高產(chǎn)吡咯喹啉醌扭脫甲基桿菌的高通量選育

李紅月，曾偉主，周景文

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

吡咯喹啉醌 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)是許多細(xì)菌中脫氫酶 (包括甲醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶和甘油脫氫酶等) 的輔酶[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)能合成PQQ的菌株中絕大部分是革蘭氏陰性菌[3]，如肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonie、扭脫甲基桿菌Methylobacterium extorquens[4]、氧化葡糖桿菌Gluconobacter oxydans[5]、甲基營養(yǎng)菌Methylotrophic bacteria[6]等。甲醇脫氫酶中的PQQ接受來自甲醇的自由電子轉(zhuǎn)變?yōu)镻QQH2，之后再將電子傳遞至細(xì)胞色素c，此時(shí)PQQH2又被氧化成 PQQ[7-8]。PQQ具有提高細(xì)菌對(duì)毒性和輻射等極端條件耐受性[9-10]、防護(hù)肝損傷、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)[11-14]、調(diào)節(jié)機(jī)體自由基水平[15-16]、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子合成[17]等重要的生理功能。目前PQQ生產(chǎn)以化學(xué)法為主，由于化學(xué)法合成步驟復(fù)雜、提純步驟多，導(dǎo)致成本較高。發(fā)酵法由于培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、利于產(chǎn)物提取、反應(yīng)溫和、能降低成本等優(yōu)點(diǎn)，因此有很大的產(chǎn)業(yè)化前景。目前為止，PQQ整個(gè)生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，在M. extorquensAM1中PQQ的合成需要pqqA–G 7個(gè)基因[18]。敲除pqqA基因?qū)е翽QQ的合成量大幅度降低但依然有合成[19]。Postma等將K. pneumonia的PQQ基因簇與高拷貝載體pUC19構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli后只能產(chǎn)微量的PQQ[20]。王朝絢等將PQQ合成基因和信號(hào)肽基因pelB在大腸桿菌Escherichia coliBL21(DE3) 中融合表達(dá)，PQQ的產(chǎn)量與不加信號(hào)肽的對(duì)照菌相比提高了24%[21]。

高通量篩選可通過單細(xì)胞研究快速獲得有關(guān)克隆相關(guān)性、克隆內(nèi)差異和延續(xù)突變的信息[22]。此前，獲得狀態(tài)良好的單細(xì)胞比較困難，而流式細(xì)胞儀的發(fā)展和應(yīng)用能解決這一問題[23-24]。流式細(xì)胞術(shù) (Flow cytometry，F(xiàn)CM) 可以從細(xì)胞群中高速分選出被指定的細(xì)胞并將其分選至試管或細(xì)胞培養(yǎng)板中，分選時(shí)間短，分選到的細(xì)胞活性良好，方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)[25-26]。MoFlo XDP分選型流式細(xì)胞儀是目前高端流式細(xì)胞儀之一，具有高度一體化的電子系統(tǒng)、高速的電子系統(tǒng)計(jì)算速度及上樣分選速度、自動(dòng)調(diào)節(jié)和優(yōu)化液滴成像、自動(dòng)調(diào)節(jié)分選參數(shù)維持分選、完全程序化控制的上樣系統(tǒng)、高度智能的分選模式。本文采用常壓室溫等離子體誘變 (Atmospheric and room temperature plasma，簡(jiǎn)稱ARTP) 以及流式細(xì)胞術(shù)分選單細(xì)胞的高通量篩選方法獲得高產(chǎn)PQQ的M. extorquens菌株，并通過傳代檢測(cè)突變菌株遺傳穩(wěn)定性。目前，將流式細(xì)胞術(shù)與高通量篩選結(jié)合來提高PQQ產(chǎn)量的方法還沒有相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

M. extorquensI-F2由本研究室誘變篩選得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：酵母抽提物4.5 g/L，蛋白胨5 g/L，玉米漿干粉 0.75 g/L，CoCl2·6H2O 5 mg/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L ， CaCl2·2H2O 10 mg/L ，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·7H2O 0.5 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉，pH調(diào)至7.0，121 ℃滅菌15 min。

