6種多倍體大花萱草組織培養(yǎng)研究

陳曦 劉志洋

摘要?為了滿足市場對多倍體大花萱草數(shù)量及品種的需求，降低由國外引種的成本，實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)，引進多倍體大花萱草“紅運”“紅寶石”“橘黃色”“肉粉色”“大金杯”和“金娃娃”6個品種為研究材料，采用組織培養(yǎng)的繁殖方式進行離體快繁技術研究，通過對外植體部位篩選、不定芽誘導、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等研究表明，分蘗莖段是誘導不定芽形成的最佳外植體;培養(yǎng)25 d左右，不定芽平均伸長5 cm左右;不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對不同種多倍體大花萱草誘導率的影響有很大差異;不同植物生長調(diào)節(jié)劑對6種多倍體大花萱草芽量和增殖系數(shù)的影響變化趨勢一致，但在同種處理上，不同品種間存在著差異;6個品種組培苗的最適宜生根時間為20 d左右，最大生根率都在76.8%以上。

關鍵詞?大花萱草;組織培養(yǎng);誘導率;植物生長調(diào)節(jié)劑;增殖系數(shù);生根率

中圖分類號?S?682.1+9文獻標識碼?A文章編號?0517-6611（2020）01-0106-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.01.033

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Tissue Cultivation in Six Polyploid Hemerocallis hybrida

CHEN Xi，LIU Zhi?yang

（Harbin Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150029）

Abstract?In order to meet the market demand for the number and variety of Hemerocallis hybrida，reduce the cost of introduction from abroad，“Hongyun”“Hongbaoshi”“Juhuangse”“Roufense”“Dajinbei”and “Jinwawa” were selected as materials， tissue culture propagation methods were used to study in vitro rapid propagation techniques. Studies on explants， adventitious bud induction， proliferation culture， and rooting culture showed that， tiller stem segment was the best explant for inducing adventitious bud formation; after culturing for about 25 days， the average elongation of adventitious buds was about 5 cm; effects of different concentrations of plant growth regulators on different varieties of H. hybrida induction rate had great difference;effects of different plant growth regulators on the bud yield and reproductive coefficient of six polyploid geranium buds were consistent， but there were differences among different cultivars in the same treatment;the optimum rooting time of the 6 cultivars was 20 d， and the maximum rooting rates were all above 76.8%.

Key words?Hemerocallis hybrida;Tissue cultivation;Induction rate;Plant growth regulator;Proliferation coefficient;Rooting rate

多倍體大花萱草（Hemerocallis hybrida）品種繁多，花型秀美，花色繁多艷麗，將觀花和觀葉融為一體，在東北地區(qū)，花期從5月下旬到9月，對土壤和水分要求不嚴，可在鹽堿地上生長開花，加之冬天極耐寒的特性使大花萱草成為東北地區(qū)主要園林工程花卉品種。

目前，各商家紛紛由國外引種進行繁殖，但成本較高，且資源有限，多倍體大花萱草的自然繁殖方式是分蘗繁殖，每年分蘗2～3株，而且不結實或很少結實，繁殖效率低，不能滿足市場需求，需要利用植物組織培養(yǎng)技術對引進的萱草品種進行種苗的大量繁殖，以滿足園林市場需求，解決限制多倍體大花萱草繁殖速度的瓶頸問題。大花萱草的組織培養(yǎng)研究已有一些報道[1-6]。采用組織培養(yǎng)方法可以大幅提高繁殖系數(shù)，短時間內(nèi)就可以生產(chǎn)出大量的種苗投放市場，加快了新品種的應用。為了能夠滿足市場對多倍體大花萱草數(shù)量及品種的需求，降低由國外引種的成本，增加新品種多倍體的數(shù)量，該研究引進多倍體大花萱草“紅運”“紅寶石”“橘黃色”“肉粉色”“大金杯”和“金娃娃”6個品種為材料，采用組織培養(yǎng)的繁殖方式進行離體快繁技術研究，為其實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術支持。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗材料為哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學院園區(qū)內(nèi)種植的6個多倍體大花萱草品種，取樣時間為每年6—9月盛花期。

1.2?方法

1.2.1?外植體消毒與處理。

選取花蕾、分蘗莖段和根作為外植體材料。將采取的分蘗莖段切成1～2 cm的留芽小段，先用洗衣粉清洗材料，再用流水沖洗60 min后，在超凈工作臺上用滅菌劑處理，選用75%乙醇和0.1%升汞滅菌，設5個處理（表1）。

1.2.2?不定芽誘導。

不同植物品種適宜的基本培養(yǎng)基也不盡相同。目前，多倍體大花萱草最常用基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基[7-9]，通過在基本培養(yǎng)基中添加不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和比例促使外植體材料分化和發(fā)育，其次是添加不同的營養(yǎng)物質(zhì)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的微環(huán)境，達到適合外植體發(fā)育和分化理想環(huán)境。

