反相離子對色譜法對寡核苷酸藥物分析的進(jìn)展

楊洪淼，范慧紅

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

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反相離子對色譜法對寡核苷酸藥物分析的進(jìn)展

楊洪淼，范慧紅Δ

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

寡核苷酸藥物是近年來藥物研發(fā)領(lǐng)域中的熱點之一，相應(yīng)分析方法的研究也被廣泛開展，其中反相離子對色譜法以分離度高、易與MS對接等優(yōu)勢成為寡核苷酸分析中最常用的方法。本文綜述了反相離子對色譜法在寡核苷酸分析方面的新進(jìn)展，以下將從色譜柱、流動相，分離規(guī)律的探索，MS檢測器方面進(jìn)行系統(tǒng)介紹。

離子對試劑；高效液相色譜；寡核苷酸藥物；綜述

寡核苷酸藥物是指含有10～30個堿基的RNA或DNA分子，及其類似物，可以在基因水平上干擾致病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而達(dá)到治療疾病的目的。目前藥物研發(fā)的方向根據(jù)作用機理主要分為：反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide ,asON)，是指含有15～30個堿基的核酸分子或其類似物，能與特定的DNA、RNA以堿基互補配對的方式結(jié)合并阻止其轉(zhuǎn)錄與翻譯，這是一類經(jīng)典的寡核苷酸藥物，通常會進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以增加對體內(nèi)核酸酶的穩(wěn)定性，最常見的修飾為將磷酸二酯鍵中的一個非橋氧原子用硫原子取代，被稱為硫代寡核苷酸[1]；另一類是小分子干擾RNA(small-interfering RNAs，siRNAs)，通常為含有21～23 個堿基的單鏈或雙鏈RNA，可以引發(fā)RNA 干擾現(xiàn)象，即指由于目標(biāo)mRNA降解或翻譯抑制所引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象[2]；此外也有核酸適配體[3]等研究方向。至今FDA已批準(zhǔn)了數(shù)個寡核苷酸藥物的上市，如2013年獲批上市的米泊美生(mipomersen)，而處于臨床研發(fā)階段的藥物數(shù)量更多。由此可見，開展對寡核苷酸分析方法的研究工作非常必要。

寡核苷酸藥物的分子量較大，通常為6000～8000，同時在水中幾乎以陰離子形式存在，會形成一個負(fù)電荷聚集的分子體[4]。根據(jù)這樣的結(jié)構(gòu)特征，常用的分析方法有反相離子對色譜、親水色譜、離子交換色譜、毛細(xì)管電泳和PCR等方法[5-8]。其中反相離子對色譜以分離度高、結(jié)果穩(wěn)定、操作簡便和易與MS檢測器對接等優(yōu)勢，在近年的文獻(xiàn)中越來越多被使用到。本文通過列舉一些寡核苷酸藥物分析方法開發(fā)的實例，和對寡核苷酸類物質(zhì)分析方法研究的新進(jìn)展等內(nèi)容的介紹，希望對今后這一類新型藥物分析方法的開發(fā)提供參考。

1 色譜柱

使用離子對色譜方法對寡核苷酸進(jìn)行分析時，最常用的色譜柱即C18柱。 Fountain等[9]使用小粒徑的C18柱(4.6 mm×75 mm，2.5 μm)可同時將5～30個堿基的寡核苷酸實現(xiàn)N與N-1序列的分離。Studzińska等[10]考察了6根UPLC色譜柱對含有細(xì)微差別的多個寡核苷酸的分離效果，以C18柱和苯基柱為最優(yōu)，并同時考察了離子對試劑的種類和濃度對分離的影響。小粒徑色譜柱可以縮短寡核苷酸分子在固定相內(nèi)擴散的路徑，從而抑制峰形展寬，更有利于分離。此外采用高分子骨架的色譜柱可以對偏堿性的流動相及較高的柱溫條件更加耐受。