篩選培養(yǎng)基：甲醇30 mL/L，硫酸銨3 g/L，KH2PO41.0 g/L，K2HPO42.12 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L ， CaCl2·2H2O 10 mg/L ， FeSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·7H2O 0.5 mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg/L，pH調(diào)至7.0，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 主要試劑和儀器

酵母抽提物和蛋白胨，購自 Oxoid公司；PQQ，購自Sigma-Aldrich公司；其余化學(xué)試劑，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。常壓室溫等離子體誘變育種儀，購自無錫思清源生物科技有限公司；FE20K pH計(jì)，購自瑞士Mettler-Toledo公司；FREEDOM EVO移液工作站，購自瑞士Tecan公司；MoFlo XDP流式細(xì)胞儀，購自美國Beckman公司；Cytation3酶標(biāo)儀，購自美國BioTek公司；Eppendorf 5424高速離心機(jī)，購自美國Eppendorf公司。

1.1.4 搖瓶培養(yǎng)條件

種子液的制備：將保藏于–80 ℃條件下的甘油管中的菌液接種在固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d使其活化后，從平板上刮取單菌落接種于含有25 mL篩選培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)72 h，即為種子液。

1.2 方法

1.2.1 制備熒光標(biāo)記樣品

本研究采用碘化丙啶 (Propidiumiodide，簡(jiǎn)稱PI) 作為樣品的熒光標(biāo)記染料。確定 PI濃度：將0.5 mL已制備好的菌懸液分別與0.5 mL 10、20、50 μg/mL的PI混合，避光4 ℃染色10 min，過濾轉(zhuǎn)移至試管中，上機(jī)檢測(cè)。確定染色的溫度：將0.5 mL已制備好的菌懸液與0.5 mL PI (20 μg/mL)混合，分別避光在4 ℃、室溫、30 ℃下染色10 min，過濾轉(zhuǎn)移至試管中，上機(jī)檢測(cè)。確定染色時(shí)間：將0.5 mL已制備好的菌懸液與0.5 mL PI (20 μg/mL)混合，分別避光4 ℃靜置10 min、30 min、2 h染色，過濾轉(zhuǎn)移至試管中，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 ARTP誘變

本研究采用常壓室溫等離子體誘變對(duì)M. extorquensI-F2進(jìn)行處理，將菌株進(jìn)行活化并制備得到種子液 (OD600約為3)。取1 mL菌懸液于1.5 mL EP管中，8 000 r/min 離心3 min，棄去上清液。用PBS溶液洗滌2次后，稀釋制成菌體濃度在106–107之間的菌懸液，取10 μL菌懸液均勻涂布于無菌的載片表面。然后將載片置于ARTP誘變育種系統(tǒng)的載臺(tái)上，在入射功率為100 W、氦氣流量為10 SLM條件下，分別照射15、30、45、60、75、90、105、120 s。樣品處理完畢，用鑷子將載片轉(zhuǎn)移到裝有1 mL 5%甘油的EP管中，持續(xù)充分振蕩1 min，將附著在載片上的菌體充分洗脫形成菌懸液，對(duì)照組為同樣的條件照射0 s后，將載片轉(zhuǎn)移至裝有1 mL 5%甘油的EP管中，持續(xù)充分振蕩1 min制備成菌懸液。

1.2.3 流式細(xì)胞儀分選

首先進(jìn)行光路調(diào)節(jié)，先粗調(diào)液流，再精確校準(zhǔn)，優(yōu)化所有信號(hào)，自動(dòng)優(yōu)化斷點(diǎn)并確定液滴延遲，調(diào)節(jié)分選參數(shù)。對(duì)M. extorquens細(xì)胞進(jìn)行染色，PI不能穿透完整細(xì)胞膜，但能穿透凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜，嵌入雙鏈 DNA后使細(xì)胞核染色產(chǎn)生熒光，通過流式細(xì)胞儀可以分析計(jì)數(shù)死細(xì)胞或活細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例，分選活細(xì)胞至96孔板中，其中致死率方程：

