細胞自噬與人卵巢癌細胞對順鉑耐藥的關(guān)系

朱星枚++++++吳琳++++++張媛++++++姚楊++++++成碧萍++++++張丹

[摘要] 目的 探討細胞自噬與人卵巢癌細胞對順鉑耐藥的關(guān)系。 方法 以不同濃度的順鉑（0、1、2、4、8、16 μg/mL）分別作用人卵巢癌細胞A2780及其順鉑耐藥株A2780/DDP 48 h，采用MTT法檢測卵巢癌細胞的增殖率，透射電鏡檢測順鉑誘導細胞自噬體的形成，Western blot法測定自噬和凋亡相關(guān)蛋白。 結(jié)果 與A2780對照比較，A2780/DDP增殖率明顯升高（P < 0.01）；順鉑可以誘導A2780及A2780/DDP中自噬體的形成，且A2780和A2780/DDP中LC3-Ⅱ水平均升高，這種作用可以被自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）阻斷；順鉑可以誘導A2780中凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP水平升高，但作用A2780/DDP時影響不大，當3-MA與順鉑同時作用人卵巢癌細胞時，A2780/DDP中的Cleaved-PARP表達水平顯著升高（P < 0.01）。 結(jié)論 卵巢癌細胞的耐藥可能與順鉑誘導卵巢癌細胞自噬有關(guān)，自噬抑制劑3-MA可以抑制順鉑誘導的細胞自噬，同時促進順鉑誘導人卵巢癌細胞凋亡，且增加順鉑耐藥株對順鉑的敏感性。

[關(guān)鍵詞] 順鉑；耐藥；卵巢癌；增殖；細胞自噬；凋亡

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）09（a）-0012-05

[Abstract] Objective To study the relationship between cell autophagy and Cisplatin resistance in the ovarian cancer cells. Methods Cell proliferation was determined by an MTT assay after A2780 and A2780/DDP cells were treated by Cisplatin at different concentrations （0， 1， 2， 4， 8， 16 μg/mL） for 48 h， the formation of autophagosomes were detected by transmission electron microscopy， both autophagy and apoptosis related protein expression were determined by Western blot. Results Compared with the control of A2780， A2780/DDP proliferation rate was significantly increased （P < 0.01）； Autophagy， characterized by an increase in the number of autophagosomes and LC3-II protein level， was observed in Cisplatin-treated A2780 and Cisplatin-treated A2780/DDP cells， which could be blocked by autophagy inhibitor 3-methyl adenine （3-MA）； Cleaved-PARP protein level was increased in Cisplatin-treated A2780 cells while almost no effect in Cisplatin-treated A2780/DDP cells， however， Cleaved-PARP protein level was significantly increased in Cisplatin and 3-MA-treated A2780/DDP cells （P < 0.01）. Conclusion Resistance of ovarian cancer cells may be associated with autophagy induced by Cisplatin， autophagy inhibitor 3-MA can inhibite autophagy， but promote apoptosis induced by Cisplatin in ovarian cancer cells， and increase the Cisplatin sensitivity to Cisplatin resistant strains.

[Key words] Cisplatin； Resistance； Ovarian Cancer； Proliferation； Autophagy； Apoptosis

卵巢癌是一種常見的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅著婦女生命[1]。臨床上常用順鉑治療卵巢癌，反應率可達70%～80%[2-3]。然而，大多數(shù)開始對順鉑敏感的卵巢癌患者服藥不久后便出現(xiàn)了復發(fā)、耐藥[4]，嚴重限制了順鉑的應用。研究表明[5-6]，自噬與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，調(diào)節(jié)自噬可以克服包括順鉑耐藥的腫瘤的化療耐藥。最近研究表明[7]，順鉑激活細胞自噬通路，這種作用可以抵消順鉑誘導的腫瘤細胞死亡。自噬激活導致肺癌對順鉑耐藥已經(jīng)得到證實[8-9]，然而自噬在腫瘤治療中的準確作用與組織類型和化療藥物類型有關(guān)[10-11]，自噬與順鉑治療卵巢癌及其對順鉑耐藥的關(guān)系尚不明確，因此有必要針對卵巢癌尋找特殊的自噬調(diào)控方法。本實驗擬考察順鉑對人卵巢癌細胞A2780及其順鉑耐藥株A2780/DDP的自噬和凋亡作用，并借助自噬抑制劑研究細胞自噬與卵巢癌細胞對順鉑耐藥的關(guān)系，為自噬作為克服順鉑耐藥性的新靶點添加新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

