香水百合組織培養(yǎng)和快速繁殖條件的優(yōu)化

方中明??+于恒??+白根祥??黃瑋婷??+曾宋君

摘要：以香水百合無菌試管苗小鱗莖作為外植體，從外植物體創(chuàng)傷、基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比以及培養(yǎng)基的物理狀態(tài)等幾個(gè)方面研究了百合鱗莖增殖的最優(yōu)條件，并對(duì)百合組培苗的生根條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，一定的外植體創(chuàng)傷處理、氮元素含量較高的基本培養(yǎng)基和合適的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合有利于鱗莖的增殖，香水百合鱗莖最佳增殖培養(yǎng)基配方為N6+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA；在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)的鱗莖增殖倍數(shù)極顯著高于固體培養(yǎng)；香水百合小苗的最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：百合；增殖；創(chuàng)傷；液體培養(yǎng)；培養(yǎng)條件；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

中圖分類號(hào)： 682.2+90.4+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0081-05

百合（Lilium spp.）是指百合科百合屬多年生球根花卉，其花色鮮艷、花姿雅致，具有較高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值。香水百合是百合中的“女王”，因其花大、芳香宜人、清雅脫俗而深受歡迎，主要做切花觀賞制成花束和花籃[1]。目前，中國(guó)香水百合的種球主要依賴進(jìn)口，百合新品種的選育和商品種球的供應(yīng)已成為制約我國(guó)百合產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“瓶頸”問題，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)百合種球的國(guó)產(chǎn)化具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，而國(guó)內(nèi)的種苗繁殖方法以分球繁殖為主，有時(shí)也采用鱗片扦插，但以小鱗莖分株法及鱗片扦插法繁殖，繁殖率低，且長(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)繁殖易使其感染病毒而降低花的質(zhì)量，應(yīng)用組培方法實(shí)現(xiàn)百合工業(yè)化生產(chǎn)是解決這一問題的有效途徑。目前，我國(guó)學(xué)者對(duì)香水百合的組織培養(yǎng)進(jìn)行了相關(guān)研究，但主要集中以鱗片、葉片、花器官等為外植體的固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)再生植株上[2-9]。本研究以香水百合無菌試管苗鱗莖為外植體，探討外植體創(chuàng)傷、基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比以及培養(yǎng)基的物理狀態(tài)探究對(duì)小鱗莖增殖的影響，篩選出最適宜培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)方式以及生根培養(yǎng)基配方，以期為香水百合組培苗的工廠化大生產(chǎn)提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

香水百合無菌試管苗由武漢生物工程學(xué)院細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2方法

1.2.1創(chuàng)傷處理對(duì)百合小鱗莖增殖的影響

選用大小相似、長(zhǎng)勢(shì)較好的無性系香水百合小鱗莖作為本試驗(yàn)的外植體材料，切割成0.5 cm×0.5 cm的小塊。1組對(duì)小塊做切割處理（平行切割3刀），1組不進(jìn)行任何處理作為對(duì)照，接種到 MS+20 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂的培養(yǎng)基中，pH值5.8，每瓶接 8個(gè)小鱗莖，共接30瓶。

培養(yǎng)條件為先暗培養(yǎng)15 d，然后放到光下培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d 后，統(tǒng)計(jì)肉眼可以區(qū)分的香水百合小鱗莖個(gè)數(shù)，計(jì)算小鱗莖增殖系數(shù)（Q）=統(tǒng)計(jì)的小鱗莖個(gè)數(shù)/接種個(gè)數(shù)。

1.2.2不同增殖培養(yǎng)對(duì)百合小鱗莖增殖的影響

將無菌試管小苗切除葉片及根部，接種到15種不同增殖培養(yǎng)基中（表1），每瓶接種8個(gè)小鱗莖，共接30瓶。50 d后統(tǒng)計(jì)并計(jì)算能增殖的小鱗莖百分率、增殖系數(shù)和增加的質(zhì)量。能增殖的小鱗莖百分率=分化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。增殖率=增殖出的小鱗莖數(shù)/接種的小鱗莖數(shù)×100%。

1.2.3培養(yǎng)基不同物理狀態(tài)對(duì)百合小鱗莖增殖的影響以MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH值5.8為基本培養(yǎng)基，分裝在50 mL的錐形瓶中，每瓶分裝20 mL；液體培養(yǎng)基中不加瓊脂但是加入定量的脫脂棉；液體培養(yǎng)基分裝在250 mL的錐形瓶中，每瓶分裝100 mL，并且加入0.3 g脫脂棉，滅菌備用。

選用大小相近長(zhǎng)勢(shì)較好的香水百合小鱗莖，將外植體切割成大小為0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種到培養(yǎng)基上，每瓶均接種4個(gè)，共30瓶。搖床轉(zhuǎn)速：100 r/min。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)香水百合小鱗莖個(gè)數(shù)，計(jì)算小鱗莖增殖系數(shù)。

