鏡(OLYMPUS日本)，JY600C電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備公司，中國)。Eppendorf Hamburg22331型 PCR儀(德國)。JY-96G PCR儀(北京君意東方電泳設(shè)備公司，中國)。LNG-L98 真空濃縮干膠系統(tǒng)(太倉市科教器材廠，中國)。親和層析空柱管(長春寶泰克公司，中國)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)PCR擴(kuò)增及篩選 ①應(yīng)用McCoys′5A培養(yǎng)液對人骨肉瘤U-2 OS細(xì)胞培養(yǎng)傳代。試驗(yàn)前24 h在10 mm×10 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)5×106。②DNA寡核苷酸文庫用結(jié)合緩沖液制備成工作液500 μl放入EP管中，超級旋轉(zhuǎn)恒溫水浴中加熱95℃ 5 min后置于冰上備用。③24 h前準(zhǔn)備的目標(biāo)細(xì)胞洗滌后將冰上預(yù)冷的DNA寡核苷酸文庫加入細(xì)胞培養(yǎng)盤中搖勻(第一輪終濃度10 nmol/L，第二輪開始增加至100 nmol/L)、37℃振蕩40 min、洗滌后用細(xì)胞鏟收獲細(xì)胞、95℃加熱、離心，收集上清，-20℃保存或者進(jìn)入下一步試驗(yàn)。④PCR擴(kuò)增上清液中的ssDNA，制備高純度雙鏈DNA(dsDNA)。在這一過程中，首先對PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳循環(huán)次數(shù)與模板濃度。對于大量制備的dsDNA再應(yīng)用酚-氯仿進(jìn)行純化。⑤應(yīng)用鏈霉親和素瓊脂糖堿變性親和層析將dsDNA分離成單鏈，收獲正鏈DNAs作為下輪篩選的文庫。⑥熒光監(jiān)測特異寡核苷酸篩選過程。在第6、9、11、12和13輪篩選時(shí)進(jìn)行熒光監(jiān)測富集篩選的寡核苷酸。監(jiān)測前24 h，3×106U-2 OS細(xì)胞(60 mm×15 mm培養(yǎng)皿)用10% FBS的McCoy′5A培養(yǎng)液培養(yǎng)。應(yīng)用漂洗緩沖液漂洗細(xì)胞后，加入預(yù)冷的溶解在600 μl結(jié)合緩沖液中的ssDNA (1 000 nmol/L終濃度)，37℃，50 r/min 振搖40 min 。漂洗細(xì)胞后，應(yīng)用300 μl結(jié)合緩沖液浸潤細(xì)胞、用細(xì)胞鏟收獲細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管內(nèi)。加熱離心管95℃ 10 min，4℃ 12 000 r/min離心5 min，收獲上清液。其中部分上清液用于制備下一輪篩選的ssDNA文庫，部分上清液應(yīng)用FITC-標(biāo)記的上游引物和生物素(Biotin)-標(biāo)記的下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過鏈霉親和素瓊脂糖堿變性親和層析分離獲得FITC-正鏈DNA并進(jìn)行熒光測定。當(dāng)對照與陽性樣品熒光信號顯示明顯差異，而陽性樣品熒光信號之間無明顯漂移時(shí)終止篩選過程。⑦對最后一輪篩選的寡核苷酸文庫進(jìn)行克隆測序。pGM-T作為克隆載體，依據(jù)試劑盒克隆程序?qū)⒆詈蠛Y選的寡核苷酸文庫進(jìn)行克隆，選擇陽性克隆質(zhì)粒再進(jìn)行插入序列擴(kuò)增，選擇76 bp插入序列的克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序并保存，同時(shí)依據(jù)克隆序列的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源序列分組。

2 結(jié) 果

2.1PCR優(yōu)化 6、8或10個循環(huán)及10%、15%或者20%模板濃度為獲得無非特異擴(kuò)增產(chǎn)物條帶比較理想的參數(shù)。酚-氯仿法純化dsDNA顯示了較高純度。15%模板濃度，10個循環(huán)結(jié)果最佳，見圖1及圖2。11～13輪熒光曲線接近重疊提示篩選富集的寡核苷酸趨于穩(wěn)定，因此結(jié)束篩選。見圖3。

1：100 bp標(biāo)準(zhǔn)；2～5：6，8，10和12個循環(huán)；6：空白圖1 應(yīng)用15%模板濃度進(jìn)行PCR最佳循環(huán)次數(shù)的篩選

1：100 bp標(biāo)準(zhǔn)；2：純化后的dsDNA瓊脂糖凝膠電泳圖2 應(yīng)用酚-氯仿純化dsDNA的結(jié)果

黑色光譜曲線：胃癌細(xì)胞的陰性對照；紅色：第3輪篩選；藍(lán)色：第6輪篩選；綠色：第9輪篩選；粉色：第11輪篩選；紫色：第13輪篩選圖3 熒光光譜用于檢測寡核苷酸ssDNA與骨肉瘤細(xì)胞結(jié)合的篩選過程

