長(zhǎng)鏈非編碼RNA-SLC52A3c在食管癌中的表達(dá)特征、功能與臨床意義

龍 琳，張家盛，雷 菲，吳健誼，潘 峰，廖連娣，許秀娥，許麗艷，李恩民

食管癌是常見(jiàn)的上消化道惡性腫瘤之一，為全球十大高發(fā)腫瘤之一。主要包括食管鱗癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)與食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)兩種病理類(lèi)型。在中國(guó)，主要以ESCC為主[1-3]。大多數(shù)ESCC患者發(fā)病早期無(wú)明顯或特異性臨床癥狀和體征，發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于中晚期，預(yù)后差，5 a生存率僅20%[4-5]。因此，迫切需要從分子水平揭示ESCC發(fā)生的分子機(jī)制，為食管癌的診斷和防治提供新的線索與策略。

核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族RFVT/SLC52成員SLC52A3是調(diào)控核黃素吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵蛋白[6]。研究表明，SLC52A3蛋白在ESCC癌組織中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，敲降SLC52A3會(huì)明顯抑制ESCC細(xì)胞的增殖能力和平板克隆形成能力；相反，高表達(dá)SLC52A3可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)癌細(xì)胞在裸鼠上成瘤能力[7]。2018年，本課題組研究發(fā)現(xiàn)，SLC52A3蛋白編碼基因編碼兩種不同的蛋白亞型：SLC52A3a和SLC52A3b，它們?cè)谑彻馨┙M織細(xì)胞中同樣異常高表達(dá)，SLC52A3a高表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，并且在細(xì)胞核高表達(dá)與食管癌患者術(shù)后生存時(shí)間縮短呈顯著正相關(guān)[8-9]。近期，又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的不編碼蛋白的亞型SLC52A3c，然而在ESCC中，此新亞型SLC52A3c對(duì)ESCC細(xì)胞功能有何影響還不明確，SLC52A3c表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后關(guān)系也不清楚。因此，本研究檢測(cè)非編碼RNA-SLC52A3c對(duì)ESCC細(xì)胞增殖和遷移能力的影響,并探討SLC52A3c表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系，期望為探究ESCC發(fā)生的分子機(jī)制，以及診斷和防治ESCC提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞系TE3、KYSE180、KYSE150和KYSE510在含10%胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640(Invitrogen)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，人食管鱗癌細(xì)胞系SHEEC和人永生化食管鱗狀上皮細(xì)胞系SHEE在含10%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，香港永生化食管鱗狀上皮細(xì)胞系[10]NE1和NE2在Defined Keratinocyte-SFM/EpiLife Medium with 60 μM Calcium(含0.5%EpiLife Defined Growth Supplement，EDGS；0.1%Defined Keratinocyte-SFM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)條件：CO2濃度5%，濕度80%，溫度37 ℃。細(xì)胞長(zhǎng)成單層后根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后進(jìn)行接種或傳代常規(guī)培養(yǎng)。各細(xì)胞詳細(xì)信息詳見(jiàn)本課題組之前發(fā)表的文章[8，11]。

1.2 3′RACE擴(kuò)增SLC52A3 cDNA 的3′末端3′RACE實(shí)驗(yàn)采用大連寶生物工程有限公司的3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(Code No. D314)試劑盒。選用TE3細(xì)胞總RNA，按3′RACE說(shuō)明書(shū)進(jìn)行3′RACE Adaptor的連接，反轉(zhuǎn)錄獲得雙鏈cDNA，再使用TaKaRa LA Taq?(Code No.DRR02AM)進(jìn)行套式PCR反應(yīng)，取5 μL的PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)3′ RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T vector載體連接，轉(zhuǎn)化到Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，取陽(yáng)性克隆菌送往華大基因公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析。3′RACE套式PCR引物見(jiàn)表1。