近年來一些新型的色譜柱也被用于寡核苷酸的分析中。Sharma等[11]，Xiong等[12]嘗試采用聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物為固定相的整體柱(monolithic column)可以將修飾基團(tuán)連接到不同堿基位點的寡核苷酸同分異構(gòu)體進(jìn)行成功分離。Biba等[13]，Zimmermann等[14]使用一種結(jié)合離子交換與反相2種分離模式的色譜柱對20個堿基左右的寡核苷酸進(jìn)行分析，分離過程同時利用了寡核苷酸的負(fù)電性和疏水性。文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)若使用離子對試劑作為流動相，分離仍以反相模式為主導(dǎo)；若使用離子交換色譜的條件，如NaCl溶液梯度洗脫，所得色譜圖與只使用離子交換色譜柱的結(jié)果差異非常大，說明此時分離過程為混合模式，并且使用NaCl或NaBr作為流動相可以顯著改善寡核苷酸的峰形。Studzińska等[15]在實驗室制備中作為新型固定相將硅膠基質(zhì)上同時鍵合1個疏水基團(tuán)和1個親水基團(tuán)，根據(jù)疏水基團(tuán)的不同分為酰胺型和膽固醇型，此種類型固定相首次應(yīng)用于寡核苷酸的色譜分析中，結(jié)果表明它們的分離效果與C18柱相當(dāng)，但分離時間會更短。

2 流動相

由于寡核苷酸具有強烈的負(fù)電性，在常規(guī)的反相色譜條件下保留較弱，所以需要在流動相中添加離子對試劑。強離子對試劑如季銨鹽會使寡核苷酸產(chǎn)生強保留，但同時會削弱不同堿基疏水性差異對保留的影響，反而不利于寡核苷酸藥物與雜質(zhì)的分離[16]。而三乙胺(triethylamine，TEA)體系為較弱的陽離子對體系，在寡核苷酸分析中最為常用。三乙胺/醋酸(triethylamine/acetic acid，TEAA)系統(tǒng)是最先被應(yīng)用的，通常30個堿基以內(nèi)未修飾的寡核苷酸均可以達(dá)到N與N-1序列的分離[17]。但硫代寡核苷酸由于硫原子取代了氧原子，使得每一個磷原子形成為一個手性中心，理論上N個堿基長度的硫代寡核苷酸可以形成2n-1個非對映異構(gòu)體，這些異構(gòu)體在色譜保留行為上的細(xì)小差異最終造成嚴(yán)重的峰形展寬[4]。Apffel等[18]開創(chuàng)性地引入六氟異丙醇(HFIP)至離子對系統(tǒng)中，該試劑可以有效地抑制硫代寡核苷酸的峰形展寬，從而提高分離度。因為流動相中HFIP會顯著降低TEA在水中的溶解度，所以推測HFIP會迫使TEA更多地貼合在硅膠柱的表面，使硅膠表面形成一層穩(wěn)定的TEA+膜，此時的分離模式更傾向于離子交換，從而抑制對映異構(gòu)體由于疏水性差異造成的峰形展寬[4]。

Cantide、CT102和流感泰得[19-21]均為研發(fā)中的硫代反義寡核苷酸藥物，分別為20、20和13個堿基長度。它們均可以應(yīng)用C18柱、離子對試劑TEA/HFIP的方法使主成分與雜質(zhì)達(dá)到良好地分離。硫代寡核苷酸的合成雜質(zhì)主要由短序列和硫代失敗序列構(gòu)成，其中以5’N-1序列和一個氧未被硫代(P=S/O)的N序列最多，由于雜質(zhì)與主成分結(jié)構(gòu)極為相似，分離難度很大。之前通常采用陰離子交換色譜法分析P=S/O雜質(zhì)及其他雜質(zhì)，但離子交換色譜對N-1雜質(zhì)無能為力，需再采用毛細(xì)管電泳方法分析N-1雜質(zhì)。而反相離子對色譜法的優(yōu)勢是可以同時分離N-1雜質(zhì)和P=S/O雜質(zhì)，簡化了分析步驟。根據(jù)文獻(xiàn)中優(yōu)化的結(jié)果，通常TEA與HFIP的濃度范圍分別為10～40 mmol/L和100～400 mmol/L的時候，更利于20個堿基長度左右的硫代寡核苷酸與雜質(zhì)的分離。但不同序列的硫代寡核苷酸適用的TEA/HFIP的比例各不相同，需要通過實驗優(yōu)化。此外由于HFIP在乙腈中的溶解度很小，所以流動相中一般使用甲醇作為有機相。