1.2.4香水百合小苗生根

將增殖培養(yǎng)得到的香水百合鱗莖接種于壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)，百合鱗莖壯苗培養(yǎng)基的配方為MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA+3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH值5.8。將經(jīng)過壯苗培養(yǎng)獲得的生長(zhǎng)健壯的百合小苗，接種到不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)（表2）。每瓶接種6棵小苗，共接8瓶，30 d后統(tǒng)計(jì)在各個(gè)培養(yǎng)基上的生根情況，包括生根小苗數(shù)量、生根數(shù)、根長(zhǎng)及生根率。生根率=生根外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。

1.2.5培養(yǎng)條件和數(shù)據(jù)分析

以上培養(yǎng)基除特別說明外，其余的均加入3%蔗糖+0.7%瓊脂，pH值5.8。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照度為1 500 lx，每天光照12 h。數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析（ANOVA），以Duncans在005水平上進(jìn)行顯著性差異分析。

2結(jié)果與分析

2.1創(chuàng)傷處理對(duì)香水百合鱗莖增殖的影響

經(jīng)過創(chuàng)傷處理的百合鱗莖的增殖倍數(shù)可達(dá)到4.40，而未經(jīng)創(chuàng)傷處理的對(duì)照僅為1.33，增殖倍數(shù)之間存在極顯著性差異（表3）。

2.2不同基本培養(yǎng)基對(duì)香水百合鱗莖增殖的影響

從圖1可以看出，不同基本培養(yǎng)基及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比組合的培養(yǎng)基對(duì)百合能增殖小鱗莖的百分率具有重要的影響?？傮w上看，A組的鱗莖分化率低于B組、C組，而B組、C組之間差異不大。表明1/2MS、N6基本培養(yǎng)基較MS基本培養(yǎng)基更適合于香水百合鱗莖的分化增殖。在所有培養(yǎng)基中A5的百分率最低，除與A1、A3、A4和B4外的其他所有培養(yǎng)基均具有顯著性差異。C組能增殖小鱗莖的百分率均達(dá)到較高的水平，B3組能增殖小鱗莖達(dá)到93.75%，而A組均在71%以下。C組所用的基本培養(yǎng)基為N6培養(yǎng)基，說明在此培養(yǎng)基下，鱗莖的分化率穩(wěn)定且處于較高水平。

從圖2可以看出，不同基本培養(yǎng)基及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比組合培養(yǎng)基對(duì)百合小鱗莖增殖率也具有重要的影響。C組鱗莖的增殖系數(shù)總體要好于A組、B組，特別是C4組的增殖系數(shù)達(dá)到8.0。相比較而言，B組鱗莖的增殖系數(shù)總體要高于A組，特別是A1、A3這2種培養(yǎng)基的增殖率顯著低于其他培養(yǎng)基。在總質(zhì)量的增加方面，C組的總質(zhì)量普遍明顯高于A組、B組。因此，C組培養(yǎng)基特別是C4最適合于香水百合鱗莖的增殖及增質(zhì)量（圖3）。

從圖1可以看出，A組中能增殖小鱗莖的百分率較高的是A1、A2、A3，說明在以基本培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基的條件下，低濃度的6-BA有助于鱗莖的啟動(dòng)增殖；B組中能增殖小鱗莖的百分率最高的是B3，即6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)，而在6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)能增殖小鱗莖的百分率較低；C組中鱗莖的能增殖小鱗莖的百分率較穩(wěn)定且處于較高水平，說明在基本培養(yǎng)基為N6培養(yǎng)基的條件下，6-BA濃度對(duì)鱗莖分化率的影響不大。

從圖2可以看出，在A、B、C這3組中，鱗莖增殖系數(shù)最高的是C3，而且其增殖系數(shù)遠(yuǎn)高于其他組。表明在基本培養(yǎng)基為N6、6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，最有利于香水百合鱗莖的增殖。從圖3可以看出，在A組中，高濃度的6-BA有利于鱗莖的增質(zhì)量；而在B組、C組中，6-BA濃度對(duì)鱗莖的增質(zhì)量沒有明顯的影響。

從鱗莖的生長(zhǎng)狀況（圖4、圖5、圖6）上看，A1、B1、C1的鱗莖苗的生長(zhǎng)高度均要好于A、B、C組中的其他處理，說明當(dāng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為0.2 mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA時(shí)有利于鱗莖苗的長(zhǎng)高；各組中隨著6-BA濃度的增加，鱗莖苗越來越粗壯、嫩綠，[JP3]說明在一定范圍內(nèi)，高濃度的6-BA有利于鱗莖苗的壯苗生長(zhǎng)。

