勿忘我組培快繁技術(shù)的優(yōu)化

曹君邁+彭亞齊+唐世明+陳淑媛+王彤彤+陳星

摘要：以藍色勿忘我種子為材料，發(fā)芽后取其幼苗莖尖、葉片和下胚軸為外植體，進行勿忘我組培快繁技術(shù)的優(yōu)化試驗。通過研究外植體、接種方式、培養(yǎng)基配方、光質(zhì)對勿忘我不定芽形成、增殖、生根的影響，優(yōu)化篩選出適宜勿忘我組培的最佳外植體為莖尖，其誘導率最高達69.32%，其次為子葉，其誘導率為18.06%；適宜莖尖誘導分化的培養(yǎng)基為MS+0.9 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，誘導率最高達83.33%；適宜子葉誘導分化的培養(yǎng)基為 MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，誘導率最高達20.83%；適宜增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS（不加肌醇，將維生素B1提高到1 mg/L）+0.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT，增殖系數(shù)為16.5；適宜生根的培養(yǎng)基為1/2MS+0.4 mg/L NAA，采用溫差培養(yǎng)法，生根率提高到90%。適宜勿忘我增殖培養(yǎng)的光質(zhì)為紅光，之后轉(zhuǎn)入白光進行培養(yǎng)。本試驗的結(jié)果可為勿忘我組培快繁技術(shù)的應用提供一定的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：勿忘我；外植體；增殖；生根；光質(zhì)

中圖分類號： S682.390.4+3文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0077-04

勿忘我（Limonium sinuatum）屬補血草屬植物，全世界植物資源有300種，我國有十七八種[1]，主要分布于西北、東北和華北，即新疆、甘肅、內(nèi)蒙古和寧夏等省。補血草屬多為耐鹽抗旱的旱生植物，是我國優(yōu)良的野生植物資源，具有很高的觀賞價值、極高的藥用價值；而其花多、花期長、泌蜜豐富，是重要的夏秋季蜜源植物；由于其耐鹽、抗寒、抗旱性強、節(jié)水顯著等特性，在防風固沙、生態(tài)恢復中具有重要的應用價值[2]。隨著人們對環(huán)境美化的需求和保健意識的增強，市場需求量快速發(fā)展，利用組培快繁技術(shù)，提高組培苗的增殖率及有效苗的數(shù)量和質(zhì)量，解決市場需求，達到資源利用和保護的協(xié)調(diào)發(fā)展。

勿忘我是補血草中的一種，它具有大量的不孕枝和同型雜交不孕的特點，種子結(jié)實少，限制了它的規(guī)模化生產(chǎn)的發(fā)展[3]，此外，成本過高也是影響規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的又一因素。有關(guān)勿忘我組織培養(yǎng)國內(nèi)外已有許多報道[4-9]，近年來勿忘我采用組培快繁技術(shù)，不僅繁殖系數(shù)高，還可有效去除病毒，以確保遺傳性狀的穩(wěn)定性和切花質(zhì)量的改善。在勿忘我組培快繁的研究中，有許多關(guān)于誘導[10]、增殖[11]、生根及煉苗[12-13]的研究報道，通過大量試驗，究者們已經(jīng)篩選出一些適宜的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。在兼顧增殖率與組培苗質(zhì)量的前提下，正在努力使勿忘我組培苗快速產(chǎn)業(yè)化，以滿足市場的需求。本試驗在確保組培苗增殖率和質(zhì)量的前提下，以降低成本和加快繁殖速度為目標，研究組培快繁過程中各環(huán)節(jié)的關(guān)鍵影響因子，建立高效實用的勿忘我組培快繁技術(shù)體系，以期為產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗材料

藍色勿忘我種子網(wǎng)購于浙江永康無市花之谷貿(mào)易有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1培養(yǎng)基配方試驗培養(yǎng)基配方詳見表1。

1.2.2光質(zhì)條件試驗光質(zhì)條件詳見表2。

1.2.3試驗設(shè)計方法在誘導分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)階段，針對各階段的特點，分別對外植體、培養(yǎng)基配方采用單因素隨機區(qū)組設(shè)計；在增殖培養(yǎng)條件的篩選中，采用單因素設(shè)計研究7種光質(zhì)因子的影響。每個處理接種8瓶，每瓶內(nèi)接入4個外植體。在試驗過程中，對出愈率、誘導分化率、玻璃化率、增殖系數(shù)、生根率、葉片數(shù)、葉綠素含量等指標進行統(tǒng)計，記載時隨機抽取2瓶，求其平均值作為1次重復，共重復3次，并對試驗結(jié)果采用單因素統(tǒng)計學方法分析。