2.2克隆與測序 對最后一輪篩選的寡核苷酸文庫進(jìn)行克隆。對克隆質(zhì)粒再進(jìn)行擴(kuò)增，保留正確插入序列的質(zhì)粒進(jìn)行測序，質(zhì)粒1～8含有76 bp寡核苷酸序列可以用于測序，見圖4。

1：50bp DNA標(biāo)準(zhǔn)；2～13:克隆質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果；14：空白對照圖4 質(zhì)粒插入序列檢測

2.3一級結(jié)構(gòu)分析并建立同源保守序列庫 例如包括含有GGTGGGGG，GGCGTTATTTG，TT(T/G)TTGG同源序列的適配體SEQ ID NO 9，11，13，67和68；包括含有AAC (A/G)CCCC，CTT(G/C)TT，CCCTGC同源序列的適配體SEQ ID NO14，21，33和37等。

3 討 論

骨肉瘤是臨床常見的青少年及老年人群的惡性腫瘤，男性發(fā)病率高；某些病例存在家族傾向?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)至少有一個基因與其相關(guān)，而且這個基因也與家族性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)，但是導(dǎo)致疾病的發(fā)生原因至今不清楚。由于肺部的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致該病高死亡率。臨床確診主要綜合病理學(xué)、血清學(xué)及影像學(xué)檢查結(jié)果，因此建立一種準(zhǔn)確、簡便、無創(chuàng)傷的診斷方法具有重要的臨床意義。SELEX技術(shù)主要應(yīng)用高豐度空間結(jié)構(gòu)的DNA或者RNA作為備選文庫，與靶物質(zhì)通過反復(fù)結(jié)合、解離和PCR擴(kuò)增富集，最終獲得與靶物質(zhì)高度親和的寡核苷酸(DNA或者RNA)。靶物質(zhì)可以是金屬離子、有機(jī)染料、氨基酸、抗體、肽、蛋白質(zhì)、核酸，甚至整個細(xì)胞、病毒及細(xì)菌等。細(xì)胞是一種多表位的靶物質(zhì)，蛋白質(zhì)是細(xì)胞膜表面復(fù)雜表位的主要成分。分化與未分化、癌細(xì)胞與正常細(xì)胞膜的表位差異為應(yīng)用整個細(xì)胞作為靶標(biāo)進(jìn)行特異寡核苷酸的篩選提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

特異探針篩選過程中，ssDNA文庫與靶細(xì)胞的濃度比對于SELEX 篩選至關(guān)重要。在前幾輪篩選過程中，二者的投入量多確保U-2 OS細(xì)胞有效捕捉核苷酸適配體。后幾輪的篩選，由于特異適配體已經(jīng)富集，因此減少了細(xì)胞的數(shù)量，由5×106減少到3×105。第6輪開始減少結(jié)合的反應(yīng)時(shí)間，由40 min減少到25 min進(jìn)一步減少非特異結(jié)合。

在SELEX技術(shù)中，PCR是重要的實(shí)驗(yàn)步驟。因?yàn)槊恳惠啅募?xì)胞-ssDNA復(fù)合物中分離開來的ssDNA都要制備成dsDNAs。為了獲得沒有非特異條帶的PCR產(chǎn)物-dsDNAs，每一輪的PCR都進(jìn)行了循環(huán)次數(shù)及模板濃度的摸索。本文應(yīng)用經(jīng)典氯仿-酚法對擴(kuò)增制備的dsDNAs進(jìn)一步純化去除引物，taq酶等，有效獲得了大量純化的dsDNAs。

在制備大量dsDNAs時(shí)，將Biotin標(biāo)記的反向引物引入PCR擴(kuò)增，因?yàn)樯锼嘏c鏈霉親和素具有極強(qiáng)的親和力，因此當(dāng)dsDNAs流經(jīng)鏈霉親和素瓊脂糖層析介質(zhì)時(shí)，Biotin標(biāo)記的負(fù)鏈寡核苷酸DNA被牢固吸附，而正鏈DNAs被洗脫和收獲作為下輪篩選的文庫。這是一種優(yōu)越于其他方式制備次級文庫的方法。應(yīng)用熒光分光光度計(jì)監(jiān)測篩選進(jìn)程是因?yàn)槠鋵Ρ攘魇郊?xì)胞儀的使用更簡便易行。

將第13輪篩選的寡核苷酸適配體經(jīng)過PCR擴(kuò)增、純化后，應(yīng)用常規(guī)分子克隆技術(shù)將適配體連接到pGM-T質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化到DH5a中。再經(jīng)歷陽性轉(zhuǎn)化菌落的培養(yǎng)、提取質(zhì)粒、PCR擴(kuò)增，選擇理想的克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序、同源序列編組并保存。

核酸適配體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高識別性和結(jié)合性及所具有的易合成、儲存、化學(xué)修飾及可以反復(fù)變性與復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過抗體制備與應(yīng)用范疇。因此，核酸適配體已經(jīng)在疾病的診斷、治療與藥物的開發(fā)等領(lǐng)域頗受關(guān)注。本研究以人骨肉瘤U-2 OS細(xì)胞為靶細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞-SELEX技術(shù)成功獲得了用于骨肉瘤診斷的特異性核酸適配體庫，這也為骨肉瘤未來的導(dǎo)向治療搭建了可行性平臺。