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA，共設置10個濃度梯度（表2）。將預處理好的6種多倍體萱草的分蘗莖段分別接種于上述培養(yǎng)基中，每個品種每個處理接種10瓶，每瓶3個外植體，重復3次。以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L，pH調(diào)至6.02，培養(yǎng)溫度25 ℃左右，空氣相對濕度控制在40%～60%，光照強度1 000～2 000 lx。培養(yǎng)一定時間后調(diào)查污染情況和統(tǒng)計不定芽誘導情況。誘導率=成功誘導不定芽數(shù)/接種培養(yǎng)基總數(shù)×100%。

1.2.3?不定芽增殖培養(yǎng)。

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA，共設6個濃度梯度（表3），將經(jīng)過成功誘導的6種多倍體大花萱草組培苗分別接種于增殖培養(yǎng)基上，每個品種每個處理接種10瓶，每瓶3叢/塊，重復3次，20 d統(tǒng)計其芽量和增殖系數(shù)。光照強度為2 000～3 000 lx，溫度為25 ℃。

增殖系數(shù)=增殖苗數(shù)/接種苗數(shù)。

1.2.4?生根培養(yǎng)。

當不定芽長至2～3 cm時，將不定芽分割成單個外植體，以1/2MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度的NAA和IBA（表4），比較2種植物生長調(diào)節(jié)劑的生根情況。挑選出“紅寶石”“紅運”“橘黃色”“肉粉色”“大金杯”和“金娃娃”增殖培養(yǎng)20 d、4～6 cm高的健壯植株，其葉色濃綠，切除基部的愈傷組織，分別接種于生根培養(yǎng)基上，每處理接種10瓶，每瓶接種3株培養(yǎng)苗，重復3次。轉接后注意觀察記錄苗的生根情況，20 d后測量根長，統(tǒng)計生根率，并進行移栽。

生根率=生根苗數(shù)/接種小苗數(shù)×100%。

1.2.5?煉苗及移栽。

打開組培瓶蓋，在室溫下煉苗3～4 d接受太陽光照射，取出組培苗并用流水洗凈根系上的培養(yǎng)基，然后直接移栽到營養(yǎng)缽中，待長出新芽后再移栽到花盆或大田。

2?結果與分析

2.1?外植體的確立

從3種外植體接種到培養(yǎng)基后的表現(xiàn)看，花蕾部分先產(chǎn)生愈傷組織，再由愈傷組織誘導生成不定芽，而根的誘導率極低，分蘗莖段以器官發(fā)生途徑直接誘導形成不定芽，縮短了不定芽生成時間，不容易引起變異，是誘導不定芽形成的最佳外植體。

2.2?滅菌方法對外植體的影響

由表5可知，乙醇處理時間過長容易導致外植體死亡，然而乙醇處理時間短則容易導致滅菌效果不理想。在乙醇處理時間一致的情況下外植體污染率隨著升汞處理時間增加而減少，但死亡率同步上升。說明滅菌時間越長，其污染率越低，而滅菌時間過長，對外植體會造成嚴重的創(chuàng)傷，如加重外植體的褐化程度，使外植體發(fā)生水浸狀態(tài)變化致使其死亡或失水萎蔫[10]。但是滅菌時間過短，污染率增加，不能達到真正的滅菌目的，污染致使外植體死亡。

綜合認為，75%乙醇30 s+0.1%升汞8 min是多倍體大花萱草分蘗莖段適宜的滅菌方法。

2.3?多倍體大花萱草不定芽形成過程

將多倍體大花萱草的分蘗莖段分割成1～2 cm，接種到誘導培養(yǎng)基中，5 d后莖芽呈黃綠色，部分開始伸長，7 d左右莖芽開始增粗略有伸長，顏色偏綠，新長出的嫩葉稍稍向外翻卷;10 d后莖芽長出嫩葉，平均伸長1.5 cm左右，顏色翠綠，莖基部出現(xiàn)不同數(shù)量的不定芽，嫩葉向外翻卷，寬度明顯增加;接種15 d后，新芽伸長量平均達3 cm左右，不定芽增多，形成芽叢;20～25 d，不定芽平均長度可達5 cm左右（圖1）。

2.4?不同濃度6-BA和NAA配比對不定芽誘導的影響

6-BA是誘導再生芽的主要因素，隨著6-BA濃度的增加，產(chǎn)生的不定芽數(shù)逐漸增加，但是過高濃度的6-BA會抑制叢生芽后期生長、黃化，直至逐漸枯萎。另外添加一定濃度的生長素NAA可以促進不定芽分化，提高平均再生芽數(shù)，但NAA過高會使不定芽矮小，抑制其伸長生長，因此適合的植物生長調(diào)節(jié)劑配比是生長不定芽的必要條件。

