寡核苷酸藥物及寡核苷酸制備技術(shù)研究進展

汪小龍，咸靜女，陳剛，彭海波

中國海洋大學(xué) 海洋生命科學(xué)學(xué)院 生物工程系，山東 青島 266003

對于癌癥、病毒性感染等疾病，迄今臨床上仍缺少理想的特效藥物。隨著人類及重要模式生物基因組測序的完成，以及功能基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入，與疾病相關(guān)的分子靶標(biāo)不斷被發(fā)現(xiàn)和認識，為基因治療提供了前提。在過去的幾十年里，人工合成的寡核苷酸已經(jīng)廣泛應(yīng)用于靶向基因治療的研究，主要包括反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotides, ASODN)、小干擾 RNA(Small interference RNA, siRNA)、轉(zhuǎn)錄因子誘餌(Decoy)、核酶 (Ribozyme)、脫氧核酶 (DNAzyme)、反基因 (Antigene)、CpG寡核苷酸和核酸適配體(Aptamer) 等。其中ASODN和siRNA是最常用的基因調(diào)控工具，獲得廣泛應(yīng)用，并已被開發(fā)為基因治療藥物。目前，寡核苷酸主要采用化學(xué)方法合成，其初產(chǎn)品純度低，難以純化，大量制備成本十分高昂，大大限制了寡核苷酸藥物的研究和應(yīng)用。本文綜述了寡核苷酸藥物的類別、作用原理及其特點，指出了寡核苷酸常規(guī)化學(xué)制備方法存在的問題，并介紹了新型核酸擴增及寡核苷酸制備方法的研究進展。

1 寡核苷酸藥物的類別及其作用原理

1.1 反義寡核苷酸

反義寡核苷酸 (Antisense oligonucleotides,ASODNs) 是指人工合成的、與特定基因互補的寡核苷酸 (DNA或 RNA) 及其類似物，長度為13?25個堿基的核酸片段，它可以通過堿基互補配對原則結(jié)合于靶基因或靶RNA上，從而抑制基因的表達[1]。很多遺傳性、代謝性和病毒性疾病都是由于基因表達異常引起的。反義寡核苷酸作為藥品的原理是利用堿基互補配對原則與特定的信使RNA (Messenger RNA，mRNA) 進行配對，抑制其表達，阻斷遺傳信息從 DNA傳遞到蛋白質(zhì)。根據(jù)核酸雜交原理，反義寡核苷酸能與特定的基因、病毒核酸或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，特異性抑制致病基因或病毒基因的表達。通過反義寡核苷酸抑制致癌基因或病毒的關(guān)鍵編碼基因，可特異性抑制腫瘤細胞增殖生長并誘導(dǎo)細胞凋亡[2]。靶向mRNA或 microRNA的反義寡核苷酸，已被廣泛用作分子生物學(xué)的研究工具，以特異性和選擇性地下調(diào)特定基因的表達?；虮磉_的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)小分子藥物主要作用于致病蛋白質(zhì)，而反義寡核苷酸藥物則直接作用于致病基因本身，因此比小分子化學(xué)藥物更具選擇性，而且具有高效、低毒、穩(wěn)定有效、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，是理想的抗癌和抗病毒藥物[3]。第一個通過美國食品及藥品管理局 (Food and Drug Administration，F(xiàn)DA) 咨詢委員會認證并應(yīng)用于臨床的反義核酸藥物是用于治療艾滋 (AIDS) 病人巨細胞病毒感染的視網(wǎng)膜炎的福米韋生 (Fomivirsen或Virtravene)[4]。然而，早先的實驗室或臨床研究中一些反義核酸穩(wěn)定性、特異性和有效性不高，并且存在嚴重的毒副作用，因此學(xué)術(shù)界一度對反義核酸藥物產(chǎn)生質(zhì)疑，并導(dǎo)致上世紀末反義核酸藥物的研發(fā)相對較為緩慢。