1.2.4材料的處理采用陳淑媛等的方法[6]進行。

1.2.5種子的萌發(fā)將消毒滅菌后的種子接種到MS+3%蔗糖+7%瓊脂培養(yǎng)基上后，放置于黑暗處，（25±2） ℃溫度下，待發(fā)芽長出具有2張子葉的幼苗后置于光照下培養(yǎng)，子葉變綠后進行起始培養(yǎng)。統(tǒng)計每瓶MS培養(yǎng)基內(nèi)接入的種子數(shù)和發(fā)芽種子數(shù)，計算其發(fā)芽率。

1.2.6誘導分化培養(yǎng)在超凈工作臺上，按無菌操作技術(shù)要求分別切取勿忘我的下胚軸（長0.5 cm）、莖尖（長0.5～1.0 cm）、子葉作為外植體，3種外植體均接種到起始培養(yǎng)基A1～A5號上。下胚軸與莖尖的形態(tài)學下端插入培養(yǎng)基；子葉均勻劃3刀，分正反（光照面朝上為正放，朝下為反放）接種于培養(yǎng)基內(nèi)。

1.2.7增殖培養(yǎng)在超凈工作臺上，按無菌操作技術(shù)要求，切取同一種培養(yǎng)基中長勢相似的勿忘我?guī)а坑酌缜o尖（長 0.5～1.0 cm） 為外植體， 接種于增殖培養(yǎng)基B1～B5號上進

1.2.8生根培養(yǎng)在超凈工作臺上，按無菌操作技術(shù)要求，取同一種培養(yǎng)基中大小相似、具3～5張葉的、高大于2.0 cm的無根苗，分成單株接種于生根培養(yǎng)基C1～C5號中，采用變溫培養(yǎng)法培養(yǎng)。

1.2.9光質(zhì)對勿忘我組培苗增殖的影響在超凈工作臺上，按無菌操作技術(shù)要求，切取同一種培養(yǎng)基中長勢相似的勿忘我?guī)а坑酌缜o尖（長0.5～1.0 cm）為外植體，接種于增殖培養(yǎng)基B2號（MS+0.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT）上進行叢生芽誘導的培養(yǎng)。

1.2.10葉綠素含量的測定離體法萃取葉綠素及分光光度計法測定步驟：取適量新鮮葉片→吸水紙擦干凈→去主脈→剪成小于1 mm2的小塊，混勻→稱取0.2 g至研缽中→加入 5 mL 95%乙醇、少量碳酸鈣粉末，研磨至葉片組織變白→靜置3～5 min→過濾至燒杯中→定容至25 mL容量瓶中→652 nm 下測D值，95%乙醇調(diào)零。

葉綠素總含量（mg/g）=（D652 nm×V）/（34.5×m）。

式中：V為提取液總量，mL，如果比色前進行稀釋，則應乘以稀釋倍數(shù)；m為稱取葉片質(zhì)量，g。

1.3培養(yǎng)條件

誘導分化培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)置于PGX-1000B型光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，溫度為（25±2） ℃。5 d后，設(shè)置光照度為 2 500 lx，光照時間為12 h/d，溫度為（25±2） ℃進行光照培養(yǎng)。生根培養(yǎng)置于光照培養(yǎng)箱中，光照度為2 500 lx，光照時間為12 h/d，光照下溫度為（28±2） ℃，黑暗下溫度為（22±2） ℃。光質(zhì)試驗置于7種不同光質(zhì)處理下培養(yǎng)，光照度為 2 500 lx，光照時間為12 h/d，溫度為（25±2） ℃。

1.4指標記錄

7 d后，每天觀察記錄每種培養(yǎng)基內(nèi)組培苗的生長狀況，30 d后調(diào)查其愈傷組織數(shù)、玻璃化苗數(shù)和正常小苗數(shù)、增殖芽數(shù)、生根數(shù)。

在光質(zhì)試驗中，于30 d后調(diào)查其增殖數(shù)、葉片數(shù)、莖長，測定葉綠素的含量，計算其增殖系數(shù)、平均葉片數(shù)、平均莖長、葉綠素含量。

2結(jié)果與分析

2.1種子萌發(fā)的調(diào)查

接入種子總數(shù)為199粒，發(fā)芽總數(shù)為128粒，發(fā)芽率為64.32%。勿忘我種子滅菌后影響了發(fā)芽率，可適當縮短 NaClO 滅菌的時間。