實驗所用人卵巢癌細胞順鉑敏感株A2780及順鉑耐藥株A2780/DDP購于中科院上海細胞庫。順鉑（10 mg，齊魯制藥廠）；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、巴弗洛霉素A1（Baf A1）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）均購自Sigma公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自北京四季青生物科技有限責任公司。單克隆抗體（PARP、LC3）購自美國Cell Signaling公司；單克隆抗體β-actin、羊抗兔IgG-HRP標記二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。CO2培養(yǎng)箱（3110水套系列，美國，Thermo Scientific公司），多功能酶標儀（Infinite？誖F500，瑞士，Tecan公司），垂直電泳系統(tǒng)（Powerpac通用，美國，Bio-Rad公司），電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（170-4070，美國，Bio-Rad公司），透射電子顯微鏡（JEM-1230，日本，日本電子株式會社），Odyssey紅外成像系統(tǒng)（Odyssey？誖CLx，美國，LI-COR公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 人卵巢癌A2780細胞株和A2780/DDP細胞株均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為維持A2780/DDP細胞株的耐藥性，細胞傳代時采用含順鉑的培養(yǎng)基[順鉑濃度1 μg/mL）培養(yǎng)。光學顯微鏡下觀察細胞生長狀況，每2～3天換液1次，待細胞貼壁70%～80%時，進行傳代。設(shè)空白對照組（0 μg/mL）和藥物組[順鉑（5 μg/mL），3-MA（1 mmol/L），3-MA（1 mmol/L）&順鉑（5 μg/mL），Baf A1（2 nmol/L），Baf A1（2 nmol/L）&順鉑（5 μg/mL）]。

1.2.2 MTT法檢測順鉑作用下卵巢癌細胞的增殖率 取對數(shù)生長期細胞A2780和A2780/DDP分別接種于96孔板中（8×103/孔），次日待貼壁后加入不同濃度的順鉑培養(yǎng)液（0、1、2、4、8、16 μg/mL）。作用48 h后，棄去上清液，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），37℃、5%CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液。每孔加入150 μL DMSO，振搖10 min后將96孔板置于Infinite？誖F500多功能酶標儀中于490 nm處測定各孔光密度值，并根據(jù)公式計算順鉑作用下的細胞相對增殖率：細胞相對增殖率 = （OD加藥組 - OD空白組）/（OD對照組 - OD空白組）×100%。

1.2.3 透射電鏡檢測順鉑誘導的細胞自噬 JEM-1230透射電鏡觀測自噬小體形成是細胞發(fā)生自噬的金標準。取對數(shù)生長期的細胞A2780和A2780/DDP，常規(guī)消化離心，傳代（細胞密度為1×107/瓶）。細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液，然后換為含5 μg/mL順鉑的培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，常規(guī)消化，1500 r/min離心15 min，收集細胞沉淀，棄上清，加入2%戊二醛固定，0～4℃下固定過夜。送樣檢測。

1.2.4 Western blot法檢測順鉑誘導的自噬蛋白與凋亡蛋白的表達 收集各組細胞，離心棄去上清液，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液100 μL，冰上裂解后于4℃，12 000 r/min離心20 min。配制不同濃度的BSA標準液繪制蛋白標準曲線，并對蛋白樣品進行定量。采用12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行蛋白分離，通過濕法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，5%去脂奶粉室溫封閉1 h，加入TBST潤洗3次，加入一抗（LC3，PARP）4℃過夜后，TBST潤洗3次后加入二抗（1︰20 000），室溫下振搖孵育1 h，TBST潤洗3次后，Odyssey？誖CLx掃膜儀掃膜。以β-actin為內(nèi)參，計算各蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑對人卵巢癌細胞A2780及其耐藥株A2780/DDP增殖的作用

順鉑抑制人卵巢癌細胞A2780及其耐藥株A2780/DDP增殖，且這種抑制作用具有濃度依賴性。根據(jù)GraphPad Prism 5軟件計算不同濃度順鉑（0～16 μg/mL）作用人卵巢癌細胞（A2780和A2780/DDP）48 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）。順鉑敏感細胞株A2780的IC50 A2780=2.52 μg/mL，順鉑耐藥細胞株A2780/DDP的IC50 A2780/DDP=13.61 μg/mL，故順鉑耐藥細胞相對敏感細胞的耐藥系數(shù)RI=IC50 A2780/DDP/IC50 A2780=5.4，提示A2780/DDP較A2780對順鉑不敏感。見圖1。

2.2 順鉑誘導人卵巢癌細胞A2780及其耐藥株A2780/DDP自噬

5 μg/mL順鉑作用人卵巢癌細胞A2780及其耐藥株A2780/DDP 24 h后，通過透射電鏡觀察分析，人卵巢癌細胞A2780及其耐藥株A2780/DDP中均出現(xiàn)自噬小體，但是在耐藥株A2780/DDP中的自噬小體數(shù)目明顯多于敏感株A2780，且在空白對照中發(fā)現(xiàn)，順鉑耐藥株A2780/DDP中的自噬小體數(shù)目遠多于A2780空白對照中的自噬小體數(shù)目（圖2A）。Western blot實驗結(jié)果顯示，順鉑作用細胞后，敏感株A2780和耐藥株A2780/DDP中LC3-Ⅱ水平均升高，且相對敏感株A2780，耐藥株A2780/DDP中LC3-Ⅱ呈現(xiàn)高表達（圖2B）。進一步提示卵巢癌細胞的耐藥可能與細胞自噬有關(guān)。