表1 3′RACE擴(kuò)增SLC52A3本文所使用的引物

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染根據(jù)3′RACE擴(kuò)增的序列，提交SLC52A3c全長(zhǎng)699 bp序列由金唯智公司(GENEWIZ)合成，構(gòu)建到表達(dá)載體pcDNA3.1上獲得pcDNA3.1-SLC52A3c質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，插入序列準(zhǔn)確無(wú)誤。ESCC細(xì)胞正常傳代后接種到6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞密度為70%左右。按Lipofectamine3000(Invitrogen)說(shuō)明書(shū)將質(zhì)粒與Lipo3000形成的復(fù)合物加入到6孔板中，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后更換10%新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 RNA提取與實(shí)時(shí)定量PCR食管鱗癌患者的組織以及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞選用Invitrogen的TRIzol 試劑提取總RNA。再采用大連寶生物工程有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green定量PCR試劑盒對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和定量PCR檢測(cè)。以β-actin引物作內(nèi)參對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)定量 PCR 的擴(kuò)增曲線和融解曲線，以2-△△CT方法分析基因表達(dá)相對(duì)變化。定量PCR引物見(jiàn)表1。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)細(xì)胞增殖能力檢測(cè)選用實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析(RTCA，xCELLigence Real-Time Cell Analyzer，Roche公司)[12]、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTS 3種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。ESCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒36 h后，換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)饑餓細(xì)胞12 h，再用胰酶消化、重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)細(xì)胞/mL后將細(xì)胞分別接種到RTCA E-plate和96孔板中，每孔100 μL(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，另取10 μL細(xì)胞懸液到含2 mL培養(yǎng)基的6孔板中(每孔1×103個(gè)細(xì)胞)。E-plate板中的細(xì)胞直接進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測(cè)，每15 min掃描1次；96孔板中細(xì)胞選用MTS試劑(Promega)分別檢測(cè)各組ESCC細(xì)胞在 0、12、36、60和84 h的活性細(xì)胞數(shù)量；6孔板中細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2周，當(dāng)有肉眼可見(jiàn)明顯的細(xì)胞克隆時(shí)終止培養(yǎng)，0.5%結(jié)晶紫染色后計(jì)數(shù)每孔的克隆數(shù)。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)細(xì)胞遷移能力檢測(cè)選用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell移動(dòng)實(shí)驗(yàn)兩種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。ESCC細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒36 h后，換用相應(yīng)的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)饑餓細(xì)胞12 h，再用胰酶消化、無(wú)血清重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.25×105個(gè)細(xì)胞/mL，取400 μL細(xì)胞懸液加到Transwell小室上室中，下室加入含血清的正常培養(yǎng)基，CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng) 48 h 后棄去培養(yǎng)基，取出小室，用0.5%結(jié)晶紫染液染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。對(duì)于劃痕實(shí)驗(yàn)，將上述細(xì)胞接種到6孔板中，每孔2 mL，4 h后換成含2%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別于0、24和48 h在顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.7 臨床樣本收集本研究實(shí)驗(yàn)選取了汕頭市中心醫(yī)院病理科2007年至2012年183例進(jìn)行了手術(shù)的癌患者的食管鱗癌組織，183例配對(duì)的手術(shù)切緣正常組織。所有病例的臨床資料均來(lái)自病歷記錄，根據(jù)隨訪資料，術(shù)后因其他原因死亡或有嚴(yán)重術(shù)后并發(fā)癥的病例已剔除。本研究已獲得汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)和汕頭市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析功能實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 5軟件計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，同時(shí)繪制成圖。應(yīng)用SSPS 16.0軟件對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行 Two-way ANOVA 檢驗(yàn)，確定它們之間差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)(Wilcoxon)分析SLC52A3c在食管鱗癌患者的食管鱗癌組織和手術(shù)切緣正常組織中的表達(dá)量是否有差異。然后通過(guò)Kaplan-Meier單變量生存期分析分別評(píng)估SLC52A3c的表達(dá)量與食管鱗癌患者生存和無(wú)瘤生存情況的關(guān)系。采用多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型逐步向前法評(píng)估各臨床病理參數(shù)及SLC52A3c是否可作為食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3′RACE擴(kuò)增SLC52A3-3′UTR為了確定SLC52A3基因不同亞型的3′末端，作者在SLC52A3基因第3、第4外顯子以及第1外顯子上分別設(shè)計(jì)了3′RACE引物(見(jiàn)表1)擴(kuò)增SLC52A3(見(jiàn)圖1A)，瓊脂糖電泳各得到了多個(gè)條帶，進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定后發(fā)現(xiàn)其中有亞型SLC52A3a的3′末端和新亞型SLC52A3c(圖1B)。從圖1C可以看出：① SLC52A3c-lncRNA與來(lái)自同一基因結(jié)構(gòu)框架的蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本 SLC52A3a和SLC52A3b是一種同向順式序列關(guān)系；② SLC52A3c-lncRNA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)雖與SLC52A3a相同，但其1號(hào)外顯子序列比Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)提供的序列多出115 bp，其2號(hào)外顯子序列與Ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)提供的序列相比，多出13 bp，因此其總長(zhǎng)為699 bp。SLC52A3c轉(zhuǎn)錄本的RNA信息已提交到了GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank:MN534336)。

A：3′RACE擴(kuò)增SLC52A3-3′UTR引物位置示意圖；B：3′RACE PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；C：測(cè)序結(jié)果模擬圖，SLC52A3c全長(zhǎng)699 bp。圖1 3′RACE鑒定lncRNA SLC52A3c