然而，近年來一些高效的新型反義核酸藥物的出現(xiàn)，使反義核酸藥物研究得以復(fù)興。反義寡核苷酸作為用于抗腫瘤、抗病毒治療的藥物，是目前最有應(yīng)用前景的基因靶向治療藥物。目前有數(shù)十種反義寡核苷酸藥物正在進行臨床試驗或動物實驗，針對包括癌癥、肥胖、心血管疾病、精神病、代謝性疾病和病毒感染等。靶向作用于miRNA或 mRNA的反義寡核苷酸預(yù)計能用于治療多種人類疾病。2013年 1月美國 ISIS公司和Genzyme公司合作的一大成果——反義寡核苷酸藥物Mipomersen (商品名KYNAMRO?) 通過美國FDA認證[5-6]。Mipomersen是合成的烷基修飾反義寡核苷酸輔助降脂藥物，通過抑制載脂蛋白ApoB-100的mRNA，以降低家族性高膽固醇血癥(HoFH) 患者的低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)、載脂蛋白B (Apo B)、總膽固醇 (TC) 和非高密度脂蛋白膽固醇 (非高密度脂蛋白C)[7-9]。

如圖1所示，針對成熟mRNA，既可以設(shè)計反義寡核苷酸，使其與mRNA結(jié)合形成雜合體，利用RNase H識別并酶解DNA:RNA雜合體的作用，使mRNA降解，從而抑制基因表達；也可以針對mRNA 5′-非翻譯區(qū)設(shè)計反義寡核苷酸，使其翻譯受阻。另外，針對前體mRNA，還可以在內(nèi)含子與外顯子剪切位點處設(shè)計反義寡核苷酸，使其不能正常剪切，稱為剪切捕獲 (Splicing arrest)，此方法已經(jīng)成功應(yīng)用于杜氏肌營養(yǎng)不良 (Duchenne muscular dystrophy，DMD) 的基因治療[10-14]。DMD 是抗肌萎縮蛋白 (肌營養(yǎng)蛋白) 外顯子跳讀 (Exon skipping) 引起的。2016年9月19日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Sarepta Therapeutics公司的反義RNA藥物Eteplirsen (Exondys 51)，用于治療外顯子51跳讀型杜氏肌營養(yǎng)不良。Eteplirsen通過靜脈注射給藥，可幫助51號外顯子跳讀DMD患者合成一些抗肌萎縮蛋白，延緩疾病進程，是FDA批準(zhǔn)的首個DMD藥物。

圖1 反義寡核苷酸設(shè)計原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of antisense oligonucleotide.

圖2 RNA干擾原理示意圖 (圖片引自文獻[15])Fig. 2 Schematic diagram of RNA interference[15].

1.2 小分子干擾RNA

小分子干擾RNA (Small interfering RNA, siRNA)是一類長度在20?25 bp的雙鏈RNA片段。siRNA通過與特定的核酸序列互補而影響特定基因的表達，在生物體內(nèi)許多代謝過程中扮演重要角色。RNA干擾的原理如圖2所示，siRNA通過結(jié)合到靶標(biāo) mRNA上使其降解或抑制其翻譯[15]。Hamilton等于1999年首先在Science雜志報道發(fā)現(xiàn)了 siRNAs在植物轉(zhuǎn)錄后基因沉默中的作用[16]。Lagos-Quintana等2003年在Nature雜志報道了化學(xué)合成的 siRNA可以在哺乳動物細胞中引起RNAi作用[17]。隨后一系列的發(fā)現(xiàn)激發(fā)了學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界應(yīng)用 RNAi技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究和藥物開發(fā)上的熱情。作為基因治療藥物研究的熱點，小分子干擾RNA研究方興未艾，然而至今尚未有siRNA藥物開發(fā)成功上市。究其原因，是由于siRNA與靶標(biāo)的結(jié)合并非一一對應(yīng)，而是具有一定的非特異性，容易產(chǎn)生脫靶效應(yīng)[18-19]。與反義寡核苷酸相比，siRNA既有級聯(lián)放大效應(yīng)帶來的作用顯著、需要劑量低的優(yōu)點，但又有穩(wěn)定性差、容易被降解和難以被輸送到靶細胞的缺點。