2.3 自噬抑制劑對順鉑誘導自噬蛋白LC3-Ⅱ表達的影響

為明確順鉑對耐藥株A2780/DDP中自噬的誘導作用，應用溶酶體抑制劑Baf A1，阻斷自噬體和溶酶體的結(jié)合，通過Western blot法檢測LC3-Ⅱ的水平，分析A2780/DDP中的自噬流。Western blot結(jié)果顯示，Baf A1處理A2780/DDP后，經(jīng)順鉑處理的較未經(jīng)順鉑處理的A2780/DDP中LC3-Ⅱ表達明顯增加（P < 0.01）（圖3A），提示順鉑可以誘導A2780/DDP中自噬體的形成。為進一步驗證順鉑誘導的自噬是否可以被自噬抑制劑3-MA阻斷，實驗嘗試順鉑（5 μg/mL）作用人卵巢癌順鉑敏感細胞A2780 24 h，比較同時加入3-MA（1 mmol/L）或不加3-MA，細胞中LC3-Ⅱ水平的變化。Western blot結(jié)果顯示，順鉑與3-MA同時作用卵巢癌細胞株后，細胞中LC3-Ⅱ水平大大降低（P < 0.01）（圖3B），提示3-MA可以抑制順鉑誘導的卵巢癌細胞中的自噬。

2.4 自噬抑制劑對順鉑誘導A2780和A2780/DDP中凋亡蛋白Cleaved-PARP表達的影響及3-MA和順鉑對A2780/DDP增殖的影響

順鉑誘導人卵巢癌細胞敏感株A2780凋亡，3-MA同時作用時，其對耐藥株A2780/DDP的凋亡誘導能力明顯增加，同時使A2780/DDP對順鉑敏感性增加。Western blot檢測結(jié)果顯示，順鉑可以誘導人卵巢癌順鉑敏感株A2780中Cleaved-PARP水平升高，但對其耐藥株A2780/DDP作用時影響不大（圖4A）。然而，當3-MA與順鉑同時作用人卵巢癌細胞時（圖4B），耐藥株A2780/DDP中的Cleaved-PARP表達水平顯著升高（P < 0.01），同時耐藥株細胞增殖力受到順鉑明顯抑制（圖5）。提示自噬抑制劑3-MA可以促進順鉑誘導人卵巢癌細胞凋亡，且增加順鉑耐藥株對順鉑的敏感性。

3 討論

順鉑及其鉑類抗腫瘤藥物是治療卵巢癌的一線化療藥物，但是大多數(shù)卵巢癌患者最終都會出現(xiàn)順鉑耐藥而導致腫瘤復發(fā)，因此解決順鉑的耐藥問題是臨床治療卵巢癌的關(guān)鍵點。最近幾十年的研究中，自噬在卵巢癌中的作用引起越來越多的關(guān)注[12-13]。自噬不僅在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，在腫瘤的藥物治療中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14-15]。Liu等[16]研究表明自噬激活劑（雷帕霉素聯(lián)合三氧化二砷）可以抑制卵巢癌細胞增殖；有研究發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可以增加卵巢癌細胞的敏感性[17-18]。

本研究結(jié)果顯示，順鉑作用卵巢癌細胞后，順鉑敏感株及耐藥株中自噬體增加，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ水平升高，為進一步證實LC3-Ⅱ升高的同時伴隨順鉑誘導人卵巢癌細胞A2780，A2780/DDP發(fā)生自噬的過程，實驗分別使用溶酶體抑制劑Baf A1和自噬抑制劑3-MA抑制順鉑耐藥株A2780/DDP中自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體或抑制自噬體的形成。結(jié)果顯示Baf A1與順鉑同時作用時，卵巢癌細胞株中自噬體的堆積程度加大，即順鉑可以誘導卵巢癌細胞A2780及其耐藥株A2780/DDP發(fā)生自噬，同時這種作用可以被3-MA阻斷。