2.2誘導分化培養(yǎng)的研究

2.2.1外植體對不定芽形成的影響從表3可以看出，不同外植體間，不定芽的形成存在顯著差異，莖尖的出愈率、玻璃化率和誘導分化率均顯著高于子葉和下胚軸；子葉顯著高于下胚軸。由此可見，外植體誘導不定芽能力從大到小為莖尖>子葉>下胚軸。

2.2.2不同培養(yǎng)基配方對莖尖不定芽誘導的影響接種后莖尖下端開始膨大，繼而出現(xiàn)淺綠色顆粒狀突起， 約3周后，2.2.3不同培養(yǎng)基配方對子葉不定芽誘導的影響子葉接種到培養(yǎng)基上后，傷口處膨大形成愈傷組織，形成少量不定芽。對表5數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，培養(yǎng)基間對莖尖的出愈率、玻璃化率、誘導率的影響達到顯著水平。其中，A5的出愈率顯著高于A1、A2、A3和A4；A1、A2的出愈率顯著高于A3、A4。A4的玻璃化率顯著低于A1、A2、A3和A5；A3的玻璃化率顯著低于A1、A2和A5；A1、A2的玻璃化率顯著低于A5。A5的誘導率顯著高于A1、A2、A3和A4；A2、A3的誘導率顯著高于A1和A4；A1的誘導率顯著高于A4。A5培養(yǎng)基的出愈率和誘導率雖然在所有培養(yǎng)基中最高，但其玻璃化率也最高，對后期的繁殖生長不利。綜合考慮，A2培養(yǎng)基的效果最好，出愈率和誘導率適中，玻璃化率低。所以在子葉不定芽的誘導中，篩選的最佳誘導分化培養(yǎng)基為A2，即MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

2.2.5不同培養(yǎng)基配方對下胚軸不定芽誘導的影響下胚軸在不定芽誘導過程中，雖然下端膨大，但沒有產(chǎn)生愈傷組織，隨著時間的推移發(fā)生褐化而死，最終僅有極少數(shù)不定芽產(chǎn)生。通過對表7數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析得出，不同培養(yǎng)基配方對下胚軸不定芽誘導的影響顯著。5個處理間的出愈率、玻璃化率差異不顯著，而誘導率差異顯著。A1、A5的誘導率顯著高于A3、A4；A1、A2、A5之間的誘導率差異不顯著；A2、A3、A4之間的誘導率差異不顯著。綜合來看，A2的誘導率適中，而其成本低于A3、A4培養(yǎng)基，所以篩選的最佳誘導分化培養(yǎng)基為A2，即MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

3結(jié)論與討論

3.1討論

本試驗是在實驗室前期研究的基礎(chǔ)上[6]，針對試驗方法和培養(yǎng)條件進一步深入研究探索，優(yōu)化勿忘我組培快繁技術(shù)條件。前期研究中只采用莖尖誘導分化，而本次試驗在誘導分化培養(yǎng)階段也利用子葉和下胚軸進行不定芽的誘導，這增加了快繁誘導途徑。結(jié)果表明，莖尖為誘導分化培養(yǎng)的最優(yōu)外植體，這與王淑敏的試驗結(jié)果[12]相符，但其誘導分化培養(yǎng)成分相同，但6-BA激素用量降低了0.1 mg/L。

本試驗在研究子葉誘導不定芽過程中，研究正面反面放置2種接種方式對子葉不定芽誘導的影響，這是前人還沒有研究過的。

本試驗在增殖階段對培養(yǎng)基進行改良，篩選出的最優(yōu)增殖培養(yǎng)基大量元素減半、不加肌醇，且將維生素B1提高到 1 mg/L，增殖系數(shù)較陳淑媛等的[6]高，這與朱至清的研究結(jié)果[14]相吻合。與馮曉英的增殖培養(yǎng)研究[15]比，篩選的增殖培養(yǎng)基減少了營養(yǎng)成分，降低了生產(chǎn)成本，有利于組培工廠化生產(chǎn)的節(jié)體增效。

而在生根培養(yǎng)階段，使用的生根培養(yǎng)基與陳淑媛等的[6]一樣，但是利用溫差培養(yǎng)法生根率提高了10%。這可能是因為在變溫培養(yǎng)中，白天積累有機物，晚上減少有機物的消耗，使得勿忘我組培苗的有機物得以積累得更多，從而根粗苗壯。因此，可以在勿忘我組培快繁生根過程中將恒溫培養(yǎng)法改為變溫培養(yǎng)法。

在組織培養(yǎng)的微環(huán)境中，光是一個重要的因素，前人已經(jīng)研究了光照時間、光照度對勿忘我組培苗生長的影響[16]。而光質(zhì)對勿忘我增殖的影響目前還沒有人研究，本試驗中紅光有利于勿忘我組培苗的增殖，再轉(zhuǎn)入白光下培養(yǎng)進行壯苗，更有利于組培苗的生長。