S是 ARTP處理后流式細(xì)胞檢測(cè)出的有熒光細(xì)胞數(shù)即死細(xì)胞數(shù)，A是流式細(xì)胞檢測(cè)出的所有細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 高通量篩選

將活細(xì)胞分選于含有100 μL固體培養(yǎng)基的96孔深孔板中，30 ℃條件下培養(yǎng) 4 d后，加入800 μL液體篩選培養(yǎng)基在30 ℃、900 r/min條件下培養(yǎng)3 d，以10%的接種量轉(zhuǎn)接于含有2 mL液體篩選培養(yǎng)基的48孔深孔板中，在30 ℃、900 r/min條件下培養(yǎng) 5 d，4 000 r/min 離心 15 min，取 200 μL上清液至96孔淺孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)249 nm處的吸光值，PQQ含量越高吸光值越高，復(fù)篩驗(yàn)證，將篩選到的菌株再次進(jìn)行ARTP誘變，分選于多孔板中初篩、復(fù)篩驗(yàn)證，連續(xù)多次傳代檢測(cè)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 PQQ含量檢測(cè)

光譜法檢測(cè)PQQ含量是將樣品轉(zhuǎn)移至96孔淺孔板中用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD326與OD400的差值，同時(shí)將篩選培養(yǎng)基以同樣的條件處理和檢測(cè)，從而扣除培養(yǎng)基吸光值[27]。計(jì)算結(jié)果取3個(gè)平行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品染色條件的優(yōu)化

流式細(xì)胞術(shù)是通過激光激發(fā)高速流動(dòng)的細(xì)胞或微粒所攜帶的熒光染料或熒光素，并檢測(cè)由此產(chǎn)生的微粒的各種光信號(hào)，如散射光、自發(fā)熒光、特異性熒光的強(qiáng)弱，來反映各項(xiàng)待檢測(cè)指標(biāo)[28]。染色分選后，30 ℃培養(yǎng)5 d至能清晰看見孔內(nèi)的單菌落，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，計(jì)數(shù)每塊孔板中分選的單細(xì)胞克隆形成個(gè)數(shù)即克隆形成率。對(duì)染色條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表1所示。隨著PI濃度增大，克隆形成率降低，可能由于PI本身具有猝滅作用的締合分子或產(chǎn)生內(nèi)濾光效應(yīng)，說明合適的染料濃度才能保證染色做到染料分子數(shù)與被染的某種參量成一定的量效關(guān)系。短時(shí)存放 (10 min、30 min) 的克隆形成率高于長(zhǎng)時(shí)存放 (2 h)，說明樣品染色后應(yīng)盡快上機(jī)檢測(cè)。染色時(shí)溫度對(duì)克隆形成率有影響，溫度升高可造成溶液粘滯性增加，溶劑和 PI分子動(dòng)力加大，使熒光猝滅可能性加大，熒光量減弱，所以應(yīng)保持較低溫度。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)樣品時(shí)染色相對(duì)較好的條件是 PI濃度為10 μg/mL、避光在室溫條件下放置30 min。