1.3 核酸適配體

核酸適配體 (Aptamer) 是一類由化學(xué)合成的單鏈RNA或單鏈DNA寡核苷酸組成的小分子核酸配基[20]。其原理如圖3所示，核酸適配體能夠折疊形成高級結(jié)構(gòu)，并通過識別特異的三維結(jié)構(gòu)，與其靶標(biāo)進行相互作用，具有高特異性和親和性，故而又有化學(xué)抗體之稱。

與普通的蛋白抗體相比，核酸適配體有諸多優(yōu)點：一是由于其分子量較低 (8–25 kDa)，因此能夠快速滲透組織；二是適配體在體內(nèi)幾乎不會引起免疫反應(yīng)[21]；三是由于核酸適配體分子本質(zhì)上具有很強的熱穩(wěn)定性；四是核酸適配體識別范圍非常廣，能夠識別離子、藥物、毒素、蛋白質(zhì)[22]、病毒[23]、細菌[24]、癌細胞[25]，甚至腫瘤和組織[26-27]。

近年來，核酸適配體已被應(yīng)用于臨床研究，例如能與血管內(nèi)皮生長因子特異性結(jié)合的一種RNA適配體藥物Macugen已被美國FDA批準(zhǔn)用于老年濕性黃斑變性 (Wet age-related macular degeneration) 以及家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變 (Familial exudative vitreoretinopathy) 的治療[28-30]。另外，如表1所示，目前還有多種適配體藥物處于臨床試驗階段。

表1 處于臨床試驗階段的治療性核酸適配體Table 1 Therapeutic aptamers in clinical trials stage

1.4 三股螺旋寡核苷酸

通過特異性識別 DNA雙螺旋中的多聚嘌呤或多聚嘧啶區(qū)域，寡核苷酸能夠與DNA雙螺旋的大溝或小溝結(jié)合形成局部三股螺旋結(jié)構(gòu)[31-33]，被稱為三股螺旋寡核苷酸 (Triplex-forming oligonucleotide,TFO)。如圖4所示，TFO能夠?qū)δ繕?biāo)基因有效定位及封鎖，在轉(zhuǎn)錄水平抑制基因表達[34]，或在人體細胞中直接對基因組 DNA進行修飾以修復(fù)遺傳損傷[35]，有著重要應(yīng)用潛力和研究價值。

圖3 核酸適配體識別靶標(biāo)示意圖Fig. 3 Schematic diagram of aptamer binding to its target.

圖 4 三股螺旋寡核苷酸抑制轉(zhuǎn)錄延伸 (圖片引自文獻[34])Fig. 4 Triplex-forming oligonucleotide block the transcription elongation[34].

1.5 轉(zhuǎn)錄因子誘餌寡核苷酸

轉(zhuǎn)錄因子誘餌寡核苷酸 (Decoy ODN) 是新一代強有力的反義基因策略，用于治療多種疾病，并可確定某種特定基因表達的分子機制。如圖 5所示，誘餌寡核苷酸是雙鏈的，其序列與順式作用元件的序列是一致的，因此能夠通過競爭性結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄因子的功能作用。因此，用于轉(zhuǎn)染的雙鏈decoy ODN能夠減弱基因組中真正的順式作用元件和反式作用元件的相互作用，導(dǎo)致結(jié)合在內(nèi)生性順式元件上的反式因子被移除，控制目標(biāo)基因的表達，從而發(fā)揮基因治療作用[36]。

轉(zhuǎn)錄誘餌寡核苷酸已被試用于多種人類腫瘤和遺傳性疾病的基因治療。Morishita研究組以轉(zhuǎn)錄因子E2F的轉(zhuǎn)錄誘餌來抑制動脈粥樣硬化和動脈內(nèi)膜增生相關(guān)基因的表達，以治療冠心病和血管增殖性心血管疾病[36-38]。如表2所示，目前還有很多轉(zhuǎn)錄誘餌寡核苷酸正在進行臨床研究，預(yù)期具有良好的應(yīng)用前景。

圖 5 誘餌寡核苷酸法抑制轉(zhuǎn)錄因子 (TF) 的功能(圖片引自文獻[36])Fig. 5 The decoy oligonucleotide approach to block the function of the transcription factor (TF)[36].