2.4不同物理狀態(tài)培養(yǎng)基對(duì)百合小鱗莖增殖倍數(shù)的影響

從表4可以看出，在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+3%蔗糖+0.7%瓊脂培養(yǎng)基下，經(jīng)液體搖床培養(yǎng)的百合鱗莖的增殖效果顯著優(yōu)于固體培養(yǎng)，其平均增殖系數(shù)可達(dá)9.00。

2.5不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比對(duì)香水百合小苗生根的影響

3討論

3.1創(chuàng)傷處理對(duì)百合鱗莖增殖的影響

植物細(xì)胞在離體條件下仍具有發(fā)育為完整植株的潛能；只要外界環(huán)境對(duì)外植體刺激得當(dāng)，激素添加比例適中，就能將植物細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)[10]。本研究對(duì)百合鱗莖的創(chuàng)傷處理能使其增殖系數(shù)極顯著升高，原因可能是適當(dāng)進(jìn)行創(chuàng)傷處理對(duì)離體條件下的外植體產(chǎn)生了一定的刺激，同時(shí)，創(chuàng)傷產(chǎn)生的傷口有利于外植體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的快速吸收，促進(jìn)了百合鱗莖的增殖，黃磊等在蝴蝶蘭葉片有組織培養(yǎng)中也獲得了相似的結(jié)果[11]。

3.2基本培養(yǎng)基對(duì)百合鱗莖增殖的影響

在百合的組織培養(yǎng)中對(duì)基本培養(yǎng)基的研究報(bào)道很少。本研究結(jié)果表明，在百合組織培養(yǎng)中普遍采用的MS培養(yǎng)基并不是香水百合增殖的適宜培養(yǎng)基，而N6培養(yǎng)基比較適宜香水百合的鱗莖增殖，與徐凌飛的研究結(jié)果[12]相似，可能是與N6培養(yǎng)基中較高的氮元素含量相關(guān)。張潔等的研究也表明，高濃度的大量元素有利于鱗莖的膨大，但不利于鱗莖的誘導(dǎo)[13]。施用氮肥可顯著提高花徑、葉面積、葉片數(shù)和瓶插壽命，表明氮素對(duì)香水百合切花品質(zhì)有較為重要的影響[14]。適宜高濃度氮營(yíng)養(yǎng)對(duì)百合生長(zhǎng)有利[15-17]。

3.3生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)百合鱗莖增殖的影響

應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)可以對(duì)香水百合進(jìn)行快速繁殖，實(shí)現(xiàn)種球規(guī)模化周年生產(chǎn)，莖芽增殖是擴(kuò)繁的關(guān)鍵[18]。細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例高有利于芽的誘導(dǎo)；細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比例低有利于根的誘導(dǎo)[10]。因而篩選適宜的激素濃度是增殖培養(yǎng)的關(guān)鍵。張惠華等認(rèn)為，較高濃度的激素含量可以提高增殖倍數(shù)，但小鱗莖呈叢生狀態(tài)，愈傷化，因此在不同的生產(chǎn)階段，宜適當(dāng)控制激素的濃度，在保證較高增殖倍數(shù)的同時(shí)保證種球的質(zhì)量[19]。龐新霞等以6-BA、KT、NAA和IBA激素的不同組合培養(yǎng)基增殖東方百合發(fā)現(xiàn)，不同激素組合對(duì)東方百合的鱗莖組培芽的生長(zhǎng)具有明顯的影響，相同的激素處理不同品種也存在差異[20]。藍(lán)炎陽等研究表明，細(xì)胞分裂素對(duì)組培中芽的增殖起主要作用，6-BA利于芽增殖，KT使組培苗更加健壯[21]。本試驗(yàn)綜合香水百合鱗莖的增殖系數(shù)、增質(zhì)量情況、生長(zhǎng)情況，得出鱗莖增殖的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為0.2 mg/L NAA、2.0 mg/L 6-BA。

3.4液體培養(yǎng)對(duì)百合鱗莖增殖的影響

液體培養(yǎng)是一種簡(jiǎn)單高效的鱗莖生產(chǎn)方法，它可以極大地減少勞動(dòng)量[22]。本研究采用液體培養(yǎng)基對(duì)香水百合小鱗莖進(jìn)行增殖的誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)，液體搖床培養(yǎng)的增殖效果極顯著優(yōu)于固體培養(yǎng)，可能原因是在液體搖床培養(yǎng)基中的外植體與培養(yǎng)基有較大的接觸面積，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而加速鱗莖的增殖。