2.2 pcDNA3.1-SLC52A3c質(zhì)粒表達(dá)鑒定為了獲得高表達(dá)SLC52A3c的食管鱗癌細(xì)胞模型，本研究選用食管鱗癌細(xì)胞系TE3、SHEEC、KYSE510和KYSE150分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SLC52A3c質(zhì)粒，然后提取各細(xì)胞總RNA，通過(guò)定量PCR方法鑒定SLC52A3c的高表達(dá)，如圖2所示，在各個(gè)食管鱗癌細(xì)胞系中，SLC52A3c均高表達(dá)成功。

圖2 SLC52A3c在食管鱗癌細(xì)胞系中的高表達(dá)效果

2.3 高表達(dá)SLC52A3c抑制食管鱗癌細(xì)胞的分裂增殖能力實(shí)時(shí)細(xì)胞功能分析實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和MTS 3種實(shí)驗(yàn)來(lái)確認(rèn)SLC52A3c高表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響。RTCA實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A，在TE3、SHEEC和KYSE510細(xì)胞中，相對(duì)于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的對(duì)照組，高表達(dá)SLC52A3c后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線較低，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率較慢，細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3B、3C，在TE3、SHEEC和KYSE510細(xì)胞中，無(wú)論是克隆的大小還是克隆的數(shù)量相對(duì)于對(duì)照組，高表達(dá)SLC52A3c后3種食管鱗細(xì)胞生長(zhǎng)速度均較慢，克隆較小，克隆數(shù)目較少，細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。在TE3和SHEEC細(xì)胞中，用MTS實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3D，高表達(dá)SLC52A3c后細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線同樣較低，生長(zhǎng)速度較慢，食管鱗癌細(xì)胞的增殖速度明顯減弱。這些結(jié)果表明，高表達(dá)SLC52A3c可以抑制食管鱗癌細(xì)胞的分裂增殖能力。

2.4 高表達(dá)SLC52A3c抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移能力細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4A，在食管鱗癌細(xì)胞SHEEC和KYSE510中，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染SLC52A3c后劃痕“愈合”速度變慢，SHEEC細(xì)胞移動(dòng)能力顯著減弱，相同時(shí)間內(nèi)愈合范圍更小。因?yàn)镾HEEC細(xì)胞在劃痕實(shí)驗(yàn)中劃痕“愈合”速度減弱程度更顯著，在本實(shí)驗(yàn)中再選用SHEEC細(xì)胞使用Transwell移動(dòng)實(shí)驗(yàn)確證SLC52A3c高表達(dá)抑制食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果和統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4B，與對(duì)照組相比，SLC52A3c高表達(dá)組誘導(dǎo)穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在食管鱗癌細(xì)胞中SLC52A3c高表達(dá)顯著抑制癌細(xì)胞的遷移能力。

2.5 食管鱗癌細(xì)胞系和食管鱗癌組織中SLC52A3c的表達(dá)特征細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明，食管鱗癌細(xì)胞中，SLC52A3c高表達(dá)發(fā)揮抑制癌細(xì)胞分裂增殖和遷移的作用，那么，在食管鱗癌細(xì)胞系和相對(duì)正常的永生化食管鱗狀上皮細(xì)胞系以及食管鱗癌組織與手術(shù)切緣正常食管上皮組織中，SLC52A3c表達(dá)水平如何？為了解這一情況，作者采用熒光定量PCR方法檢測(cè)了5種食管鱗癌細(xì)胞和3種永生化食管上皮細(xì)胞以及183對(duì)食管鱗癌組織與手術(shù)切緣正常食管上皮組織中SLC52A3c的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示，SLC52A3c在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于永生化鱗狀食管上皮細(xì)胞，食管鱗癌組織中SLC52A3c表達(dá)水平也明顯低于手術(shù)切緣正常食管上皮組織，根據(jù)這些結(jié)果結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)，作者推測(cè)SLC52A3c可能發(fā)揮抑癌作用。

A：食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)SLC52A3c，RTCA檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化；B：食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)SLC52A3c，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力變化；C：細(xì)胞增殖能力對(duì)比；D：食管鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)SLC52A3c，MTS檢測(cè)細(xì)胞活力。圖3 高表達(dá)SLC52A3c抑制食管鱗癌細(xì)胞的分裂增殖能力