1.6 核酶和脫氧核酶

早在1981年，Zaug等發(fā)現(xiàn)四膜蟲rRNA的前體在沒有蛋白質(zhì)酶的催化作用下能專一性地催化寡核苷酸底物的連接與切割，證明RNA分子也具有催化活性，稱之為核酶 (Ribozyme)[39]。直到20世紀80年代末90年代初，核酶的結(jié)構(gòu)才有了初步的了解，是一種簡單的催化結(jié)構(gòu)域——錘頭結(jié)構(gòu) (Hammerhead ribozyme)[40]。核酶可以很容易地用化學(xué)方法合成，隨著對核酶功能以及結(jié)構(gòu)研究的不斷深入，核酶在抑制目的基因表達的研究過程中得到了廣泛的應(yīng)用。

由于核酶具有不穩(wěn)定性，且利用化學(xué)修飾的過程比較復(fù)雜，1997年Santoro等通過體外篩選的方法設(shè)計出了一種依賴Mg2+離子、可特異性切割RNA的脫氧核酶 (DNAzyme)[41]。如圖6所示，DNAzyme有兩條任意可變的結(jié)合臂 (armⅠ和armⅡ)，中間的催化中心含有 14–15個堿基的保守序列。其中10–23 DNAzyme對底物RNA的要求是切割部位核心序列含有RY (R=A/G, Y=C/U)。與核酶相比，DNAzyme更易合成，對化學(xué)物質(zhì)或核酸酶有較高的抵抗力，而且 DNAzyme對于DNA:RNA 雜合鏈與RNA:RNA 雙鏈在酶的評價指標(biāo)方面 (如底物的選擇性、靶向性、酶的轉(zhuǎn)換率、催化效率等)，與核酶相比均有所提高[41]。DNAzyme目前已經(jīng)廣泛用于治療肝炎[42]、艾滋病[43]、癌癥[44-46]等重大人類疾病的研究中。

2 寡核苷酸大規(guī)模制備技術(shù)存在的問題

規(guī)?；a(chǎn)是藥物開發(fā)的基礎(chǔ)，這一點對于反義寡核苷酸藥物尤為重要。反義寡核苷酸藥物是目前最為成熟的寡核苷酸藥物，但由于其沒有級聯(lián)放大作用，在臨床和動物實驗中使用劑量大，高達 25?50 mg/kg[47]或 800?1 000 mg/周[48]。因此，作為藥物的寡核苷酸必須能夠規(guī)?；a(chǎn)，合成克級甚至千克級的寡核苷酸，并要降低成本，才有可能開展臨床和動物實驗。目前寡核苷酸幾乎都是使用化學(xué)方法合成，即采用固相亞磷酰胺三酯法合成，并用高效液相色譜分離純化。常規(guī)的DNA合成儀只能合成毫克級的寡核苷酸，大規(guī)模DNA合成必須采用克級和千克級DNA合成儀，如GE Healthcare公司生產(chǎn)的?KTA OligoPilot系列。目前僅有少數(shù)大型國際生物制藥公司，如美國ISIS公司和丹麥的Santaris公司，才有能力合成千克級的寡核苷酸，開展反義藥物的大規(guī)模臨床研究。國內(nèi)僅有軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院王升啟等開展了寡核苷酸大規(guī)模合成及動物實驗[49]，但目前尚無核酸藥物上市或進入臨床實驗。究其主要原因，大規(guī)模合成寡核苷酸，儀器設(shè)備成本過于高昂，一直是寡核苷酸藥物研究的瓶頸。

表2 用誘餌寡核苷酸作為基因治療的潛在靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子Table 2 Transcription factors as potential therapeutic targets for gene manipulation by using decoy oligonucleotides

圖 6 兩種 DNAzyme (8–17和10–23) 與底物RNA結(jié)合和切割位點示意圖 (圖片引自文獻[41])Fig. 6 The binding and cleaving of the RNA substrates by two different (8–17 and 10–23) DNAzymes[41].