由表6可知，不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對不同基因型多倍體萱草的誘導率影響也有很大的差異，從整體變化趨勢看，“紅寶石”“紅運”“橘黃色”“肉粉色”和“大金杯”在M3、M4、M5、M6、M7中有不同的表現(xiàn)，但誘導率最高的情況都出現(xiàn)在M6培養(yǎng)基上;“金娃娃”與其他5個品種不同，在M2、M3、M4、M5、M6上較為活躍，而誘導率最高的情況出現(xiàn)在處理M3中。

2.5?多倍體大花萱草增殖培養(yǎng)

由表7可知，不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑對“紅寶石”“紅運”“橘黃色”“肉粉色”“大金杯”和“金娃娃”6個品種芽量和增殖系數(shù)的影響較大。“橘黃色”“肉粉色”和“金娃娃”在Z3處理上芽量和增殖系數(shù)最大，其中，“橘黃色”芽量為185個，增殖系數(shù)達3.1;“紅寶石”和“紅運”的最大芽數(shù)出現(xiàn)在Z4處理中，“紅運”的增殖系數(shù)最大，達3.2;“大金杯”的最大芽量和增殖系數(shù)分別為156和2.6。

不同植物生長調(diào)節(jié)劑對6種多倍體萱草芽量和增殖系數(shù)的影響變化趨勢一致，但在同種處理上，不同品種間存在著差異：在Z2處理上，“紅寶石”“紅運”和“大金杯”的芽量和增殖系數(shù)均無變化，而“橘黃色”芽數(shù)為72，增殖系數(shù)為1.2，“金娃娃”則為96和1.6;在Z3處理上，芽數(shù)和增殖系數(shù)均表現(xiàn)為“紅寶石”<“大金杯”<“紅運”<“肉粉色”<“金娃娃”<“橘黃色”。

2.6?多倍體大花萱草生根和成苗過程

由圖2可知，將組培苗轉接到生根培養(yǎng)基中，4 d左右根部生成乳黃色根瘤狀，根瘤隨著時間的增加逐漸增大，7 d后每株長出3～4條白色細根，當組培苗轉接到生根培養(yǎng)基中16 d左右時，平均根長可達3.5 cm左右時，顏色轉為黃綠色，根尖部依然為黃白色，同時根瘤處長出一些白色細小須根，生根培養(yǎng)20 d左右時各品種根部生長都達到了煉苗標準，根長度達3.5 cm以上的組培苗可直接移栽到營養(yǎng)缽里進行煉苗處理。因此，多倍體大花萱草組培苗適宜的生根培養(yǎng)時間為20 d左右。

2.7?不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑對多倍體大花萱草生根率的影響

與表8相比，表9的生根率變化更大。在無植物生長調(diào)節(jié)劑添加的情況下，各品種的生根率為38.2%～58.1%，“肉粉色”和“金娃娃”在1/2MS+NAA0.1 mg/L時生根率達到最大，為97.4%和96.2%，而在1/2MS+IBA1.0 mg/L時只有84.2%和81.3%;當植物生長調(diào)節(jié)劑為NAA時，“橘黃色”和“大金杯”最大生根率出現(xiàn)在濃度為1/2MS+NAA0.3 mg/L，分別為96.3%、95.6%，當植物生長調(diào)節(jié)劑為IBA時，“橘黃色”最大生根率出現(xiàn)在1/2MS+IBA0.2 mg/L時，為83.7%，“大金杯”的最大生根率在1/2MS+IBA0.4 mg/L出現(xiàn)，為76.8%，都較植物生長調(diào)節(jié)劑為NAA時大幅降低，綜合2種植物生長調(diào)節(jié)劑對6種多倍體大花萱草根長、生根率的影響以及從價格考慮，建議在大批量生產(chǎn)中采用NAA為佳。

3?結論

（1）通過對多倍體大花萱草花蕾、分蘗莖段和根作為外植體研究發(fā)現(xiàn)，花蕾部分可產(chǎn)生愈傷組織，根的誘導率極低，分蘗莖段以器官發(fā)生途徑直接誘導形成不定芽，縮短了不定芽生成時間，不容易引起變異，是誘導不定芽形成的最佳外植體。75%乙醇30 s+0.1%升汞8 min是多倍體大花萱草分蘗莖段適宜的滅菌方法。

（2）多倍體大花萱草分蘗莖段在培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～25 d，不定芽平均長度可達5 cm。不同植物生長調(diào)節(jié)劑對6種多倍體萱草芽量和增殖系數(shù)的影響變化趨勢一致，但在同種處理上，不同品種間存在著差異。

（3）生根培養(yǎng)20 d左右各品種根部生長都在3.5 cm以上，達到了煉苗標準。多倍體大花萱草組培苗適宜的生根培養(yǎng)時間為20 d左右。綜合考慮2種植物生長調(diào)節(jié)劑對6種多倍體大花萱草根長、生根率的影響以及價格，在大批量生產(chǎn)中采用NAA為佳。

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