2.6 SLC52A3c高表達(dá)與食管鱗癌患者無(wú)瘤生存時(shí)間正相關(guān)接下來(lái)，作者進(jìn)一步將定量PCR結(jié)果與有完整生存狀態(tài)的183例食管鱗癌患者資料結(jié)合起來(lái)，分析SLC52A3c與患者預(yù)后的關(guān)系。選用X-tile軟件，根據(jù)SLC52A3c和病人無(wú)瘤生存狀態(tài)找到Cutoff值，即卡方最大點(diǎn)，將SLC52A3c分成兩個(gè)組(即High expression組及Low expression組)，分析分組后SLC52A3c與食管癌患者生存時(shí)間或無(wú)瘤生存時(shí)間之間的關(guān)系。Kaplan-Meier曲線法分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SLC52A3c表達(dá)水平與總生存時(shí)間未見(jiàn)顯著相關(guān)性(P>0.05)，但SLC52A3c表達(dá)水平對(duì)病人無(wú)瘤生存時(shí)間發(fā)現(xiàn)有明顯影響，相對(duì)于SLC52A3c低表達(dá)的病人，SLC52A3c高表達(dá)的病人無(wú)瘤生存時(shí)間更長(zhǎng)，且具有顯著相關(guān)性(P=0.017)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明SLC52A3c是一個(gè)保護(hù)性因子，在食管鱗癌中起抑制腫瘤的作用，SLC52A3c高表達(dá)可預(yù)警食管鱗癌患者有較好的預(yù)后。

A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)SLC52A3c后食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的變化; B：Transwell移動(dòng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)SLC52A3c后食管鱗癌細(xì)胞移動(dòng)能力的變化; C:對(duì)圖B的定量結(jié)果。圖4 高表達(dá)SLC52A3c抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移能力

2.7 SLC52A3c高表達(dá)是食管鱗癌患者無(wú)瘤生存的獨(dú)立保護(hù)因素通過(guò)對(duì)年齡、性別、飲酒、TNM分期、吸煙、腫物大小與食管鱗癌病人癌組織中SLC52A3c表達(dá)量進(jìn)行單因素及多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示TNM分期(P=0.000)和SLC52A3c(P=0.017)可以作為食管鱗癌術(shù)后患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素，SLC52A3c可作為食管鱗癌組織中獨(dú)立預(yù)后因子，SLC52A3c表達(dá)水平越高，病人的預(yù)后越好。詳見(jiàn)表2。

A：定量PCR檢測(cè)5種食管鱗癌細(xì)胞和3種永生化食管鱗狀上皮細(xì)胞中SLC52A3c的表達(dá)量；B：定量PCR檢測(cè)183對(duì)食管鱗癌組織和配對(duì)的手術(shù)切緣正常食管上皮組織中SLC52A3c的表達(dá)量。圖5 食管鱗癌細(xì)胞系和食管鱗癌組織中SLC52A3c的表達(dá)特征

A：SLC52A3c表達(dá)水平與食管鱗癌患者總生存時(shí)間的Kaplan-Meier分析；B：SLC52A3c表達(dá)水平與食管鱗癌患者無(wú)瘤生存時(shí)間的Kaplan-Meier分析。圖6 SLC52A3c表達(dá)水平與食管鱗癌患者總生存時(shí)間和無(wú)瘤生存時(shí)間的Kaplan-Meier分析

表2 SLC52A3c與食管鱗癌患者無(wú)瘤生存預(yù)后的單因素和多因素COX回歸分析

注：①P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HR：hazards ratio，風(fēng)險(xiǎn)率；CI：confidence interval，置信區(qū)間；多因素分析采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型；單因素分析采用變量作為預(yù)測(cè)指標(biāo)。