另外，化學(xué)合成寡核苷酸初產(chǎn)品被雜質(zhì)和截短的錯誤序列 (又叫失敗序列) 所污染，使產(chǎn)物純化十分困難。產(chǎn)生這些失敗序列的原因是在合成過程中脫三苯甲基 (Detritylation)、耦合 (Coupling)、硫化 (Sulfurization) 或保護 (Capping) 等反應(yīng)不完全造成的，因此，必須對寡核苷酸粗產(chǎn)品進行純化。然而合成寡核苷酸中最難以除去的雜質(zhì)是大量 (n–1) 缺失序列 (與完整長度為n的寡核苷酸相比僅相差一個核苷酸)。對于長度為18–21堿基對的寡核苷酸，用高效液相色譜法幾乎無法從產(chǎn)品中完全除去 (n–1) 缺失序列[50]。此外，合成過程需要采用多種有害化學(xué)試劑，例如去保護試劑——三氯乙酸 (TCA) 或二氯乙酸 (DCA)，必須溶解在鹵化溶劑中 (通常是二氯甲烷)。二氯甲烷具有高毒性、高揮發(fā)性和致癌性。因此，大規(guī)模的寡核苷酸生產(chǎn)不僅成本高昂，而且涉及到使用和處理危險化學(xué)品，對環(huán)境和人體存在潛在的威脅。

3 核酸擴增技術(shù)應(yīng)用于制備寡核苷酸

寡核苷酸在現(xiàn)代分子生物技術(shù)和生物制藥研究中應(yīng)用十分廣泛。對具有特定序列的目標(biāo)寡核苷酸進行擴增，不僅是一個需要克服的技術(shù)難題，而且在生物醫(yī)藥科學(xué)研究中具有重要的應(yīng)用價值。商業(yè)化藥物生產(chǎn)需要大量 (以千克計) 的寡核苷酸。傳統(tǒng)的化學(xué)合成寡核苷酸不僅成本高昂，而且初產(chǎn)品純度低、難以純化，十分不利于臨床研究和大規(guī)模藥物生產(chǎn)。因此，開發(fā)一種簡單、經(jīng)濟和安全的寡核苷酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)方法已成為必要，而采用生物技術(shù)，用核酸擴增方法制備寡核苷酸無疑是最佳方案。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase chain reaction,PCR) 技術(shù)自誕生以來[51]，一直是核酸擴增的主要方法。PCR和逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)在用于擴增有足夠長度的DNA和RNA時簡單而有效。但無法用PCR技術(shù)直接擴增短鏈寡核苷酸和siRNA。因為它們往往只有18–30個核苷酸的長度，無法設(shè)計一對特異性PCR引物。用PCR來擴增寡核苷酸或 siRNA，首先必須設(shè)法將目標(biāo)延長 (如加接頭或使用通用引物)，如此不可避免地會在產(chǎn)物中引入非目標(biāo)序列。這在檢測分析方法中沒有問題，但對于制備方法而言，非常不利于后期分離純化。而且由于底物是修飾性dNTPs，價格非常昂貴，產(chǎn)物中如果含有非目標(biāo)序列，會造成底物 (dNTPs)的浪費，是難以接受的。另外，更重要的是PCR只是將寡核苷酸引物延伸，PCR擴增產(chǎn)物的分子數(shù)不可避免地受輸入寡核苷酸引物分子數(shù)的限制，因此PCR只能實現(xiàn)DNA分子量增加，而無法使寡核苷酸分子數(shù)目增加。因此，PCR技術(shù)不適合進行短鏈寡核苷酸或siRNA的大量制備。