2.2 流式細(xì)胞儀分選參數(shù)調(diào)校

樣品制備后，MoFlo XDP流式細(xì)胞儀檢測(cè)，PI染色，在488 nm激發(fā)光、620 nm發(fā)射光條件下進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳調(diào)校值參數(shù)為：液流在光路中央且聚焦清楚，液流打入廢液收集管正中央，光斑位于孔中央且最亮，液流分叉穩(wěn)定，噴嘴型號(hào)為100 μm，鞘液壓力為30.00 psi，Drop Delay值為40.00，分選模式為Purify mode。在此條件下，目的細(xì)胞群如R6區(qū)域所示 (圖1A)。對(duì)于未進(jìn)行熱處理的樣品，PI無法對(duì)細(xì)菌染色，細(xì)菌的熒光信號(hào)全部處于陰性區(qū)間，結(jié)果如圖1B所示；而經(jīng)過熱處理 (100 ℃沸水浴 10 min) 的樣品，PI能穿過破損的細(xì)胞膜染色DNA，細(xì)菌的熒光信號(hào)均顯示為陽性，結(jié)果如圖 1C所示。參數(shù)調(diào)校以單細(xì)胞得率高、損傷少為目的，要避免出現(xiàn)鞘液壓力太大、不合適的鞘液或培養(yǎng)基、分選時(shí)間太長(zhǎng)以及高電壓等情況[29]。

表1 樣品染色條件優(yōu)化Table 1 Optimization of sample dyeing conditions

2.3 ARTP誘變致死率曲線

ARTP誘變通過控制等離子體強(qiáng)度破壞其DNA結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變其生物特性，較高的致死率能獲得有效的突變率，研究表明致死率90%以上效果較佳[30]。ARTP處理30 s后，I-F2菌體致死率達(dá)到 93%以上，但隨后 45 s后的處理時(shí)間出現(xiàn)致死率下降的現(xiàn)象，在 45–90 s這段處理時(shí)間內(nèi)雖然致死率呈上升趨勢(shì)，但均低于90%，直到處理時(shí)間為105 s時(shí)致死率達(dá)到95% (圖2)。ARTP誘變對(duì)微生物細(xì)胞和 DNA具有顯著的影響，細(xì)胞暴露在大量高活性等離子體下會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞普遍死亡，但同時(shí)過程中會(huì)有少量細(xì)胞通過自我修復(fù)形成新的突變存活下來，分析出現(xiàn)致死率曲線折點(diǎn)的原因可能是菌株自身存在的修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生回復(fù)突變，使存活的菌株增加，所以本研究將誘變時(shí)間選在100–110 s。

圖1 流式分選 (A：目標(biāo)細(xì)胞群；B：陰性；C：陽性)Fig. 1 Flow sorting. (A) Target cell population. (B)Negative. (C) Positive.

2.4 高通量檢測(cè)方法

目前，PQQ檢測(cè)方法包括高效液相色譜法、重組酶法及非酶法 (氧化還原法)。高效液相色譜法檢測(cè)精準(zhǔn)性高、范圍廣，但并不適用于高通量篩選檢測(cè)。重組酶法和非酶法都適于大量樣品的檢測(cè)，但重組酶法中的DCIP (2,6-二氯靛酚鈉) 和PMS (吩嗪硫酸甲脂) 配成檢測(cè)溶液后會(huì)產(chǎn)生顏色變化影響吸光值的檢測(cè)，非酶法中的NBT (四唑硝基藍(lán)) 是一種極易被氧化的物質(zhì)，暴露在空氣中很短時(shí)間內(nèi)即可被氧化，影響吸光值的測(cè)定，所以重組酶法和非酶法這兩種檢測(cè)方法存在準(zhǔn)確度不高和重復(fù)性較差的問題。PQQ分別在250 nm和330 nm左右有特征吸收峰，光譜掃描結(jié)果見圖3A。本研究采用光譜法檢測(cè)PQQ，用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD249值，如圖3B所示，PQQ濃度與OD249關(guān)系為y=32.34x–7.99 (R2=0.997)。

圖2 致死率曲線Fig. 2 The lethality curve.

圖3 高通量篩選方法建立Fig. 3 High-throughput screening method.