大量文獻表明自噬可以促進腫瘤生長[19-20]，本實驗中發(fā)現(xiàn)，A2780/DDP中自噬體明顯增多，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達水平較順鉑敏感株A2780顯著升高。但是順鉑對其誘導凋亡能力較弱，表現(xiàn)為順鉑單獨作用A2780/DDP時，凋亡蛋白PARP幾乎不裂解，PARP是細胞凋亡核心成員半胱天冬酶（caspase）的切割底物，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。當自噬抑制劑3-MA阻斷順鉑誘導自噬后，順鉑誘導A2780/DDP凋亡的能力顯著提高，且A2780/DDP對順鉑的敏感性增加。因此，順鉑作用A2780/DDP時，自噬與凋亡是兩種相互拮抗的通路，同時調(diào)節(jié)著卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。其中自噬是促進卵巢癌細胞耐藥的因素，而且可以削弱順鉑對卵巢癌耐藥細胞的殺傷力。

卵巢癌的順鉑耐藥性是臨床亟待解決的問題，體外實驗結(jié)果表明抑制細胞自噬可以增加卵巢癌順鉑耐藥株A2780/DDP對順鉑的敏感性。因此，以細胞自噬作為治療卵巢癌復發(fā)與耐藥的靶點可以為克服卵巢癌順鉑耐藥帶來新的希望。

[參考文獻]

[1] Siegel RL，Miller KD，Jemal A. Cancer statistics，2015 [J]. CA：a Cancer Journal for Clinicians，2015，65（1）：5-29.

[2] Kim A，Ueda Y，Naka T，et al. Therapeutic strategies in epithelial ovarian cancer [J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，2012，31（1）：1.

[3] Tummala M，McGuire W. Recurrent ovarian cancer [J]. Clinical Advances in Hematology & Oncology：H&O，2005， 3（9）：723-736.

[4] Agarwal R，Kaye SB. Ovarian cancer：strategies for overcoming resistance to chemotherapy [J]. Nature Reviews Cancer，2003， 3（7）：502-516.

[5] Duffy A，Le J，ausville E，et al. Autophagy modulation：a target for cancer treatment development[J].Cancer Chemotherapy and Pharmacology，2015，75（3）：439-447.

[6] Maycotte P，Thorburn A. Autophagy and cancer therapy [J]. Cancer Biology & Therapy，2011，11（2）：127-137.

[7] ODonovan TR，OSullivan GC，McKenna SL. Induction of autophagy by drug-resistant esophageal cancer cells promotes their survival and recovery following treatment with chemotherapeutics [J]. Autophagy，2011，7（5）：509-524.

[8] Ren JH，He WS，Nong L，et al. Acquired Cisplatin resistance in human lung adenocarcinoma cells is associated with enhanced autophagy[J].Cancer Biotherapy and Radiopharma？鄄ceuticals，2010，25（1）：75-80.

[9] Sirichanchuen B，Pengsuparp T，Chanvorachote P. Long-term Cisplatin exposure impairs autophagy and causes Cisplatin resistance in human lung cancer cells [J]. Molecular and Cellular Biochemistry，2012，364（1-2）：11-18.

[10] Le XF，Mao W，Lu Z，et al. Dasatinib induces autophagic cell death in human ovarian cancer [J]. Cancer，2010， 116（21）：4980-4990.

[11] Bast R. Molecular approaches to personalizing management of ovarian cancer [J]. Annals of Oncology，2011， 22（Suppl 8）：viii5-viii15.

[12] 宋麗萍，李翠蘭，王子介，等.自噬與卵巢癌研究進展[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2015，9（3）：464-467.

[13] 沈曉燕，王建六.卵巢癌中的自噬[J].中國婦產(chǎn)科臨床雜志，2015，16（5）：466-468.

[14] Mathew R，Kongara S，Beaudoin B，et al. Autophagy suppresses tumor progression by limiting chromosomal instability [J]. Genes & Development，2007，21（11）：1367-1381.

[15] Jin S，White E. Role of autophagy in cancer：management of metabolic stress [J]. Autophagy，2007，3（1）：28-31.

[16] Liu N，Tai S，Ding B，et al. Arsenic trioxide synergizes with everolimus（Rad001） to induce cytotoxicity of ovarian cancer cells through increased autophagy and apoptosis [J]. Endocrine-related Cancer，2012，19（5）：711-723.

[17] Zhang N，Qi Y，Wadham C，et al. FTY720 induces necrotic cell death and autophagy in ovarian cancer cells：a protective role of autophagy [J]. Autophagy，2010，6（8）：1157-1167.

[18] Wang J，Wu GS. Role of autophagy in Cisplatin resistance in ovarian cancer cells [J]. Journal of Biological Chemistry，2014，289（24）：17163-17173.

[19] Scarlatti F，Maffei R，Beau I，et al. Role of non-canonical Beclin 1-independent autophagy in cell death induced by resveratrol in human breast cancer cells [J]. Cell Death & Differentiation，2008，15（8）：1318-1329.

[20] Denton D，Nicolson S，Kumar S. Cell death by autophagy：facts and apparent artefacts [J]. Cell Death & Differentiation，2012，19（1）：87-95.