除此之外，N，N-二甲基丁胺/醋酸(DMBAA)、四乙基溴化銨/醋酸(TEAB)、醋酸正己基銨(HAA)等離子對系統(tǒng)也被應(yīng)用于寡核苷酸的反相色譜分析中[10,22-23]。Studzińska等[10]比較了DMBAA與TEAA對未修飾寡核苷酸分析的差別，結(jié)果顯示DMBAA雖增加保留時間但會降低分離度。Levin等[24]嘗試開發(fā)多種離子對試劑聯(lián)合應(yīng)用于siRNA的分析，結(jié)果顯示TEA/丙胺(PA)的組合可使整體分離度提高，并可明顯改善峰形。

3 分離規(guī)律的探索

3.1 保留時間的預(yù)測 由于組成寡核苷酸的核苷的疏水性各不相同，A和T的疏水性要大于C和G，所以長度或序列不相同的寡核苷酸在反相色譜中的保留時間也不同。Gilar等[25]建立的數(shù)學(xué)模型可以預(yù)測10～60個堿基內(nèi)不同長度與序列的寡核苷酸的保留行為，采用的色譜條件為100 mmol/L TEAA離子對試劑，pH為7。并進(jìn)一步設(shè)計39個寡核苷酸對此模型進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示預(yù)測值與實測值的相關(guān)性很好，r2為0.946。此研究可用于合成寡核苷酸的純化中，通過該數(shù)學(xué)模型即可得到最佳的梯度洗脫的初始有機相比例，節(jié)省優(yōu)化色譜條件的時間。在此基礎(chǔ)上，Sturm等[26]也建立了對寡核苷酸保留時間的預(yù)測模型，并且有2個進(jìn)步，一是使用支持向量回歸(SVR)的方法代替單一的線性回歸或?qū)?shù)回歸，SVR可以模擬非線性關(guān)系；二是將寡核苷酸二級結(jié)構(gòu)的信息引入模型中，從而提高預(yù)測的準(zhǔn)確性。Lei等[27]建立的定量結(jié)構(gòu)-保留時間關(guān)系(QSRR)模型可以將寡核苷酸的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行量化的輸入，并且可以很好地預(yù)測多個柱溫下的保留時間。而Studzińska等[28]進(jìn)一步將QSRR模型成功應(yīng)用于寡核苷酸在酰胺柱和膽固醇柱上的保留行為的預(yù)測。

3.2 流速與柱溫對分離的影響 由于寡核苷酸的傳質(zhì)速率較低，根據(jù)Van Deemter方程，影響塔板高度最主要的參數(shù)項為傳質(zhì)阻抗項，所以影響傳質(zhì)速度的因素都將顯著影響寡核苷酸的分離?；诖死碚?，降低流速和提高柱溫被認(rèn)為是提高寡核苷酸分離度的有效手段，如流速0.5 mL/min和柱溫50 ℃為常見色譜條件。駱雪芳等[29-30]對此進(jìn)行了深入的研究，設(shè)計19、20、21個堿基的不同長度的3條寡核苷酸鏈，和相同長度(20個堿基)但序列上有細(xì)微差異的3條寡核苷酸鏈。通過實驗考察流速和柱溫的變化對分離度的影響。結(jié)果顯示，對于堿基數(shù)目較大、以長度差異為主要特征的寡核苷酸序列，增加溫度是改善分離的有效途徑。而對于同長序列，提高溫度的影響各不相同，由于疏水性強的堿基處于末端對保留貢獻(xiàn)大，若處于中間位置則取決于其在空間結(jié)構(gòu)中的位置，所以疏水堿基處于末端等優(yōu)勢位置時，隨溫度的改變保留影響不大，處于中間等劣勢位置容易受到溫度的影響，產(chǎn)生較大的保留改變。對于流速的影響，所有寡核苷酸鏈隨流速增加，保留均迅速下降，分離度也呈下降趨勢，但基于長度差異的樣品的分離度下降得更明顯，此類樣品應(yīng)注重流速的優(yōu)化，但過低的流速會使樣品縱向擴散增加，同樣發(fā)生分離度下降情況。

4 MS檢測器

反相離子對色譜(IP-HPLC)通過添加揮發(fā)性的離子對試劑可以與質(zhì)譜更好地對接，而質(zhì)譜由于其高靈敏度和快速定性等特性成為寡核苷酸藥物分析中的重要分析手段。