近年來，基于核酸擴增技術(shù)的檢測和診斷方法已獲得廣泛應(yīng)用，給臨床診斷提供了快速、靈敏和準(zhǔn)確的方法。因此，國內(nèi)外眾多學(xué)者不斷致力于改進和探索新型核酸擴增技術(shù)，已經(jīng)建立了多種多樣的新型核酸擴增方法。按照擴增過程中溫度是否變化來劃分，核酸擴增方法可分為熱循環(huán)擴增和恒溫擴增兩大類。熱循環(huán)擴增主要包括經(jīng)典的核酸擴增技術(shù)——PCR[51-52]和連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Ligase chain reaction, LCR)[53-55]，而恒溫擴增主要包括鏈置換擴增 (Strand displacement amplification, SDA)[56-58]、滾環(huán)擴增 (Rolling circle amplification, RCA)[59-61]、環(huán)介導(dǎo)擴增 (Loop mediated amplification, LAMP)[62-63]、依賴解旋酶擴增(Helicase-dependent amplification, HDA)[64-65]、依賴核酸序列的擴增 (Nucleic acid sequence based amplification，NASBA)[66-67]，等等。

這些DNA擴增技術(shù)和PCR一樣，都需設(shè)計并采用至少一對化學(xué)合成的寡核苷酸作為引物，不可避免地會在產(chǎn)物中引入非目標(biāo)序列。此外，這些方法只是將寡核苷酸引物延伸，其擴增產(chǎn)物的分子數(shù)也同樣不可避免地受輸入寡核苷酸引物濃度的限制，二次擴增必須加入新的寡核苷酸引物。因而一般也都不適合大量制備長度約20個堿基左右的寡核苷酸。

目前，已報道的專門用于擴增和制備短寡核苷酸的方法極少。指數(shù)擴增反應(yīng) (EXPAR) 是一個極為快速的恒溫反應(yīng)[68]，能夠在10 min內(nèi)快速擴增和制備目標(biāo)寡核苷酸。EXPAR依賴于切刻內(nèi)切酶Nt.BstNBI和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，因此又被命名為切刻酶擴增反應(yīng) (Nicking enzyme amplification reaction, NEAR)[69]。然而，目前EXPAR的應(yīng)用十分有限，因為據(jù)報道該反應(yīng)存在嚴重的非特異性擴增[70]。此外，該反應(yīng)產(chǎn)物是單鏈的，僅對目標(biāo)鏈進行擴增，而其模板 (反義鏈)并未得到擴增。并且，EXPAR反應(yīng)無法進行二次擴增，產(chǎn)量還是會受輸入模板分子數(shù)目的限制，因此也不適合大量制備寡核苷酸。另外，滾環(huán)復(fù)制 (Rolling circle replication, RCR) 方法已被用于擴增環(huán)形DNA，可用于制備寡核苷酸[71]。然而，每輪 RCR擴增之前都必須要進行費時費力的人工酶切、連接和重新環(huán)化，使之不適合進行自動化的大規(guī)模寡核苷酸制備。最近，Ducani等在Nature Method雜志報道改進版的RCR方法，稱為 Monoclonal stoichiometric (MOSIC) 方法[72]。MOSIC方法依賴于具有鏈置換活性的Phi29 DNA聚合酶，以及特殊的內(nèi)切酶 BseGI，可按照預(yù)設(shè)的比例產(chǎn)生多個目標(biāo)序列的單鏈寡核苷酸，預(yù)期可用于 DNA納米材料的制備。但目前該方法尚未實現(xiàn)制備帶有修飾基團的藥用寡核苷酸。