3 討論

核黃素是黃素腺嘌呤單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)的前體，在細(xì)胞能量代謝中起著至關(guān)重要的作用，其缺乏可能導(dǎo)致DNA損傷、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生[11,13-14]。SLC52A3，SLC52家族的一員，是一個(gè)非常重要的核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)者，在維持體內(nèi)核黃素動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15-16]。研究表明，SLC52A3在ESCC的發(fā)生和發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用。在食管鱗癌細(xì)胞中，SLC52A3表達(dá)敲降，抑制細(xì)胞增殖；SLC52A3a高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，SLC52A3a在細(xì)胞核高表達(dá)與食管鱗癌患者術(shù)后生存時(shí)間呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，SLC52A3b在細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)與食管鱗癌患者術(shù)后生存時(shí)間呈顯著正相關(guān)關(guān)系，檢測(cè)SLC52A3 在食管鱗癌組織細(xì)胞中表達(dá)定位可以預(yù)測(cè)食管癌患者預(yù)后[7-8]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)了SLC52A3的一個(gè)新的非編碼蛋白的lncRNA亞型，SLC52A3c，且研究發(fā)現(xiàn)SLC52A3c對(duì)于食管鱗癌細(xì)胞的功能作用與其他亞型作用相反，SLC52A3c高表達(dá)抑制食管鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移。那么，SLC52A3c與SLC52A3a和SLC52A3b的表達(dá)調(diào)控以及與食管癌發(fā)生發(fā)展之間究竟有何種聯(lián)系？分析SLC52A3基因3個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本SLC52A3a/SLC52A3b/SLC52A3c，可以知道它們來(lái)自于同一基因結(jié)構(gòu)框架，在SLC52A3 5′側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和3′端非翻譯區(qū)上，序列相互重疊，因此SLC52A3a/SLC52A3b/SLC52A3c三者間在轉(zhuǎn)錄層面或轉(zhuǎn)錄后可能存在相互作用，相互影響。有研究表明，PTEN基因的其中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄本lncRNA PTENpg1，可作為miRNA海綿捕獲靶向PTEN的miRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控PTEN的表達(dá)[17]。基于此，可以猜測(cè)，SLC52A3c也許同樣會(huì)通過(guò)捕獲miRNA來(lái)調(diào)控SLC52A3的表達(dá)，SLC52A3c作為lncRNA，很有可能與SLC52A3一起，形成自反饋調(diào)節(jié)，影響核黃素的轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝途徑，改變食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。在今后的研究中，作者擬進(jìn)一步探究三者表達(dá)過(guò)程中的相關(guān)性，深入探究SLC52A3在食管鱗癌中發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

臨床上，治療食管鱗癌的方案，主要有手術(shù)、放療和化療等。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于那些晚期，可以直接手術(shù)的食管鱗癌患者，往往是術(shù)后輔助放療或/和化療。目前，指導(dǎo)臨床食管鱗癌治療方案選擇的標(biāo)準(zhǔn)是TNM分期。與其它惡性腫瘤一樣，食管鱗癌有著很強(qiáng)的異質(zhì)性，這使得僅僅依靠TNM分期，往往并不能達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的，許多時(shí)候會(huì)出現(xiàn)治療不足，或過(guò)度治療的情況。所以，人們寄希望于尋找分子標(biāo)志物，以完善食管鱗癌患者的治療方案。以往報(bào)道的食管鱗癌以及其他癌癥的預(yù)后預(yù)警分子標(biāo)志物，主要集中在蛋白編碼基因。近年來(lái)，miRNA和lncRNA已成為新的腫瘤預(yù)后預(yù)警分子標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)。

HOTAIR是研究最廣泛的具有致癌作用的lncRNA之一，在原始乳腺癌的轉(zhuǎn)移中被發(fā)現(xiàn)。越來(lái)越多的研究表明，HOTAIR高表達(dá)使食管癌患者變差，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，總生存率變低，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[18-20]。Meta分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的HOTAIR是強(qiáng)有力的預(yù)后因子，可作為食管癌患者治療的靶標(biāo)[21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)的新lncRNA-SLC52A3c，在食管鱗癌細(xì)胞系中表達(dá)水平明顯低于永生化鱗狀食管上皮細(xì)胞，在食管鱗癌組織表達(dá)量明顯低于手術(shù)切緣正常食管上皮組織，并且SLC52A3c高表達(dá)與食管鱗癌患者無(wú)瘤生存時(shí)間正相關(guān)，是食管鱗癌患者無(wú)瘤生存的獨(dú)立的保護(hù)性因素，這些結(jié)果表明SLC52A3c的確是一個(gè)抑癌性lncRNA，在食管鱗癌中發(fā)揮保護(hù)性作用，并抑制食管鱗癌的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，SLC52A3c作為一個(gè)保護(hù)性因子，通過(guò)抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖和遷移能力，抑制食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展。在食管鱗癌的lncRNA研究中，許多l(xiāng)ncRNA，如HOTAIR、MALAT1、NEAT1、POU3F3和CCAT2均可發(fā)揮致癌作用[18,22-26]，因此SLC52A3c作為抑制性因子為食管鱗癌中l(wèi)ncRNA研究打開(kāi)新的局面。此外，SLC52A3c還可成為食管鱗癌的早期診斷、預(yù)后預(yù)警及分子分型的有效的分子標(biāo)志物。同時(shí)SLC52A3c還可能作為食管鱗癌靶向治療的分子藥靶，開(kāi)發(fā)以SLC52A3c為靶點(diǎn)的食管鱗癌的靶向藥物?？傊狙芯刻骄縎LC52A3c在ESCC發(fā)生的分子機(jī)制，為ESCC的早診和防治提供了理論依據(jù)。