3.5植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)百合小苗生根的影響

影響百合鱗莖小苗生根的因素很多，但主要研究集中在基本培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2個(gè)方面。羅鳳霞等在新鐵炮百合研究中發(fā)現(xiàn)，不加任何激素的MS培養(yǎng)基為最佳生根培養(yǎng)基[23]。袁芳亭等認(rèn)為，1/2MS并附加0.5～1.0 mg/L NAA的培養(yǎng)基效果較好[24]。袁雪等對(duì)2種培養(yǎng)基做了對(duì)比性研究，研究發(fā)現(xiàn)1/2MS培養(yǎng)基中的鱗莖苗生根率較高，達(dá)到了100%，但苗很纖弱；在MS培養(yǎng)基中，百合的生根率雖然較高，根系粗壯，但沒有側(cè)根發(fā)生，單苗根數(shù)較少，根長(zhǎng)度也較小。在1/2MS培養(yǎng)基中添加適量吲哚丁酸（IBA）后，單苗根數(shù)明顯增多，根系更粗壯，但根系生長(zhǎng)變慢，且側(cè)根發(fā)生減少[25]。本研究結(jié)果表明，在含有0.2 mg/LNAA的1/2MS培養(yǎng)基上添加一定濃度的IBA有利于香水百合的生根，特別是根數(shù)增加較多，獲得生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA。

參考文獻(xiàn)：[HJ1.5mm]

[1]潘佑找，陳香麗，胡瓊，等. 香水百合的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，15（17）：46，95.

[2]李玲莉，劉華敏，孔立生，等. 利用生物反應(yīng)器進(jìn)行香水百合培養(yǎng)研究[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，29（1）：89-94.

[3]蘇琛. 香水百合再生體系的建立[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（7）：3906-3907，3911.

[4]李冰華，金曉玲，劉雪梅. 香水百合鱗片組織培養(yǎng)再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）：83-85.

[5]阮少寧，楊華，梁一池，等. 香水百合組織培養(yǎng)的試驗(yàn)研究[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，21（2）：142-145.

[6]高敏. 香水百合的組培快繁[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（3）：120-121.

[7]萬容，李群. 香水百合組織培養(yǎng)中外植體和培養(yǎng)基配方的選取[J]. 南方農(nóng)業(yè)，2012（5）：46-48.

[8]張立，王日明. 香水百合花瓣組織培養(yǎng)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011（10）：191-192，194.

[9]楊子賢，張穎. 香水百合和東方百合鱗片組織培養(yǎng)研究[J]. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)，2013（6）：53-56.[ZK）]

[10]周吉源. 植物細(xì)胞工程[M]. 武漢：華中師范大學(xué)出版社，2007.

[11]黃磊，陳之林，吳坤林，等. 切割方式和外植體大小對(duì)蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)類原球莖的影響[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2009，17（3）：261-266.

[12]徐凌飛，龐勇，周連霞，等. 蘭州百合微繁的研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（5）：113-114，152.

[13]張潔，蔡宣梅，林真，等. 百合試管鱗莖誘導(dǎo)及膨大技術(shù)的研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，25（3）：328-331.

[14]Badiyan D，Wills R H，Bowyer M C. Use of a nitrogen oxide donor compound to extend the vase life of cut flowers[J]. HortScience，2004（6）：1371-1372.

[15]王磊，湯庚國(guó)，劉彤. 施肥對(duì)石蒜葉片生長(zhǎng)及生化指標(biāo)的影響[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37（7）：65-66.

[16]Bichsel R G，Starman T W，Wang Y T. Nitrogen，phosphorus，and potassium requirements for optimizing growth and flowering of the nobile Dendrobium as a potted orchid[J]. HortScience，2008，43（2）：328-332.

[17]何春梅，何盈，羅濤，等. 施肥方法對(duì)百合生長(zhǎng)影響的研究[J]. 北方園藝，2006（4）：120-122.

[18]李浚明. 植物組織培養(yǎng)教程[M]. 北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000.

[19]張惠華，崔玥晗，李丹，等. 東方百合組培條件優(yōu)化技術(shù)研究[J]. 中國(guó)園藝文摘，2010（9）：28-29.

[20]龐新霞，岑秀芬，陳國(guó)建，等. 不同激素組合對(duì)東方百合鱗莖組培芽增殖的影響[J]. 廣西園藝，2008，19（2）：3-5，14.

[21]藍(lán)炎陽，吳士彬，陳志言，等. 東方百合組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀[J]. 福建熱作科技，2012，37（2）：45-47.

[22]Han B H，Yu H J，Ye B W，et al. In vitro micropropagation of Lilium longiflorum ‘Georgia by shoot formation as influenced by addition of liquid medium[J]. Scientia Horticulturae，2004，103（1）：39-49.

[23]羅鳳霞，徐桂華，金麗麗，等. 新鐵炮百合微繁的研究[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31（3）：254-257.

[24]袁芳亭，陳龍清. 麝香百合的葉片離體培養(yǎng)及植株再生[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（3）：50-51.

[25]袁雪，鐘雄輝，李曉昕，等. 鐵炮百合的胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，26（3）：454-460，477.