而組培過程中的三大問題之一的玻璃苗，在本試驗中也有出現(xiàn)。今后可以在預防和解決玻璃苗出現(xiàn)這一方面加大研究，以提高勿忘我組培苗的質(zhì)量，為勿忘我的組培工廠化生產(chǎn)增產(chǎn)增效。

3.2結(jié)論

不定芽誘導過程中，外植體的篩選至關(guān)重要。勿忘我出芽情況以莖尖誘導率最高，而下胚軸和子葉則只能誘導少量不定芽。其誘導不定芽能力從大到小為莖尖>子葉>下胚軸。因此，誘導不定芽最佳的外植體為莖尖。

勿忘我莖尖不定芽的誘導培養(yǎng)階段，在蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、pH值為 5.8～6.0條件下，篩選出的最佳誘導分化培養(yǎng)基為MS+0.9 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

在勿忘我子葉誘導不定芽的培養(yǎng)中，子葉正面放置有利于誘導不定芽，在蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、pH值為5.8～6.0條件下，篩選的最佳誘導分化培養(yǎng)基為MS+0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。

在勿忘我組培苗增殖過程中，以莖尖為外植體，在蔗糖30 g/L、瓊脂7 g/L、pH值為5.8～6.0條件下，篩選出的最佳增殖培養(yǎng)基為1/2MS（不加肌醇，將維生素B1提高到 1 mg/L）+0.4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。在蔗糖 15 g/L、瓊脂7 g/L、pH值為 5.8～6.0、變溫培養(yǎng)條件下，篩選的最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.4 mg/L NAA。

適宜勿忘我增殖培養(yǎng)的光質(zhì)條件為紅光。因此，可以先將勿忘我組培苗置于紅光條件下進行增殖培養(yǎng)，之后再轉(zhuǎn)入白光條件下進行正常培養(yǎng)，促進壯苗，且能提高勿忘我組培苗的增殖系數(shù)。

參考文獻：

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會. 中國植物志：第六十卷第一分冊[M]. 北京：科學出版社，1987.

〖FQ（17。54，ZX，DY-W〗[KH*4D]

[2]田福平，時永杰，陳子萱. 我國補血草屬野生植物資源的分布及研究現(xiàn)狀[J]. 草業(yè)與畜牧，2010（3）：49-52.

[3]劉媖心，楊喜林，姚育英. 中國沙漠植物志[M]. 北京：科學出版社，1992：15-27.

[4]王家福，齊永鑫. “勿忘我”的組織培養(yǎng)研究[J]. 中國農(nóng)學通報，2005，21（6）：102-106.

[5]陸玲麗，李枝林，姜勤，等. 勿忘我組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報，2009，21（6）：40-42.

[6]陳淑媛，曹君邁，陳星，等. 勿忘我組織培養(yǎng)繁殖技術(shù)的研究[J]. 種子，2015（2）：115-120.

[7]Seelye J F，Maddocks D J，Burge G K，et al. Shoot regeneration from leaf discs of Limonium perigrinum using thidiazuron[J]. New Zealand Journal of Crop and Borticultural Science，1994，22（1）：23-29.

[8]Huang C L，Hsieh M T，Hsieh W C，et al. In vitro propagation of Limonium wrightii （Hance） Ktze. （Plumbaginaceae），an ethnomedicinal plant，from shoot-tip，leaf-and inflorescence-node explants[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，2000，36（3）：220-224.

[9]NaiWen H，TsuHwie L，ChaoLang H，et al. The micropropagation of Limonium wrightii （Hance） O. Kuntze[J]. Journal of the Chinese Society for Horticultural Science，2000，46（3）：277-286.[ZK）]

[10]溫銀元，馮文新，尹美強，等. 不同激素對補血草器官分化的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學，2013（2）：115-118.

[11]楊春梅，孟金貴，張麗琴，等. 勿忘我組培苗增殖研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技，2009（2）：9-11.

[12]王淑敏，高永闖，李曉云. “勿忘我”叢生芽誘導及植株再生[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（31）：10842-10844.

[13]黃玉玲. 勿忘我組培苗出瓶移栽煉苗技術(shù)[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技，2012（2）：41.

[14][JP3]朱至清. 植物細胞工程[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2003：34-38.

[15]馮曉英. 勿忘我組織培養(yǎng)快速繁殖研究[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學，2002（1）：9-13.

[16]吳杰. 深波葉補血草的離體快繁與產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2005.

[FQ）]