2.5 高通量篩選

流式分選和移液工作站應(yīng)用于高通量篩選策略可實(shí)現(xiàn)高效率的大批量轉(zhuǎn)移，具有準(zhǔn)確、快速、靈敏、高通量和多參數(shù)同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)。本研究通過ARTP誘變處理菌株后將篩選到的菌株再次進(jìn)行ARTP誘變處理共4次，用PI染色后結(jié)合流式細(xì)胞儀分選出9 677株活細(xì)胞，最后采用建立的高通量檢測(cè)方法檢測(cè)9 677株誘變菌株P(guān)QQ產(chǎn)量。結(jié)果如圖4A所示，294株菌株的OD249比出發(fā)菌株高。對(duì)這294株菌搖瓶發(fā)酵來進(jìn)行復(fù)篩，以 10%接種量轉(zhuǎn)接至含有 20 mL篩選培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)180 h后檢測(cè)PQQ產(chǎn)量。如圖4B所示，復(fù)篩中有7株P(guān)QQ產(chǎn)量提升較高的菌株，分別是3-B9、2-B3、3-H8、3-A9、1-C6、2-D3、8-D9，它們的PQQ產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了 80.09%、85.2%、73.3%、74.9%、98.02%、90.11%、94.19%。對(duì)這7株菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)6代，檢測(cè)PQQ產(chǎn)量，如表2所示，其中6株菌株2-B3、3-H8、3-A9、1-C6、2-D3、8-D9基本保持穩(wěn)定，而菌株3-B9則明顯降低。

圖4 高通量篩選結(jié)果 (A：初篩；B：復(fù)篩)Fig. 4 High-throughput screening results. (A) Primary screening. (B) Secondary screening.

表2 突變菌株遺傳穩(wěn)定性Table 2 The genetic stability of mutant strains

3 討論

本研究從9 677株菌中復(fù)篩到6株P(guān)QQ產(chǎn)量提高的菌株 2-B3、3-H8、3-A9、1-C6、2-D3、8-D9，PQQ產(chǎn)量分別較出發(fā)菌株提高了85.2%、73.3%、74.9%、98.02%、90.11%、94.19%，其中1-C6突變株 PQQ產(chǎn)量最高為 16.02 mg/L。目前野生菌PQQ 產(chǎn)量最多為2 mg/L或更低[31]，Urakami等篩選到一株生絲微菌 TK0441 (Hyphomicrobiumsp.TK0441)，搖瓶水平PQQ產(chǎn)量為0.3–0.9 mg/L[32]。尹芳等對(duì)生絲微菌TH205進(jìn)行培養(yǎng)，10 L罐上發(fā)酵后PQQ產(chǎn)量為26.6 μg/mL[33]。為提高產(chǎn)量，誘變是比較常用的育種方法。鐘杉杉等對(duì)假單胞菌PS0813 (Pseudomonassp. 0813) 進(jìn)行多種誘變，獲得PM1、PM2兩株高產(chǎn)菌，產(chǎn)量與對(duì)照相比提高1.63倍和1.56倍[34]。王朝絢等對(duì)K.pneumonia進(jìn)行紫外線和氯化鋰誘變，得到 U2、L1兩株高產(chǎn)菌，產(chǎn)量與對(duì)照相比提高6倍和5倍[35]。韓月梅等對(duì)甲基營養(yǎng)菌MP688進(jìn)行轉(zhuǎn)座誘變，篩選到幾乎不產(chǎn)PQQ的突變株，并對(duì)其進(jìn)行了突變基因鑒定[36]。通過對(duì)誘變獲得的PQQ缺陷型菌株進(jìn)行分析，為從基因水平闡釋PQQ生物合成過程提供了重要線索。由于目前PQQ生產(chǎn)菌株的篩選大多使用平板篩菌，人工挑選存在效率低、耗時(shí)長(zhǎng)等問題。

本文提供了一種新的高通量篩選 PQQ高產(chǎn)菌株的研究方法，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合高通量篩選的方法能更加簡(jiǎn)單、快速地獲得高產(chǎn)突變菌株。相比于基因工程改造和傳統(tǒng)篩選方法，具有提升效果明顯、自動(dòng)化、靈敏快速檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，流式細(xì)胞儀、全自動(dòng)移液工作站等的應(yīng)用為高通量篩選開拓了新道路。

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