4 新型核酸擴增方法——PEAR技術(shù)及其在寡核苷酸制備中的應(yīng)用

如前所述，現(xiàn)有核酸擴增技術(shù)在應(yīng)用于寡核苷酸擴增時均存在一定的困難。2010年Wang等研究開發(fā)了一種新型熱循環(huán)酶促生物化學(xué)反應(yīng)，稱為聚合酶-內(nèi)切酶擴增反應(yīng) (PEAR)[73]，用于擴增和大量制備寡核苷酸。PEAR技術(shù)采用含有重復(fù)目標(biāo)序列及酶切位點的雙鏈DNA作為“種子”，通過獨特的“滑動-切割機制”，用耐熱 DNA聚合酶延伸，耐熱限制性內(nèi)切酶切割，在熱循環(huán)控制下，使寡核苷酸等小分子核酸能夠像病毒一樣自我復(fù)制，擴增特定的目標(biāo)寡核苷酸。PEAR擴增產(chǎn)物的分子數(shù)能夠以指數(shù)模式持續(xù)增加，并且不受輸入初始“種子”寡核苷酸分子數(shù)的限制。PEAR產(chǎn)物無需經(jīng)過任何處理，無需加入新的引物和模板，直接作為“種子”進行二次擴增。

PEAR反應(yīng)DNA聚合酶和內(nèi)切酶的選擇范圍很大，可制備各種天然和修飾寡核苷酸。目前用PEAR技術(shù)已經(jīng)成功擴增和制備了帶有硫代[74]和氟代[75]修飾基團的寡核苷酸。經(jīng)高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測，表明PEAR產(chǎn)物中目標(biāo)寡核苷酸所占比例很高。由于避免了產(chǎn)生 (n–1) 缺失序列，純化過程十分容易。對于雙鏈寡核苷酸而言，則無需進行高效液相色譜分離，用普通柱層析純化后即可。因而，PEAR技術(shù)特別適合制備雙鏈寡核苷酸，如轉(zhuǎn)錄因子誘餌。

PEAR技術(shù)具有操作簡便、高效和穩(wěn)定的特點，能夠快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定地擴增寡核苷酸，產(chǎn)物純度高。PEAR所采用的DNA聚合酶和內(nèi)切酶等主要原材料都是純生物制劑，生產(chǎn)過程安全無污染。并且，用PEAR方法制備寡核苷酸不需要昂貴的大規(guī)模 DNA合成儀，而是采用價格低廉的熱循環(huán)儀。因此，大規(guī)模生產(chǎn)的設(shè)備和材料費用均可大大降低。PEAR作為一種簡單而高效的寡核苷酸擴增和制備方法，能夠解決上述寡核苷酸生產(chǎn)中所存在的諸多問題。

5 結(jié)論

寡核苷酸藥物研究方興未艾，應(yīng)用前景廣闊。寡核苷酸通常采用化學(xué)方法合成，但化學(xué)合成寡核苷酸會出現(xiàn)錯誤，純度較低，而純化十分困難。而且，由于天然的寡核苷酸在體內(nèi)會被很快降解，具有一些毒副作用，因此作為藥物的寡核苷酸必須帶有修飾基團，增強寡核苷酸在體內(nèi)的穩(wěn)定性。大規(guī)?；瘜W(xué)合成寡核苷酸的成本十分高昂，大大限制了寡核苷酸藥物的研究和應(yīng)用。目前已經(jīng)出現(xiàn)了多種核酸擴增方法，但均不適用于大量制備寡核苷酸。新的寡核苷酸擴增方法“聚合酶-內(nèi)切酶擴增反應(yīng)” (PEAR) 使寡核苷酸等小分子核酸能夠在兩種耐熱酶的催化作用下，通過熱循環(huán)進行自我復(fù)制，并實現(xiàn)指數(shù)擴增。這種新的寡核苷酸生產(chǎn)方法具有很多優(yōu)點，能解決目前寡核苷酸制造中的諸多問題。該方法采用大容量熱循環(huán)儀生產(chǎn)寡核苷酸，設(shè)備成本低，適合大量生產(chǎn)修飾寡核苷酸。PEAR技術(shù)是擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸擴增技術(shù)，很有可能用于大量生產(chǎn)成分更純、成本低廉的寡核苷酸類藥物，有助于推動寡核苷酸藥物的研究和應(yīng)用。

附表1 各名詞全稱及縮寫歸納表Appendix 1 Abbreviations

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