反相離子對色譜與ESI-MS聯(lián)用在藥物代謝研究中發(fā)揮著重要作用[31-33]。Wei等[31]采用IP-HPLC-MS/MS的方法對硫代寡核苷酸藥物GTI-2040的藥代產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。IP-HPLC的條件可以得到N與N-1序列的分離，高分離度是藥代產(chǎn)物鑒定的前提。文中使用SOS寡核苷酸序列分析軟件(the simple oligonucleotide sequencer software)，共鑒別了5種代謝產(chǎn)物。Dai等[32]也采用上述IP-HPLC-MS/MS的方法對硫代寡核苷酸藥物G3139的藥代產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并建立了G3139和3個代謝產(chǎn)物的定量分析方法，最小定量限(LOQ)為17.6 nmol/mL。

使用MS/MS對短鏈的寡核苷酸進(jìn)行測序已是較為成熟的方法[34]，但經(jīng)過化學(xué)修飾的寡核苷酸，裂解行為發(fā)生改變，測序工作則更具挑戰(zhàn)。Kretschmer等[35]采用IP-HPLC-MS/MS的方法對化學(xué)修飾的siRNA進(jìn)行測序，待測物包含2’-O-甲基化和硫代2種修飾方式，該方法的建立可以很好地對寡核苷酸合成的過程進(jìn)行實時監(jiān)測。

HFIP可以顯著提高寡核苷酸的離子化效率，提高質(zhì)譜檢測的靈敏度。近年來對適用于質(zhì)譜的離子對試劑的研究也很多[36-39]。McGinnis等[36]發(fā)現(xiàn)小于100 mmol/L的HFIP對質(zhì)譜的信號增強作用更明顯，比較了13種烷基胺分別與HFIP組成離子對試劑對質(zhì)譜信號的增強作用，得出待測物寡核苷酸的疏水性與離子對試劑的選擇關(guān)系很大，10 mmol/L二異丙胺(DIPA)和25 mmol/L HFIP適用于大部分親水性的siRNA，15 mmol/L三丙胺(TPA)和50 mmol/L HFIP適用于中等疏水性的未修飾DNA片段，10 mmol/L二異丙基乙胺(DIEA)和50 mmol/L HFIP適用于疏水性更強的硫代寡核苷酸。

此外也有多篇文獻(xiàn)是與ICP-MS聯(lián)用或與MALDI-TOF-MS聯(lián)用的應(yīng)用實例[40-42]。Vallone等[40]采用IP-HPLC的方法將短鏈DNA進(jìn)行分離和收集，后采用MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定，液相步驟中所采用的離子對試劑為TEAA。Studzińska等[42]通過IP-HPLC與ICP-MS聯(lián)用的方式建立了血漿中硫代寡核酸的含量測定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證。離子對試劑采用TEA/HFIP，但發(fā)現(xiàn)高濃度的HFIP會產(chǎn)生較高的背景干擾。

5 展望

綜上所述，反相離子對色譜法是寡核苷酸分析的一種非常有效的手段，今后的研究方向一方面為更多新型的固定相被應(yīng)用，如兼具反相與離子交換模式的固定相，以及更多的離子對試劑被開發(fā)，尤其是可以提高M(jìn)S檢測靈敏度的離子對試劑；另一方面反相離子對色譜法分析寡核苷酸的分離機理及分析規(guī)律也將更多地被揭示。

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(編校：王儼儼)

Progress of ion-pairing reverse liquid chromatography for analysis of oligonucleotides

YANG Hong-miao, FAN Hui-hongΔ

(National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050)

Therapeutic oligonucleotides have been one of the hottest areas in R&D of drugs in recent years.The research of analysis method has been widely carried out.Ion-pairing reverse liquid chromatography is the most commonly used method for good resolution and easy docking with MS.A review is presented here on the progress of oligonucleotides analysis with ion-pairing reverse liquid chromatography.The column, mobile phase, MS detection, mechanism of analysis will be discussed.

ion-pairing agents; HPLC; therapeutic oligonucleotides; review

楊洪淼，女，碩士，助理研究員，研究方向：生化藥品的質(zhì)量分析和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，E-mail：yanghongmiao@163.com；范慧紅，通訊作者，女，博士，研究員，研究方向：生化藥品的質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

R917

A

1005-1678(2015)07-0161-04